袁晨翼 劉美玉 莊庭怡

(天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院中醫(yī)科,天津 300199)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是以排卵障礙、高雄激素血癥、月經(jīng)失調(diào)、胰島素抵抗以及不孕等為主要特征的內(nèi)分泌紊亂綜合征,其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確[1],其卵巢呈多囊性改變、間質(zhì)增生,在育齡婦女中發(fā)病率可達(dá)8%～13%[2],嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、生育及遠(yuǎn)期健康[1]。PCOS不孕、不良妊娠結(jié)局的概率較高[3]。西醫(yī)治療主要以短效避孕藥為主,副作用較多,復(fù)發(fā)率高。中醫(yī)學(xué)中并無PCOS的直接論述,根據(jù)其癥狀大致屬于“閉經(jīng)”“月經(jīng)后期”“崩漏”“不孕”等范疇,現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者普遍認(rèn)為腎虛是本病的主要病機(jī)[4-5]?！丁敖】抵袊?030”規(guī)劃綱要》提出應(yīng)充分發(fā)揮中醫(yī)藥獨(dú)特優(yōu)勢,并進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了要提高中醫(yī)藥服務(wù)能力,探索中醫(yī)藥在常見病中的優(yōu)勢作用。近年來,中醫(yī)藥經(jīng)典名方的研究趨于活躍。六味地黃湯作為中醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)典名方,最早記載于宋·錢乙的《小兒藥證直訣》,由金匱腎氣丸化裁而來,全方攻補(bǔ)兼施,適用于腎虛所致的多種疾病,現(xiàn)代臨床將其廣泛用于圍絕經(jīng)期綜合征、慢性腎病等的治療[6-9]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一個包含眾多成員的多功能細(xì)胞因子大家族,其通過介導(dǎo)細(xì)胞外-細(xì)胞膜-細(xì)胞內(nèi)-核內(nèi)的一系列生物信號傳遞,從而參與細(xì)胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程,尤其是TGF-β1已被證實(shí)在細(xì)胞炎癥、組織纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-13]。Smads蛋白家族是TGF-β1的下游信號分子,在將TGF-β信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起關(guān)鍵性作用[14-15]。相關(guān)研究[4]表明,TGF-β/Smads在PCOS患者中表達(dá)異常,但未形成統(tǒng)一認(rèn)識。本研究通過來曲唑造模法制作PCOS大鼠模型,觀察六味地黃湯對PCOS模型大鼠性激素水平及TGF-β/Smads 信號通路相關(guān)因子的影響,以探討六味地黃湯對PCOS大鼠的干預(yù)效果及可能的作用通路和靶點(diǎn),為中醫(yī)古方新用提供依據(jù),結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 雌性21日齡SD大鼠 20只,體質(zhì)量(70±20)g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SCXK(京)2019-0010,所有大鼠均在動物房中飼養(yǎng),保持動物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣,溫度24～26 ℃,相對濕度55%～60%,自由飲食、飲水,晝夜交替12 h。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 六味地黃湯,藥物組成:熟地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,牡丹皮9 g,茯苓9 g,澤瀉 9 g。由天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供,并鑒定為道地藥材,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。來曲?北京凱詩源生物科技有限公司),化學(xué)式:1-[雙(4-氰基苯基)甲基]-1,2,4-三氮唑;4,4'-(1 H-1,2,4-三唑-1-基亞甲基)-雙苯腈。炔雌醇環(huán)丙孕酮(江蘇恒瑞醫(yī)療有限公司,國藥準(zhǔn)字J20140114)。1%羧甲基纖維素溶液(CMC)(北京凱詩源生物科技有限公司)。

1.1.3 主要試劑及儀器 雌二醇(E2)、黃體生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)試劑盒,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、TGF-β1、Smad3、Smad4及Smad7 抗體(上海通蔚生物科技有限公司),RIPA裂解液(美國Abcam公司),蛋白酶抑制劑混合物[翌圣生物科技(上海)股份有限公司],BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher公司),HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司),5%脫脂奶粉(美國Thermo Fisher公司)。電泳儀及電泳槽 (BIO- RAD),Tanon 4800化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(上海天能生命科學(xué)有限公司),Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司),偏光顯微鏡(德國徠卡公司),TS-200雙層數(shù)顯脫色搖床 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司),Multifuge X1R 臺式冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific), 100～1000 μL 移液器、10～100 μL移液器、20～200 μL移液器、1～10 μL移液器、30～300 μL移液器(美國Rainin Instrument公司)。

1.1.4 藥物溶液配制 ①來曲唑溶液:來曲唑溶液2.5 mg溶入1% CMC溶液20 mL中配置成濃度為0.125 mg/mL的溶液。②六味地黃湯藥材煎煮按照《中藥湯劑煎煮規(guī)范(2021版)》煎煮濃縮至含生藥0.5 g/mL的藥液。③炔雌醇環(huán)丙孕酮溶液:炔雌醇環(huán)丙孕酮研磨至粉末狀,將1片(約2 mg)的藥物溶于1% CMC溶液100 mL中配制成濃度為0.02 mg/mL的溶液,按人與大鼠公斤體質(zhì)量折算系數(shù)給藥,即10 mL/kg。

1.2 模型建立、分組及給藥 隨機(jī)將20只雌性SD大鼠分為空白對照組5只,造模組15只。造模組大鼠稱質(zhì)量后,予來曲唑溶液8 mL/kg灌胃,每日1次,連續(xù)21天。同時空白對照組予等量1% CMC灌胃,每日1次,連續(xù)21天。造模成功后將造模組大鼠進(jìn)一步分為模型組、中藥組、中西醫(yī)結(jié)合組,每組5只。中藥組大鼠予六味地黃湯生藥7.5 g/(kg·d)灌胃,連續(xù)21天;中西醫(yī)結(jié)合組大鼠在中藥組基礎(chǔ)上予炔雌醇環(huán)丙孕酮溶液10 mL/(kg·d)灌胃,六味地黃湯與炔雌醇環(huán)丙孕酮溶液間隔30 min灌胃,連續(xù)21天;模型組和空白對照組予0.9%氯化鈉注射液7.5 mL/(kg·d)灌胃,連續(xù)21天。

1.3 取材及檢測方法

1.3.1 取材 最后一次給藥后次日各組大鼠均股動脈取血5 mL至抗凝管,2000 r/min 離心20 min,分離血清,-20 ℃保存待檢測。然后10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖開腹腔取兩側(cè)卵巢置于遇冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中,分離脂肪及結(jié)締組織,一側(cè)固定于4%多聚甲醛中,另一側(cè)吸干水分,凍存于-80 ℃?zhèn)溆?用于蛋白免疫印跡(Western blot)檢測。

1.3.2 檢測指標(biāo)及方法

1.3.2.1 血清性激素測定 采用ELISA法檢測。①取出血清樣本,2～8 ℃融化備用。②標(biāo)品稀釋:進(jìn)行對倍稀釋至說明書濃度,LH標(biāo)品濃度為40、20、10、5、2.5 ng/L,FSH標(biāo)品濃度為24、12、6、3、1.5 IU/L,E2標(biāo)品濃度為80、40、20、10、5 ng/L,T標(biāo)品濃度為8、4、2、1、0.5 nmol/L。③加樣:設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔加 50 μL,待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL,再加樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。④溫育:封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。⑤洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,紙巾上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后甩掉,拍干,重復(fù)5次操作。⑥加酶:空白孔除外,每孔加入50 μL酶標(biāo)試劑,37 ℃溫育30 min。⑦洗滌:同操作⑤。⑧顯色:每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑 B 50 μL,振蕩混勻,37 ℃避光顯色10 min。⑨終止:每孔加終止液50 μL(此時由藍(lán)變黃)。⑩測定:酶標(biāo)儀在450 nm處測各孔吸光值。

1.3.2.2 Western blot檢測卵巢組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá) 取各組大鼠卵巢組織,RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,添加蛋白酶抑制劑混合物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量,取30 μg總蛋白上樣,并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠分離,電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉30 min后,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉室溫封閉30 min,4 ℃孵育TGF-β1(1∶2000),Smad3(1∶20 000)、Smad4(1∶2000)、Smad7(1∶1 000)一抗,振搖過夜,HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,添加ECL化學(xué)發(fā)光液,Tanon 4800化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件讀取各條帶灰度值,以各目的條帶/β-actin比值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3.2.3 卵巢組織形態(tài)及結(jié)構(gòu) 卵巢組織以4%多聚甲醛固定48 h后脫水切片,脫蠟水化后進(jìn)行HE染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠LH、FSH、E2、T水平比較 與空白對照組比較,模型組LH、T水平升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組、中西醫(yī)結(jié)合組LH、T水平均降低(P<0.05),而中藥組LH、T水平與中西醫(yī)結(jié)合組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組FSH、E2比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠 LH、FSH、E2、T 水平比較

2.2 各組大鼠卵巢組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)比較 與空白對照組比較,模型組TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,中藥組TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05),Smad7蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),中西醫(yī)結(jié)合組Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05),而TGF-β1蛋白表達(dá)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與中西醫(yī)結(jié)合組比較,中藥組TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)條帶圖

表2 各組大鼠卵巢組織 TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)比較

2.3 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài) 空白對照組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)清晰,鏡下可見多個不同發(fā)育時期的卵泡及黃體,卵泡壁由多層顆粒細(xì)胞組成,顆粒細(xì)胞形態(tài)完整;模型組可見多個竇卵泡,大鼠卵巢呈多囊樣改變,顆粒細(xì)胞排列紊亂,層數(shù)減少,卵泡膜細(xì)胞明顯增生,間質(zhì)增厚,未見優(yōu)勢卵泡;中藥組大鼠竇卵泡數(shù)量減少,顆粒細(xì)胞層數(shù)增多,有優(yōu)勢卵泡;中西醫(yī)結(jié)合組可見多個不同發(fā)育時期的卵泡,顆粒細(xì)胞層數(shù)增多,且排列整齊。見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)(HE,×200)

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“腎-天癸-沖任-胞宮軸”是維持女性生殖功能的基礎(chǔ)。PCOS作為一組內(nèi)分泌代謝疾病,在育齡期主要表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)及不孕?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗份d:“女子……二七而天癸至,任脈通,太沖脈盛,月事以時下,故有子?！薄端貑枴て娌≌摗吩啤鞍j(luò)者,系于腎”?！恶T氏錦囊秘錄》中載“腎氣全盛,沖任流通,經(jīng)血漸盈,應(yīng)時而下,天真之氣降,與之從事,故云天癸也”?！顿|(zhì)疑錄》中載“天癸者,天一所生之真水,在人身是謂元陰”。綜上可見,腎氣腎精的充盛與月經(jīng)的發(fā)生、生殖孕子關(guān)系密切,腎虛精虧,則天癸枯竭,沖任虧虛,經(jīng)血無源,致月經(jīng)失調(diào)甚至閉經(jīng);腎陰虛損,天癸乏源,血海失充,胞宮失養(yǎng)而不孕。故本研究認(rèn)為PCOS與腎虛密切相關(guān)。王旭東等[4]也指出腎虛是PCOS發(fā)病的基本病機(jī)。根據(jù)治病求本的治療原則,以補(bǔ)腎為主要治療大法,故本研究選用中醫(yī)經(jīng)典補(bǔ)腎方劑六味地黃湯,方中熟地黃為君藥,重用以填精益髓滋陰。山茱萸補(bǔ)肝益腎澀精,山藥補(bǔ)脾益腎,二者共為臣藥,君臣相佐,肝、脾、腎同補(bǔ),即所謂“三補(bǔ)”。又以澤瀉泄?jié)崂麧?并防熟地黃滋膩;以茯苓健脾祛濕,并助山藥補(bǔ)益脾胃;以牡丹皮清瀉相火,并制山茱萸溫澀。此三味藥合用,清火泄?jié)犰顫?即所謂“三瀉”,共為佐藥。全方補(bǔ)瀉兼施,共奏滋陰補(bǔ)腎之功。

PCOS性激素變化特點(diǎn)為LH升高、LH/FSH比值異常,常合并高雄激素血癥、高胰島素血癥等。本研究結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型組LH、T水平升高,卵巢呈現(xiàn)典型的PCOS相關(guān)改變,提示來曲唑造模法是成熟可行的大鼠PCOS模型造模方法。經(jīng)六味地黃湯、六味地黃湯+炔雌醇環(huán)丙孕酮干預(yù)后的PCOS大鼠血清LH、T水平均較模型組下降(P<0.05),且2組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。可見六味地黃湯聯(lián)合或不聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮均可改善PCOS大鼠性激素水平。

PCOS卵巢的表現(xiàn)為卵巢中心間質(zhì)增生,伴有周圍大量的小竇卵泡而缺乏優(yōu)勢卵泡。早期卵泡發(fā)育、閉鎖的調(diào)控的具體過程仍不清楚。TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是典型的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路通過一組配體與受體結(jié)合,將細(xì)胞外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),激活下游的Smad蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶基因,從而介導(dǎo)配體對細(xì)胞的生物學(xué)作用。TGF-β/Smads信號通路對卵巢發(fā)育的調(diào)控機(jī)制已成為生殖生理學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一,其以自分泌和(或)旁分泌等方式調(diào)控顆粒細(xì)胞、增殖和卵母細(xì)胞生長,影響著卵巢發(fā)育[16]。王春霞等[17]研究指出上調(diào)Smad3、Smad4表達(dá)可促進(jìn)卵泡生長發(fā)育。劉龍陽等[18]研究指出卵巢局部的TGF-β水平異?？蓪?dǎo)致卵泡發(fā)育異常和排卵障礙。也有研究證實(shí)[19],TGF-β/Smads 信號通路在卵巢纖維化方面起著重要作用。由此可知,TGF-β/Smads信號通路能影響卵泡的生長發(fā)育,但同樣也能導(dǎo)致卵泡過度增殖及卵巢纖維化。PCOS主要以大量竇卵泡發(fā)育而無優(yōu)勢卵泡及卵巢纖維化為病理改變。本研究中,模型組TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平均高于空白對照組,TGF-β1、Smad3、Smad4的升高考慮與PCOS卵巢炎癥反應(yīng)、間質(zhì)增生、卵泡過度發(fā)育相關(guān)。Smad7作為抑制型Smad主要起抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[20],本研究中模型組Smad7表達(dá)水平高于空白對照組,考慮可能與信號通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)相關(guān),有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果已經(jīng)顯示出TGF-β/Smads信號通路相關(guān)因子在PCOS發(fā)生發(fā)展中似乎確實(shí)發(fā)揮著重要的作用。在本研究中,與模型組相比,六味地黃湯干預(yù)可降低TGF-β1、Smad3、Smad4表達(dá)水平,升高Smad7表達(dá)水平,表明六味地黃湯可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號通路相關(guān)因子表達(dá),從而發(fā)揮治療PCOS的作用。此外本研究中中西醫(yī)結(jié)合組TGF-β1蛋白表達(dá)水平較模型組無明顯變化(P>0.05),而Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05),可見六味地黃湯聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮對TGF-β/Smads相關(guān)因子的影響并未顯示出一致性,可能主要與本研究樣本量較少相關(guān),有待于進(jìn)一步研究探討。同時,與中西醫(yī)結(jié)合組比較,中藥組TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。提示單純六味地黃湯干預(yù)較六味地黃湯聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮干預(yù)對TGF-β/Smads通路的抑制作用更強(qiáng),且主要可能與通過上調(diào)抑制型Smad7水平相關(guān)。

綜上所述,六味地黃湯、六味地黃湯聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮均能改善PCOS大鼠的性激素水平。TGF-β/Smads過度表達(dá)似乎是PCOS的發(fā)病的內(nèi)在機(jī)制之一,而六味地黃湯能調(diào)節(jié)TGF-β/Smads信號通路相關(guān)因子的表達(dá),主要是通過上調(diào)抑制型Smad7水平發(fā)揮作用,而本研究中關(guān)于六味地黃湯聯(lián)合炔雌醇環(huán)丙孕酮對TGF-β/Smads相關(guān)因子的表達(dá)并沒有顯示出一致性,且研究樣本量較少,尚不能完全解釋TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7相關(guān)因子的變化趨勢,有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。