劉代利 王 智 李 玲 張競(jìng)飛 秦 漢 蔡 圳

1.濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264000；2.山東省臨沂市人民醫(yī)院口腔科，山東臨沂 276000

癌癥是最常見的疾病類型，也是導(dǎo)致人類死亡的主要原因[1]。癌癥的發(fā)生、發(fā)展涉及諸多信號(hào)通路和關(guān)鍵蛋白，其中Akt 激酶在很多通路中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。Akt 激酶是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，能被多種刺激和激酶激活，參與活化多種蛋白底物，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖、凋亡、侵襲和血管生成調(diào)控癌癥的發(fā)生、發(fā)展[2]。作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，Akt 激酶在藥物抗癌領(lǐng)域被廣泛研究。小檗堿（berberine，BBR）是一種來源于天然植物的季銨生物堿。研究發(fā)現(xiàn)，BBR 可通過靶向Akt 激酶在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[3]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[4]及腫瘤耐藥[5]等方面發(fā)揮作用，有望開發(fā)為一種理想的抗癌藥物，本文就BBR 靶向Akt 激酶的抗癌機(jī)制做一綜述，旨在為BBR 抗腫瘤研究提供一定的思路和參考。

1 BBR 的生物學(xué)功能

近年來，藥用植物及其活性化合物的抗癌功效已受到廣泛關(guān)注。BBR 別名黃連素，味苦，主要存在于黃連、黃柏和三顆針等多種中草藥的根、莖、皮中，其分子式為[C20H18NO4]+。見圖1。BBR 具有廣泛的藥理活性，包括抗感染、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、止瀉及成骨等[6]。中醫(yī)常將黃連素用于清熱解毒和治療腹瀉，目前臨床上也廣泛將其用于治療胃腸炎和痢疾。BBR 的抗癌作用已在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到廣泛研究，近年來體外研究發(fā)現(xiàn)，BBR 能夠有效抑制肝癌[7]、喉癌[8]和子宮內(nèi)膜癌[9]等的發(fā)展。另外，在動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，BBR 能夠顯著減緩體內(nèi)腫瘤生長速度，減小腫瘤體積[10-13]。以上研究表明，BBR 具有廣譜抗腫瘤特性，可作為治療不同癌癥的候選藥物。本文所涉及的BBR 抗癌作用機(jī)制見圖2。

圖1 小檗堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 小檗堿靶向Akt 激酶的抗癌機(jī)制

2 BBR 通過靶向Akt 激酶發(fā)揮抗癌作用

2.1 BBR 通過靶向Akt 激酶調(diào)控細(xì)胞周期

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞過度增殖，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)受細(xì)胞周期蛋白及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的嚴(yán)格調(diào)控，保證細(xì)胞周期有序進(jìn)行。

BBR 通過下調(diào)人肝癌細(xì)胞內(nèi)p-Akt 激酶和S 期激酶相關(guān)蛋白2 的表達(dá)，增強(qiáng)叉頭框蛋白O3a 的表達(dá)和核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而提高細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21Cip1 和p27Kip1 轉(zhuǎn)錄的mRNA 數(shù)量及翻譯后蛋白的穩(wěn)定性，促使肝癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[14]。在BBR 對(duì)乳腺癌[15]和甲狀腺癌[16]的研究中也得到了類似的發(fā)現(xiàn)。此外，BBR 可通過作用Akt 激酶不同的上游調(diào)控因子發(fā)揮作用。例如，BBR 可抑制PI3K/Akt 通路的上游正調(diào)控因子胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白3 的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[17]。BBR 也能通過加速表皮生長因子受體-調(diào)蛋白的降解，介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D1 積累，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞周期阻滯[18]。

總結(jié)以上研究發(fā)現(xiàn)，不論是BBR 對(duì)Akt 激酶上游調(diào)控因子還是對(duì)Akt 激酶的直接作用，BBR 都是通過抑制PI3K/Akt 通路發(fā)揮對(duì)癌細(xì)胞的周期阻滯作用。Eo 等[19]發(fā)現(xiàn)，BBR 能夠促進(jìn)人軟骨肉瘤細(xì)胞中Akt 激酶的磷酸化，增強(qiáng)p53 和p21 的表達(dá)，從而降低細(xì)胞周期蛋白B1 水平，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。結(jié)合上述研究，推測(cè)BBR 可能通過對(duì)Akt 激酶的雙向調(diào)控介導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯。

2.2 BBR 通過靶向Akt 激酶誘導(dǎo)線粒體凋亡和自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡

線粒體凋亡是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，涉及Bcl-2 家族蛋白表達(dá)的失調(diào)、線粒體膜電位的下降、細(xì)胞色素C 的釋放及胱天蛋白酶的激活等過程。在人甲狀腺癌細(xì)胞中，BBR 能夠通過抑制Akt 激酶表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和活化胱天蛋白酶-3，介導(dǎo)線粒體凋亡途徑[16]。在骨肉瘤細(xì)胞[20]和胃癌細(xì)胞[13]中的研究也得到了類似的結(jié)果。此外，BBR 可通過作用于肝癌細(xì)胞促進(jìn)胞內(nèi)活性氧積累，激活PH 結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶2，介導(dǎo)Akt 激酶失活，促進(jìn)哺乳動(dòng)物不育系20 樣激酶磷酸化，靶向Jun 激酶，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]。

自噬是一種保守的自降解系統(tǒng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。雖然自噬在癌癥中的作用尚有爭(zhēng)議，但多數(shù)研究將其介紹為一種抗腫瘤機(jī)制。BBR 對(duì)癌細(xì)胞自噬具有雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，BBR 能夠通過抑制Akt 激酶活性誘導(dǎo)自噬導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。例如，BBR能夠通過抑制肝癌細(xì)胞中的Akt 激酶活性，降低其下游效應(yīng)因子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達(dá)，激活自噬，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。與此同時(shí)，在黑色素瘤細(xì)胞[22]和急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞[12]中，BBR 也通過抑制Akt 激酶活性，激活自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。另一方面，BBR 能夠通過抑制自噬，提高化療藥物的細(xì)胞毒性。BBR 通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞中磷酸酶與張力蛋白同源物的表達(dá)，增加Akt 激酶和mTOR 磷酸化水平，從而阻斷微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ的產(chǎn)生，促進(jìn)p62 的細(xì)胞積累，抑制自噬，逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥[11]。

以上研究表明，與抑制Akt 激酶活性促進(jìn)線粒體凋亡不同，BBR 在調(diào)節(jié)自噬方面的作用復(fù)雜且富有爭(zhēng)議。首先，BBR 在不同腫瘤中對(duì)Akt 激酶的調(diào)節(jié)作用不同。BBR 既可以抑制Akt 激酶活性，又能夠促進(jìn)其磷酸化，推測(cè)可能與BBR 作用靶點(diǎn)的多樣性、濃度或腫瘤的類型有關(guān)。其次，自噬在腫瘤中的作用也不甚明確，激活自噬可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬性死亡，而抑制自噬可以抵抗自噬介導(dǎo)的耐藥，增強(qiáng)化療藥物藥效?？偨Y(jié)以上研究發(fā)現(xiàn)，盡管BBR 靶向Akt 激酶可抑制各種癌細(xì)胞，但在細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.3 BBR 通過靶向Akt 激酶抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散的能力決定了腫瘤的惡性程度，大部分與癌癥相關(guān)的死亡是由癌癥轉(zhuǎn)移造成的。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是一種進(jìn)化上保守的發(fā)育程序，驅(qū)動(dòng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性和耐藥性。黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)BBR 處理后，EMT 受到抑制，表現(xiàn)為視黃酸受體表達(dá)失調(diào)，上皮鈣黏素上調(diào)，神經(jīng)鈣黏素下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt 激酶表達(dá)下降，提示BBR 通過PI3K/Akt 通路抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲[23]。另外，BBR 還可以通過作用Akt 激酶及其他通路共同抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。例如，Kuo 等[24]發(fā)現(xiàn)，BBR 可通過調(diào)節(jié)Akt 激酶的mRNA 表達(dá)和蛋白降解，下調(diào)Akt 激酶蛋白水平，阻止乳腺癌細(xì)胞中核因子κB 和Jun 激酶的激活，降低基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 和MMP-9 表達(dá)水平。與之相似，BBR 能與乳腺癌細(xì)胞中肝細(xì)胞配體B2 靶向結(jié)合，抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2 及其下游信號(hào)成員Akt 激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 磷酸化，最終導(dǎo)致MMP-2 和MMP-9 表達(dá)下調(diào)[25]。

新生的微血管是腫瘤發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的第一站，抗血管生成是一種經(jīng)典的抗癌方法，BBR 能夠通過靶向血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），避免新血管形成，抑制腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，BBR 作用于腫瘤啟動(dòng)子組織多肽抗原誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞會(huì)下調(diào)VEGF 和纖維連接蛋白水平。細(xì)胞經(jīng)PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002 處理后，出現(xiàn)與BBR 對(duì)組織多肽抗原誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞具有相似的抑制作用，推測(cè)BBR 可通過抑制乳腺癌細(xì)胞PI3K/Akt 激酶通路抑制組織多肽抗原誘導(dǎo)的VEGF和纖維連接蛋白表達(dá)[26]。值得一提的是，肺癌細(xì)胞中PI3K/Akt 通路的激活可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管的形成和存活，從而改變微環(huán)境，利于腫瘤生長[27]。

2.4 BBR 通過靶向Akt 激酶提高化療藥物敏感性

化療是癌癥常用的治療方法，但耐藥機(jī)制嚴(yán)重影響其效果。多藥物聯(lián)合使用能夠顯著提高藥物敏感性和安全性。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑和BBR 聯(lián)合治療可顯著降低順鉑耐藥胃癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 激酶和p-mTOR的表達(dá)，增加腫瘤組織中TUNEL 陽性細(xì)胞，減少Ki-67 陽性細(xì)胞[5]。推測(cè)BBR 可通過抑制順鉑耐藥胃癌細(xì)胞中的PI3K/Akt 通路抑制順鉑耐藥胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)DNA 損傷。此外，BBR 作用于順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞，抑制miR-93 的表達(dá)，上調(diào)PTEN 蛋白水平，進(jìn)而對(duì)Akt 激酶的活化進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯[28]，即BBR 通過miR-93/PTEN/Akt 通路增加順鉑敏感性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BBR 和吉西他濱共同處理能夠顯著降低膀胱癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt 激酶和Rad51 的表達(dá)[10]。提示BBR 通過抑制PI3K/Akt 通路下調(diào)Rad51 表達(dá)，增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。綜上所述，BBR 與化療藥物合用不僅可以增強(qiáng)其細(xì)胞毒性，而且對(duì)已產(chǎn)生耐藥性的癌細(xì)胞，BBR 仍可通過靶向Akt 激酶發(fā)揮抗癌作用，甚至逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的耐藥性。

2.5 BBR 通過靶向Akt 激酶逆轉(zhuǎn)瓦爾堡效應(yīng)和改善腫瘤微環(huán)境

瓦爾堡效應(yīng)即有氧糖酵解，是指在氧氣充足的條件下，癌細(xì)胞傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的代謝特征，能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲性和耐藥性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。BBR 作用于肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞，抑制Akt/mTOR通路，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BBR 能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）和泛素結(jié)合門合酶9 的結(jié)合，同時(shí)阻礙GLUT1 與Gα-相互作用蛋白C 端的相互作用，導(dǎo)致GLUT1 降解加快，葡萄糖攝入減少，逆轉(zhuǎn)了瓦爾堡效應(yīng)[29]。在口腔癌細(xì)胞中，BBR 可降低Akt 激酶磷酸化總量，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BBR 降低環(huán)氧化酶-2 的表達(dá)并減少了前列腺素E2的產(chǎn)生，調(diào)控口腔癌細(xì)胞凋亡[30]。由此可見，BBR 可能通過調(diào)控癌細(xì)胞代謝，調(diào)控炎癥因子釋放，改善TME，增強(qiáng)腫瘤免疫發(fā)揮抗癌作用。

3 總結(jié)與展望

癌癥是一個(gè)重大的全球健康問題，也是導(dǎo)致死亡的主要原因。傳統(tǒng)中藥在抗癌方面具有多途徑、多靶點(diǎn)、副作用小及成本低等優(yōu)勢(shì)?！睹t(yī)別錄》中記載黃連：“微寒，無毒。主治五臟冷熱，久下泄?jié)?、膿血，止消渴、大驚，除水，利骨，調(diào)胃，厚腸，益膽，治口瘡?！盉BR作為黃連中的主要活性成分，盡管在Akt 激酶誘導(dǎo)的周期阻滯和自噬等方面作用機(jī)制尚有爭(zhēng)議，但仍可以通過靶向Akt 激酶介導(dǎo)多種抗癌作用，推測(cè)Akt 激酶是其作用的主要靶點(diǎn)之一，有望開發(fā)用于臨床癌癥治療。但由于BBR 抗癌作用途徑廣泛，對(duì)在BBR 影響下Akt 激酶和其他靶點(diǎn)的相互作用及這種效應(yīng)是否會(huì)介導(dǎo)毒副作用仍值得深入闡釋。與一線抗癌藥物比較，雖然BBR 對(duì)某些癌癥細(xì)胞株的作用濃度大于100 μmol/L，但對(duì)多數(shù)腫瘤仍具有明顯的抑制作用。更需要臨床中注意的是，由于BBR 自身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，加之其可被外排轉(zhuǎn)運(yùn)體排出的特性，導(dǎo)致其難以吸收入血發(fā)揮作用，如何使用合適的載體或結(jié)構(gòu)改造使其克服這些缺點(diǎn)，提高BBR 的生物利用度，在腫瘤部位維持較高的藥物濃度以達(dá)到治療要求可能是未來BBR 在抗癌領(lǐng)域的研究方向。