★ 蘇星 陳劍平 胡嬌嬌 黃靜萍 黃恩堂（.鷹潭市綜合檢驗(yàn)檢測中心 江西 鷹潭 335000；.江西省藥品檢查員中心 南昌 33009）

痢瀉靈片是由拳參、穿心蓮、苦參3 味中藥組成的中成藥，具有清熱解毒、止痢、止瀉的功效，用于熱瀉、濕熱痢疾等癥［1］。痢瀉靈片現(xiàn)收載于國家衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》（第二冊），僅有檢查項(xiàng)目，無專屬鑒別檢查和含量測定方法。近些年對痢瀉靈片的檢驗(yàn)方法研究較少，文獻(xiàn)也并不多見?，F(xiàn)行的痢瀉靈片文獻(xiàn)報(bào)道多針對其中的1~2 種成分進(jìn)行含量測定研究［2-5］，而中成藥復(fù)方制劑具有多成分、多靶點(diǎn)，成分間相互協(xié)調(diào)、相互制約，整體作用等特點(diǎn)，現(xiàn)有的單成分質(zhì)量控制方法難以全面反映其整體質(zhì)量。

中藥指紋圖譜是目前綜合評價中藥及其制劑的常用方法，具有整體性好、信息量大、特征性強(qiáng)等特點(diǎn)［6］，結(jié)合聚類分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法可為中藥、特別是中成藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評價提供更多的、更多維的信息。

本研究首次將中藥指紋圖譜技術(shù)與HPLC 法定量測定及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析法相結(jié)合，用于痢瀉靈片的質(zhì)量控制，通過中藥指紋圖譜相似度評價軟件對不同廠家不同批次的痢瀉靈片指紋圖譜相似度進(jìn)行評價，同時采用聚類分析和主成分分析法對10 批痢瀉靈片的質(zhì)量進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上建立了一個同時測定痢瀉靈片中苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測定方法，為更好地對痢瀉靈片質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)管和控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（四元泵，UV檢測器，美國Agilent 公司）；MSE125P-1CE-DU型電子天平（精度0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器〈北京〉有限公司）；MSE224S-1CE-DU 型電子天平（精度0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器〈北京〉有限公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純，水為超純水。對照品：苦參堿（批號：110805-201709，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%）、氧化苦參堿（批號：110780-201508，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.5%）、穿心蓮內(nèi)酯（批號：110797-201609，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）、脫水穿心蓮內(nèi)酯（批號：110854-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%）。對照藥材：苦參（批號：121019-201708）、穿心蓮（批號：121082-201706）、拳參（批號：121569-201602）。對照品及對照藥材均購自中國食品藥品檢定研究院，10 批痢瀉靈片均購自市場。見表1。

表1 10批痢瀉靈片的具體信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；以乙腈-0.01 mol/L 乙酸銨溶液（濃氨試液調(diào)pH 8.1）（3∶2）為流動相A，0.01 mol/L醋酸銨溶液（用氨試液調(diào)pH 8.1）為流動相B，梯度洗脫（0~10 min，5%~10%A；10~30 min，10%~25%A；30~45 min，25%~40%A；45~70 min，40%~50%A；70~80 min，50%~55%A；80~90 min，55%~60%A；90~95 min，60%~5%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為225 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。在該條件下，混合對照品溶液及痢瀉靈片樣品溶液的HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 典型液相色譜圖

2.2 混合對照品溶液的制備

取苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度分別為0.098 5、0.076 7、0.018 4、0.020 2 mg/mL 的對照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品20 片，除去包衣，研成細(xì)粉，精密稱取2.400 g，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL及氨水1 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱（200~300 目，8 g，內(nèi)徑15 mm）上，用15 mL 三氯甲烷洗脫后，繼續(xù)用三氯甲烷-甲醇（3∶7）15 mL 洗脫，合并洗脫液，揮去溶劑，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 苦參和穿心蓮陰性樣品的制備

按處方比例分別配制苦參和穿心蓮陰性樣品，照“2.3”項(xiàng)下的供試品制備方法進(jìn)行處理，即得苦參和穿心蓮陰性樣品。

2.5 單味藥材供試品溶液的制備

取苦參、穿心蓮、拳參粉末各2.4 g，按照“2.3”項(xiàng)下的供試品制備方法進(jìn)行處理，即得各單味藥材供試品溶液。

2.6 指紋圖譜研究

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一痢瀉靈片供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖，以9 號穿心蓮內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時間RSD值在0.11%~4.76%之間，相對峰面積RSD值在1.30%~3.06%之間，均＜5%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取痢瀉靈片適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以9 號穿心蓮內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時間RSD值在0.18%~4.58%之間，相對峰面積RSD值在0.44%~1.05%之間，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一痢瀉靈片供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，以9 號穿心蓮內(nèi)酯色譜峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時間RSD值在0.40%~4.68%之間，相對峰面積RSD值在1.13%~3.67%之間，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 指紋圖譜的建立 取10 批痢瀉靈片樣品溶液，進(jìn)樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以1 號樣品色譜圖為參照圖譜，采用平均數(shù)法，經(jīng)全譜峰匹配，生成對照圖譜（R），10 批痢瀉靈片指紋圖譜與對照圖譜的相似度分別為0.996、0.996、0.963、0.921、0.996、0.996、0.997、0.997、0.997、0.997，符合指紋圖譜研究要求。見圖2。

圖2 10批痢瀉靈片HPLC指紋圖譜（S1～S10）和對照指紋圖譜（R）

取單味藥材溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖3。結(jié)合前述苦參與穿心蓮陰性樣品的色譜圖，對痢瀉靈片樣品溶液色譜圖中的峰進(jìn)行歸屬，共確定了13 個共有峰，其中1~8 來自苦參，9~12 來自穿心蓮，13 號峰未進(jìn)行歸屬。

圖3 單味藥材溶液的HPLC色譜圖

2.6.5 聚類分析 將10 批痢瀉靈片的共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0 軟件進(jìn)行聚類分析［6-7］，采用系統(tǒng)聚類法，10 批痢瀉靈片可以分為3 類，S4、S5、S6、S7為第1 類，S3、S8、S9、S10為第2 類，S1和S2為第3 類，這與表1 中10 批樣品的生產(chǎn)廠家來源相符，說明相同廠家生產(chǎn)的痢瀉靈片的質(zhì)量穩(wěn)定，而不同生產(chǎn)廠家不同批次痢瀉靈片的質(zhì)量存在差異，這可能與廠家所用中藥材的產(chǎn)地、采收時間、加工、運(yùn)輸、存儲有關(guān)。見圖4。

圖4 10批痢瀉靈片的聚類分析圖

2.6.6 主成分分析 采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件將10 批痢瀉靈片13 個共有峰的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以主成分的特征值和貢獻(xiàn)率為依據(jù)，對其進(jìn)行主成分分析［7］。為使分析結(jié)果更加直觀，主成分分析選取3個主成分，特征值分別為7.141、4.465、1.159，累積方差貢獻(xiàn)率分別是54.929%、89.272%、98.184%。見表2。

表2 特征值和方差貢獻(xiàn)率

10 批痢瀉靈片根據(jù)主成分得分Z1、Z2、Z3作散點(diǎn)圖分析其聚類結(jié)果。主成分分析聚類結(jié)果見圖5，在主成分空間中距離較近的為同類樣本，距離較遠(yuǎn)的為不同類樣本。結(jié)果表明10 批痢瀉靈片中，S4~S7聚在一起為一類，S8、S9、和S10距離極近，歸為一類，S3距離S8~S10更近，S1和S2距離其他樣本均較遠(yuǎn)，此結(jié)果與聚類分析結(jié)果較一致。

圖5 10批痢瀉靈片主成分分析散點(diǎn)圖

2.7 4 種組分的含量測定

2.7.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣2、5、10、15、20、25 μL，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所測的4 種成分在各自的進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。見表3。

表3 痢瀉靈片中4種成分的線性關(guān)系

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖，計(jì)算得到苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.53%、0.92%、0.36%、0.53%，表明儀器的精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取痢瀉靈片適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計(jì)算得到上述4 種成分含量，RSD值分別為2.65%、2.14%、2.32%和2.33%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取痢瀉靈片供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計(jì)算得到上述4種成分峰面積RSD分別為0.99%、1.71%、0.64%、0.68%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品6 份（1 號樣品，含量為含苦參堿0.287 mg/g，含氧化苦參堿0.129 mg/g，穿心蓮內(nèi)酯0.125 mg/g，脫水穿心蓮內(nèi)酯0.012 mg/g），每份1.200 g（供試品稱樣量的1/2），分別精密加入適量濃度的混合對照品溶液（含0.387 7 mg/mL 苦參堿，0.178 7 mg/mL 氧化苦參堿，0.183 4 mg/mL 穿心蓮內(nèi)酯和0.013 1 mg/mL 脫水穿心蓮內(nèi)酯）1 mL，按供試品溶液的制備方法操作，并按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的平均回收率分別為104.7%、96.1%、108.2%、92.2%，RSD分別為2.76%、2.27%、3.25%和1.97%，符合《中國藥典》要求，表明該方法準(zhǔn)確性良好。見表4。

表4 4種成分加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7.6 樣品測定 精密稱取痢瀉靈片粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量。見表5。

表5 痢瀉靈片中4種成分的含量測定結(jié)果 μg/g

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

查閱文獻(xiàn)［2-4］，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，痢瀉靈片中苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的最大吸收波長在219、339、224、249、214 nm，通過比較各波長下的色譜圖發(fā)現(xiàn)，檢測波長為225 nm 時，痢瀉靈片色譜圖中色譜峰最多，分離度也適合，并且各特征峰的峰型較好，故而在進(jìn)行指紋圖譜研究時選擇225 nm 為檢測波長。

3.2 色譜條件的選擇

前期查閱文獻(xiàn)，2015 年版《中國藥典》一部中苦參的含量測定采用的是氨基柱，而2020 年版《中國藥典》一部采用的是C18柱梯度洗脫，嘗試藥典的兩種方法以及一些文獻(xiàn)方法［2-5］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用氨基柱的方法重現(xiàn)性差，而C18柱梯度洗脫法的結(jié)果重現(xiàn)性較好，結(jié)果較為穩(wěn)定，根據(jù)峰分離情況，選擇C18柱及梯度洗脫的方法。

3.3 供試品制備方法的選擇

分別對提取溶劑（甲醇、乙醇或三氯甲烷）、提取方法（加熱回流或超聲）和最后中性氧化鋁柱的洗脫溶劑（不同比例甲醇和三氯甲烷混合溶液）進(jìn)行考察，比較4 個待測組分的峰面積，最終選定“2.3”項(xiàng)下的樣品制備方法。

3.4 指紋圖譜及含量測定

本研究建立了痢瀉靈片的HPLC 指紋圖譜，共發(fā)現(xiàn)13 個共有峰，與對照品進(jìn)行比對，指認(rèn)出其中的4 個，10 批痢瀉靈片與對照圖譜之間的相似度均高于0.9，所建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定可靠。10 批痢瀉靈片的含量測定結(jié)果存在較大的差異，苦參堿、氧化苦參堿、穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量分別是77.5~302.8 μg/g、4.0~171.7 μg/g、86.0~160.7 μg/g、2.9~40.3 μg/g。從結(jié)果來看，不同樣品間4 種成分的含量差別較大，其中樣品3 的氧化苦參堿含量極低，樣品8~10 的脫水穿心蓮內(nèi)酯含量也極低，提示不同廠家生產(chǎn)中投料的藥材質(zhì)量參差不齊，該品種的質(zhì)量需要得到更為嚴(yán)格的控制。

綜上，本研究所建立的用于控制痢瀉靈片質(zhì)量的HPLC 指紋圖譜和含量測定方法穩(wěn)定可靠，可為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。