安 倩 余枝廣 柴 凡 孫懷娟 李俊鑫 萬曉春*

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所 抗體藥物研究中心 深圳 518055)

1 引 言

凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-ntithrombin complex，TAT)是凝血酶原(prothrombin)被激活后生成的凝血酶(thrombin，T)被抗凝血酶(antithrombin Ⅲ，AT)迅速結(jié)合后形成的以共價鍵相連的復(fù)合物，分子質(zhì)量約為 96 ku[1-4]。TAT的形成反映了凝血酶的生成，標(biāo)志著凝血系統(tǒng)的激活，是反映機體高凝狀態(tài)的特異性分子標(biāo)志物[5-6]。定量檢測血漿中的 TAT 含量對彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated or diffuse intravascular coagulation，DIC)、膿毒癥、深靜脈血栓等血栓性疾病的診斷具有十分重要的意義。此外，TAT檢測結(jié)合其他凝血檢測項目對抗凝和溶栓治療具有指導(dǎo)價值[7-9]。

目前，檢測 TAT 的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析具有靈敏度和特異性高、重復(fù)性好、線性范圍寬等優(yōu)點，是體外診斷試劑開發(fā)的主流平臺。化學(xué)發(fā)光試劑的抗體原料是影響試劑性能的決定性因素。目前，市面上的 TAT 檢測試劑盒采用的原料多為針對 T 抗原和 AT 抗原的抗體，兩個抗體分別結(jié)合 TAT 抗原上的位點，形成“抗體-抗原-抗體”的雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。健康人血漿中的 TAT 含量小于 4.0 ng/mL，血漿中 AT 抗原(0.20～0.30 mg/mL)和凝血酶原(0.15～0.20 mg/mL)的含量比“出血-凝血”平衡狀態(tài)下產(chǎn)生的 TAT高[3]。傳統(tǒng)的 TAT 檢測方法采用針對 AT 單體和T 單體的抗體與 TAT 形成雙抗體夾心，AT 單體和 T 單體的抗體會與血漿中大量存在的 AT 單體或凝血酶原結(jié)合，對 TAT 的測定產(chǎn)生一定干擾，從而影響試劑的準(zhǔn)確度和靈敏度，因而本研究采用針對 TAT 的特異性抗體來建立 TAT 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法。

2 材料與方法

2.1 一般資料

TAT 由人凝血酶(Haematologic Technologies Inc.)和抗凝血酶(Haematologic Technologies Inc.)混合反應(yīng)制備而成。對照試劑為希森美康公司的TAT 檢測試劑盒(希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司)。臨床血漿樣本由深圳市第二人民醫(yī)院提供。本研究中用到的設(shè)備為深圳麥科田 Immu F6全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和日本希森美康全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 HISCL-5000。

2.2 方法

2.2.1 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗體的制備和純化

將人凝血酶和抗凝血酶 Ⅲ (摩爾比為 1∶1.2)于 37 ℃ 反應(yīng) 15 min，生成 TAT。為獲得高純度的 TAT，將上述反應(yīng)混合物進(jìn)行 SDS-PAGE 非還原電泳，切膠回收 TAT 條帶，選用 TAT 抗原作為免疫原進(jìn)行小鼠免疫，2～3 輪免疫后取血清進(jìn)行效價測試，效價合格后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過兩次篩選得到針對 TAT 的雜交瘤細(xì)胞株，在小鼠腹腔中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，收集腹水，采用protein G 親和純化法純化抗體。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗體的親和力

包被板制備：分別將 AT、T 抗原和 TAT 用包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋到 1 nmol/L，AT 抗原包被板每孔添加 100 μL 1 nmol/L 的 AT，T 抗原包被板每孔添加 100 μL 1 nmol/L 的 T，TAT 包被板每孔添加 100 μL 1 nmol/L 的 TAT，4 ℃ 包被過夜(18～20 h)。

封閉：取出包被板平衡至室溫，用洗滌液(磷酸鹽緩沖液)洗板 2 次，每孔加 150 μL 封閉液(含 5% 脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液)，在 37 ℃封閉 0.5 h，甩干置于濕度小于 30% 的 4 ℃ 干燥箱中干燥 24 h。

顯色：分別添加 100 μL 不同濃度(0、0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、16.0 mg/L)的抗體3B16 和抗體 8D9 于不同抗原包被板，37 ℃ 反應(yīng)60 min，洗板后加入 100 μL 酶標(biāo)工作液(含羊抗鼠 IgG-HRP)，37 ℃ 反應(yīng) 30 min，洗板后加顯色劑 A(含過氧化氫)和顯色劑 B(含四甲基聯(lián)苯胺)各 50 μL，顯色 15 min，加入終止液(50 mmol/L H2SO4)50 μL，測定 450 nm 處的吸光值(optical density，OD450)。

2.2.3 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物的檢測方法

采用雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析法對 TAT進(jìn)行檢測，其檢測步驟如下。首先，樣本與包被捕獲抗體的磁珠混合并孵育，樣本中的 TAT 和包被在磁珠上的抗體結(jié)合。反應(yīng)完成后，磁場吸住磁珠，清洗液洗去未結(jié)合的物質(zhì)。其次，添加吖啶酯標(biāo)記抗體，混合并孵育，標(biāo)記有吖啶酯的抗體會與磁珠抗體上的 TAT 結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體的夾心復(fù)合物。反應(yīng)完成后，磁場吸住磁珠，清洗液洗去未結(jié)合的物質(zhì)。最后，將預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液加入反應(yīng)混合物中，發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。通過光電倍增管對反應(yīng)中產(chǎn)生的光子數(shù)進(jìn)行測量，所產(chǎn)生的光子數(shù)與樣本中的 TAT 濃度成正比。

2.2.4 試劑工作液的制備

磁珠抗體工作液：取一定量磁珠于離心管中，用磁珠包被稀釋液 A(H3BO3-NaOH 緩沖液)清洗磁珠 2 次后重懸；加入捕獲抗體(抗體3B16)，再加入磁珠包被稀釋液 B(H3BO3-NaOH緩沖液，含 K2HPO4)，37 ℃ 孵育；用清洗液(磷酸鹽緩沖液，含牛血清白蛋白、ProClin-300、Tween-20)清洗并封閉 24 h；用磁珠稀釋液(Tris 緩沖液，含牛血清白蛋白、ProClin-300、Tween-20)按照一定比例稀釋磁珠母液，配成磁珠工作液。

吖啶酯標(biāo)記抗體工作液：將吖啶酯溶液(N,N-二甲基甲酰胺溶劑)與檢測抗體(抗體8D9)以一定的比例混合，避光反應(yīng) 1 h；用磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 6.0)透析 3 次，得到吖啶酯標(biāo)記抗體母液；用吖啶酯標(biāo)記物稀釋液(嗎啉乙磺酸緩沖液，含牛血清白蛋白、ProClin-300、Tween-20)將吖啶酯標(biāo)記抗體母液稀釋到所需要的濃度，得到吖啶酯標(biāo)記抗體工作液。

2.2.5 校準(zhǔn)質(zhì)控品的配制和校準(zhǔn)品溯源

用校準(zhǔn)品稀釋液(含有 1% 牛血清白蛋白、0.9% NaCl、pH 值 7.4 的 Tris 緩沖液)將 TAT 抗原稀釋為一系列不同濃度(0～120.0 ng/mL)，作為一組工作校準(zhǔn)品。工作校準(zhǔn)品的濃度覆蓋試劑的線性范圍。用校準(zhǔn)品稀釋液將 TAT 抗原分別稀釋為 4.0 ng/mL 和 20.0 ng/mL 左右，分別作為質(zhì)控品 L 和 H。

用日本希森美康全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 HISCL-5000 配套的 TAT 檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)中的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器，測定一系列血漿樣本，同時采用本研究制備的 TAT 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測試劑(簡稱“本試劑”)測定血漿樣本的發(fā)光值；采用 L4P fitting ToolCSharp 工具，將希森美康檢測系統(tǒng)測得的濃度和本試劑測得的發(fā)光值進(jìn)行擬合，得到曲線；用同一批試劑測定工作校準(zhǔn)品，將工作校準(zhǔn)品的發(fā)光值代入曲線中，反算工作校準(zhǔn)品的濃度，此濃度和對應(yīng)的發(fā)光值擬合的曲線為本試劑的主曲線。

2.2.6 樣本量和工作液濃度的優(yōu)化

選用樣本量 10 μL、20 μL、50 μL，磁珠濃度 0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L，吖啶酯抗體濃度 0.15 mg/L、0.20 mg/L、0.25 mg/L，設(shè)計正交實驗表，采用正交實驗對這 3 個變量進(jìn)行優(yōu)化，確定每個因子的最佳水平，分析因子效應(yīng)。

2.2.7 最佳孵育時間的優(yōu)化

在 2.2.6 小節(jié)的基礎(chǔ)上進(jìn)行最佳孵育時間的優(yōu)化。第一步，磁珠抗體和待測物孵育 5 min；第二步，第一步的產(chǎn)物與吖啶酯標(biāo)記抗體孵育 5 min，表示為 5 min-5 min，分別調(diào)整兩步反應(yīng)的孵育時間為 7 min-5 min、5 min-7 min，進(jìn)行測試，計算樣本的信噪比(signal to noise ratio，S/N)。信噪比為樣本的信號值與校準(zhǔn)品稀釋液(S0)的發(fā)光值之比。

2.2.8 性能評估

(1)線性范圍

將高值樣本按一定比例稀釋為 5 個濃度樣本，高值樣本濃度達(dá)到檢測區(qū)間(0.4～120 ng/mL)的上限，低值樣本的濃度須接近檢測區(qū)間(0.4～120 ng/mL)的下限，對每一濃度的樣本重復(fù)測定3 次，計算其平均值。將測定濃度的平均值與理論濃度用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程，并計算線性相關(guān)系數(shù)r。

(2)準(zhǔn)確度

測試溯源后的準(zhǔn)確度樣本 I((4.0±0.8)ng/mL))和準(zhǔn)確度樣本 II((20.0±4.0)ng/mL)，每個樣品重復(fù)測定 3 次，根據(jù)Bi＝(Xi－T)/T×100% 計算相對偏差。其中，Bi為相對偏差，Xi為準(zhǔn)確樣本I 或 II 的測試濃度，i為測試次數(shù)，T為準(zhǔn)確度樣本 I 或準(zhǔn)確度樣本 II 溯源后的標(biāo)定濃度。

(3)最低檢出限

LoD＝LoB＋1.645×SD。其中，LoB＝空白樣本結(jié)果的均值＋1.645×SD1，SD為低值樣本的合并標(biāo)準(zhǔn)差，SD1 為空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)差[10]。

(4)精密度

根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)制定的精密度測試方案(EP5-A2)[11-12]，每天取出 TAT重復(fù)性樣本 I((4.0±0.8)ng/mL)和重復(fù)性樣本II((20.0±4.0)ng/mL)，并測定兩輪，每輪重復(fù) 2次，共測試 20 天，分析并計算試劑的精密度。

(5)臨床樣本相關(guān)性比對

選取覆蓋線性范圍的 249 例臨床枸櫞酸鈉血漿樣本，分別用日本希森美康(Sysmex)的 TAT檢測試劑盒和本試劑進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性和一致性分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 MedCalc、Minitab 19 和 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理和分析，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 抗體與凝血酶、抗凝血酶、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物抗原的親和力

抗體與抗原的 ELISA 實驗結(jié)果顯示(圖1)，實驗條件下，抗體 3B16 與 TAT 抗原的親和力最高，與 T 抗原也有一定的親和力；抗體 8D9 與AT 抗原的親和力最高，其次是 TAT 抗原，與 T抗原沒有親和力。

圖1 抗體與 TAT、AT、T 抗原的親和力測試Fig.1 The aきnity tests of the antibody to TAT, antithrombinⅢ and thrombin

3.2 凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物檢測反應(yīng)體系的優(yōu)化

如圖2 所示，磁珠濃度從 0.20 g/L 提高到0.30 g/L 的過程中，隨著磁珠濃度的升高，信噪比從 25 下降至 21 后保持穩(wěn)定；吖啶酯濃度在0.15～0.25 mg/L 范圍內(nèi)，信噪比隨著吖啶酯抗體濃度的提高而升高；樣本量對信噪比及其斜率的影響最大，在 50 μL 時達(dá)到最大信噪比 28。

圖2 磁珠濃度、吖啶酯標(biāo)記抗體濃度和樣本量與信噪比的主效應(yīng)圖Fig.2 The effect of magnetic beads concentration,acridinium labeled antibody conjugate concentration and sample value on RSN

3.3 孵育時間的優(yōu)化

采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系，設(shè)置不同的孵育時間，對校準(zhǔn)品稀釋液(S0)、經(jīng)過希森美康測定的高值(H)和低值(L)兩個血漿樣本進(jìn)行測定。首先將樣本和磁珠捕獲抗體進(jìn)行孵育，清洗后，再與吖啶酯標(biāo)記抗體孵育。結(jié)果如圖3 所示，分別提高樣本與捕獲抗體的孵育時間或與檢測抗體的孵育時間，本底 S0的信號值(593～624)和低值樣本 L 的信號值(10 572～11 351)均沒有顯著性變化(P＞0.05)。在孵育時間為 7 min-5 min 時，樣本的發(fā)光值(relative light unit，RLU)最大。分別計算不同孵育時間下低值樣本的信噪比RSN,L，5 min-5 min，7 min-5 min、5 min-7 min 的RSN,L分別為 17.8、18.2、17.5。

圖3 孵育時間對反應(yīng)信號和信噪比的影響Fig.3 The effect of incubation time on RLU and RSN,L

3.4 線性范圍

將接近 120 ng/mL 的 TAT 樣本稀釋成 5 個濃度梯度，稀釋液為低于 0.4 ng/mL 的 TAT 樣本。測定稀釋的樣本并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，相關(guān)系數(shù)(r)為 0.998。

3.5 分析特異性測試

分別對含有 0.20 g/L 的人凝血酶原和 0.31 g/L的抗凝血酶 Ⅲ 的樣本進(jìn)行測定，測試結(jié)果(如表1)低于檢出限(0.4 ng/mL)。

表1 凝血酶原和抗凝血酶分析特異性測試Table 1 The specificity test of prothrombin and antithrombin

表1 凝血酶原和抗凝血酶分析特異性測試Table 1 The specificity test of prothrombin and antithrombin

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3.6 準(zhǔn)確度

測定經(jīng)過溯源的準(zhǔn)確度樣本 I 和準(zhǔn)確度樣本 Ⅱ，測量濃度和標(biāo)定濃度之間的相對偏差分別為－2.8%～3.5% 和－7.3%～－0.1%(表2)，在±8% 以內(nèi)。

表2 準(zhǔn)確度測試Table 2 Accuracy testing

3.7 精密度

分別對重復(fù)性樣本 I 和重復(fù)性樣本 Ⅱ 連續(xù)測試 20 d，結(jié)果表明，試劑的精密度良好，批內(nèi)不精密度在 5% 以下，總不精密度也控制在 10% 以內(nèi)(如表3 所示)。

表3 精密度測試Table 3 Precision testing

3.8 與參比試劑的相關(guān)性比對

使用本試劑和日本希森美康 TAT 檢測試劑盒對 249 例樣本分別進(jìn)行平行測定，采用Passing-Bablok 回歸分析本試劑和希森美康試劑的一致性(如圖4)，經(jīng)計算r＝0.993。

圖4 本試劑與希森美康 TAT 檢測試劑的相關(guān)性Fig.4 Correlation between this kit and TAT kit of Sysmex

經(jīng) Bland-Altman 圖分析，納入統(tǒng)計分析的249 例樣本中，有 12 例超出了均值 ±1.96SD，即有 95.2% 的樣本測試結(jié)果絕對偏差位于一致性界限內(nèi)。

4 討 論

TAT 是凝血與抗凝血相互作用的產(chǎn)物，TAT水平體現(xiàn)了體內(nèi)的凝血酶變化，進(jìn)而反映機體的凝血狀態(tài)。在臨床中，TAT 聯(lián)合血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin，TM)、纖溶酶-α2-抗纖溶酶抑制劑復(fù)合物(plasmin antiplasmin complex，PIC)和組織型纖溶酶原激活物-纖溶酶原激活抑制物-1 復(fù)合物構(gòu)成新血栓四項。新血栓四項為凝血、纖溶和血管內(nèi)皮損傷的分子標(biāo)記物，它們的檢測對多種血栓性疾病的診斷具有重要意義，如DIC[13-14]、腦梗死[15]、膿毒癥[16]等，且能夠預(yù)示一些疾病的發(fā)展，如非小細(xì)胞肺癌[17]、急性缺血性腦卒中[4]等。

根據(jù) TAT 和 TM 的聯(lián)合檢測結(jié)果，可以對DIC 進(jìn)行分期[18]。根據(jù)血液凝固性出血和纖溶情況，DIC 可分為高凝期、消耗性低凝期和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)期。隋艷芬[18]的研究表明，TAT 和 TM的水平與 DIC 的分期正相關(guān)，DIC 患者血漿中的TAT 和 TM 水平均高于健康人，繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)期 DIC 患者的 TAT 和 TM 水平均最高，其次是消耗性低凝期和高凝期。研究表明，非顯性 DIC患者的 TAT 水平為正常參考范圍的 5 倍以上，而常規(guī)凝血指標(biāo)凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血時間、纖維蛋白原、血小板計數(shù)則保持在正常范圍內(nèi)，表明通過 TAT 水平監(jiān)測凝血狀態(tài)的靈敏度高于傳統(tǒng)凝血檢測項目[19-20]。張錦麗等[21]在研究急性腦梗死時也有類似發(fā)現(xiàn)，其研究結(jié)果表明，急性腦梗死患者的凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血時間沒有顯著性變化，而 TAT 水平顯著提高。TAT 和 D 二聚體水平和凝血指標(biāo)聯(lián)檢有助于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的早期診斷和病情發(fā)展情況判斷[22]。Lundbech 等[23]的研究表明，局限性癌癥患者血漿中的 TAT 和人凝血酶原片段(F1＋2)的含量顯著提高，TAT 和 F1＋2 水平可以作為判定癌癥患者高凝狀態(tài)的指標(biāo)。Masago 等[17]在研究晚期非小細(xì)胞肺癌時發(fā)現(xiàn)，低的 PIC 和 TAT 的比值，以及低的蛋白 S 活性預(yù)示著不良預(yù)后。

目前，希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司在我國臨床 TAT 檢測中占據(jù)了較大的市場份額。本研究以 TAT 為免疫原制備 TAT 抗體，通過試劑配方和反應(yīng)體系的優(yōu)化，以日本希森美康公司的TAT 檢測試劑盒為參比試劑，制備 TAT 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測試劑盒。

通過 ELISA 實驗對篩選得到的抗體進(jìn)行親和力測定，ELISA 實驗結(jié)果表明，抗體 3B16與 TAT 抗原的親和力最高，抗體 8D9 與 AT 抗原的親和力最高(圖1)。在正常人血漿中，AT和凝血酶原的濃度分別為 0.20～0.30 mg/mL 和0.15～0.20 mg/mL，遠(yuǎn)大于機體在“出血-凝血”平衡狀態(tài)下產(chǎn)生的 TAT。傳統(tǒng)的 TAT 檢測方法采用 AT 抗體和 T 抗體與 TAT 形成“T 抗體-TAT-AT 抗體”雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。為了避免血液中高濃度的 AT 和凝血酶原對 TAT 測試的干擾，本研究以抗體 3B16(TAT 抗體)為捕獲抗體，與樣本中的 TAT 抗原結(jié)合，清洗除去樣本中的 AT 抗原和凝血酶原，然后再與吖啶酯標(biāo)記的抗體 8D9(AT 抗原的抗體)孵育，形成“TAT 抗體-TAT-AT 抗體”的結(jié)構(gòu)，這將在很大程度上減少血漿中 AT 單體和凝血酶原的干擾。用本試劑分別測定含有 0.31 mg/mL 的 AT 和 0.20 mg/mL的凝血酶原的樣本，測定結(jié)果小于 0.2 ng/mL，表明正常人血漿中的 AT 和凝血酶原對本試劑進(jìn)行 TAT 的定量測定無影響。

靈敏度是評估體外診斷試劑性能的重要指標(biāo)，分析靈敏度是待測物可檢測到的最低濃度。反應(yīng)的樣本量、抗體濃度影響試劑的靈敏度，因而需要對其進(jìn)行優(yōu)化。本研究通過正交實驗優(yōu)化反應(yīng)的樣本量、磁珠工作液濃度和吖啶酯標(biāo)記抗體的濃度。結(jié)果表明(圖2)，樣本量對信噪比的影響最大，在樣本量為 10～50 μL 之間，隨著樣本量的提高，信噪比明顯提高。在吖啶酯抗體濃度為 0.15～0.25 mg/L 范圍內(nèi)，隨著吖啶酯濃度的提高，信噪比小幅度提高。當(dāng)磁珠濃度為0.20 g/L 時，信噪比最高，隨著磁珠濃度提高至0.30 g/L，信噪比逐漸降低，后趨于穩(wěn)定。信噪比是樣本信號值與校準(zhǔn)品稀釋液信號值之比，可初步反映試劑的靈敏度。樣本的信噪比越高，即樣本信號值與本底(校準(zhǔn)品稀釋液的發(fā)光值)的拉開程度越大，發(fā)光值波動對濃度值的測定影響越小，試劑準(zhǔn)確度和靈敏度越高。在樣本量為50 μL、磁珠工作液濃度為 0.20 g/L、吖啶酯抗體標(biāo)記物工作液濃度為 0.25 mg/L 的條件下，測定試劑的最低檢出限，測定結(jié)果 ≤0.4 ng/mL，與參比試劑希森美康 TAT 檢測試劑盒的檢出限(LoD≤0.4 ng/mL)相當(dāng)，因而沒有繼續(xù)提高樣本量和吖啶酯抗體的濃度。

化學(xué)發(fā)光免疫分析的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)時的孵育時間影響發(fā)光值，進(jìn)而影響試劑的性能，因此對孵育時間進(jìn)行優(yōu)化。分別延長第一步和第二步的反應(yīng)時間，低值樣本的信號值無顯著性差異(P＞0.05)，當(dāng)孵育時間為5 min-5 min 時，樣本的信噪比較高且測試時長較短，較短的測試時間可以提高檢測通量，因而選擇孵育時間為 5 min-5 min。

通過希森美康 HISCL 5000 測量程序?qū)π?zhǔn)品進(jìn)行量值溯源，4 參數(shù)擬合得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的r為 0.999，本試劑與希森美康試劑的性能比對如表4 所示，LoB≤0.20 ng/mL，檢出限LoD≤0.40 ng/mL，試劑在 0.40～120 ng/mL 內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)為 0.998。對溯源至希森美康 HISCL 5000的準(zhǔn)確度樣本 I 和 Ⅱ 進(jìn)行測定，相對偏差分別為－2.8%～3.5% 和－7.3%～－0.1%，試劑的準(zhǔn)確度在 ±8% 的范圍內(nèi)，滿足臨床要求，為后續(xù)試劑進(jìn)行臨床比對提供有力的支撐。

表4 本試劑與希森美康試劑的性能比對Table 4 Comparison of the performance of Sysmex with our study

采用本方法和日本希森美康的 TAT 檢測試劑盒對 249 例臨床樣本進(jìn)行測試，將本研究的檢測結(jié)果與希森美康參比試劑進(jìn)行相關(guān)性分析，r＝0.993，表明本試劑與希森美康參比試劑的測值相關(guān)性良好。經(jīng)過 Bland-Altman 統(tǒng)計分析(圖4(b))，納入統(tǒng)計分析的 249 例樣本中，有12 例超出了均值 ±1.96SD，即有 95.2% 的樣本測試結(jié)果絕對偏差位于一致性界限內(nèi)，認(rèn)為本試劑與希森美康參比試劑的檢測結(jié)果一致。

抗原、抗體、酶、引物等核心原料是體外診斷試劑的核心壁壘，原材料的高質(zhì)量發(fā)展是實現(xiàn)體外診斷試劑進(jìn)口替代的根本途徑。我國體外診斷試劑原料大部分依賴進(jìn)口，2020 年的進(jìn)口原料占比接近 90%[24]。國外原料一旦斷供，將給中國生命科學(xué)的發(fā)展帶來極大風(fēng)險。此外，我國人口老齡化日趨嚴(yán)重，醫(yī)療保健服務(wù)面臨的壓力也日益增大，體外診斷試劑的國產(chǎn)化將降低國民醫(yī)療成本，有利于社會的穩(wěn)定發(fā)展。本研究開發(fā)的TAT 抗體以及 TAT 檢測試劑為生物試劑的國產(chǎn)化建設(shè)奠定了基礎(chǔ)。

5 結(jié)論與展望

本研究建立了 TAT 化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法，與含有凝血酶原(0.20 mg/mL)和抗凝血酶 Ⅲ(0.31 mg/mL)的樣本沒有交叉反應(yīng)。本試劑與參比試劑日本希森美康的 TAT 檢測試劑盒的測值相關(guān)性較高(r＞0.95)，在靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度和特異性方面表現(xiàn)較好，未來或許可以作為希森美康 TAT 檢測試劑盒的替代。

目前，TAT 檢測主要開設(shè)于醫(yī)院的檢驗科，樣本類型為枸櫞酸鈉血漿。胸痛中心、卒中中心以及 ICU 的患者常常需要進(jìn)行 TAT 檢測，以判斷患者的凝血狀態(tài)。如果 TAT 試劑盒可以支持全血檢測及床旁檢測，則可幫助醫(yī)生快速判斷患者的病情，為患者爭取寶貴的時間。未來可以對全血樣本的 TAT 檢測進(jìn)行可行性研究。