申雪峰 趙帥男 柳孜俐 陳培華 孫堅(jiān)原,2*

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院腦認(rèn)知與腦疾病研究所 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在認(rèn)知[1]、學(xué)習(xí)記憶[2]、神經(jīng)發(fā)育[3]等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。在生理?xiàng)l件下，谷氨酸在腦內(nèi)的濃度及分布均受到了嚴(yán)格的調(diào)控。胞漿中的谷氨酸濃度為 1～10 mmol·L－1[4]，囊泡中的濃度則大于 0.1 mol·L－1[5]。經(jīng)囊泡釋放到突觸間隙的谷氨酸濃度可在幾毫秒內(nèi)迅速升至約 1 mmol·L－1，之后通過神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體得到快速清除[6]，使胞外谷氨酸濃度保持在 μmol·L－1水平[4]。而在病理?xiàng)l件下，特別是在一些嚴(yán)重的神經(jīng)疾病，如腦卒中[7]、腦瘤[8]、神經(jīng)退行性疾病[9]、藥物難治性癲癇等[10-11]的發(fā)病過程中，神經(jīng)細(xì)胞的氧化磷酸化與腺嘌呤核苷三磷酸生成受到阻滯，引發(fā)細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度失衡，進(jìn)而抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的再攝取。滯留在胞外的過量谷氨酸導(dǎo)致神經(jīng)元上的谷氨酸受體過度活化，通過 N-甲基-D-天冬氨酸和電壓門控鈣通道引發(fā)大量 Ca2＋內(nèi)流，最終導(dǎo)致 Ca2＋過載引起神經(jīng)元死亡，這一機(jī)制即神經(jīng)興奮毒性[12-15]。

神經(jīng)興奮毒性被廣泛認(rèn)為是腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生腦細(xì)胞損傷的主要原因。以往的實(shí)驗(yàn)顯示：神經(jīng)元在谷氨酸濃度為 20 μmol·L－1的溶液中很難存活超過 24 h[16]。在缺血性腦卒中病灶內(nèi)，谷氨酸濃度甚至可驟升至 100 μmol·L－1以上[17]，這將對(duì)腦細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。此外，神經(jīng)興奮毒性常伴隨著氧化應(yīng)激、炎癥等一系列變化[12]。雖然在體外實(shí)驗(yàn)中使用 N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷劑等起到緩解過量谷氨酸引起的神經(jīng)興奮毒性[18]。但是，近年來的臨床研究顯示：在腦卒中等疾病的病程中使用谷氨酸受體阻斷劑并不能起到預(yù)想的治療效果[19]。更多的研究顯示，源于 N-甲基-D-天冬氨酸受體過度激活途徑的神經(jīng)興奮毒性作用在疾病發(fā)病的初期最為關(guān)鍵；而胞外過量的谷氨酸所導(dǎo)致的能量代謝失衡則是產(chǎn)生疾病后期谷氨酸毒性現(xiàn)象的主要原因[12]。上述研究說明，在以神經(jīng)興奮毒性為靶點(diǎn)的神經(jīng)疾病治療中，仍有很多疑點(diǎn)待解開。因此，針對(duì)上述腦疾病產(chǎn)生的神經(jīng)興奮毒性的特性、程度與范圍等特征，以及其與其他腦損傷途徑的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測評(píng)估，對(duì)制定合理有效的治療方案、腦保護(hù)策略以及研發(fā)新藥等都具有重要意義。

在臨床上，計(jì)算機(jī)斷層成像[20]、磁共振成像[21]和多普勒超聲[22]等醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)常用于揭示腦卒中等嚴(yán)重神經(jīng)疾病的病變部位和性質(zhì)，但不適用于對(duì)神經(jīng)興奮毒性現(xiàn)象進(jìn)行快速直接的觀測。目前，可用于谷氨酸檢測的技術(shù)手段包括高效液相色譜[23]、熒光探針顯微成像[24]、毛細(xì)管電泳法[25]與電化學(xué)技術(shù)[26]等。高效液相色譜法基于被測物質(zhì)與色譜柱中固定相的差異性相互作用獲得特征峰信號(hào)，由此可精確分析成分類型及含量[27]；同時(shí)，憑借其較強(qiáng)的安全性，已在臨床研究中得到應(yīng)用[23]。但其時(shí)間分辨率僅為分鐘級(jí)，且其采樣針尖端尺寸通常在亞毫米級(jí)，因此，探測區(qū)域只能在組織層面[28-29]，難以用于微觀檢測分析。適用于檢測谷氨酸的熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)主要得益于可與遞質(zhì)選擇性結(jié)合的遺傳性熒光探針的開發(fā)[30]。該技術(shù)基于激光共聚焦顯微成像原理，具有較高的空間分辨率，且成像采樣頻率可下探至約十毫秒級(jí)[30]，可用于同時(shí)檢測多個(gè)突觸的活動(dòng)。但缺乏有效的濃度標(biāo)定方法，目前只能定性或半定量分析局部的遞質(zhì)水平變化。此外，遺傳性熒光探針難以在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)，且存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，尚不適合臨床應(yīng)用。毛細(xì)管電泳法是利用離子在電場作用下遷移速度的不同對(duì)組分進(jìn)行分離和分析的方法，具有分離效率高和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，可用于單細(xì)胞水平的痕量分析[31]，并已應(yīng)用于臨床患者腦脊液中谷氨酸等成分的檢測分析[32-33]。但其時(shí)間分辨率在分鐘級(jí)(甚至更長)[34-35]，因而不適用于遞質(zhì)釋放等現(xiàn)象的觀察。相對(duì)而言，電化學(xué)技術(shù)對(duì)谷氨酸的選擇性和靈敏度均較高，且響應(yīng)迅速，時(shí)間分辨率可達(dá)毫秒級(jí)，可用于快速精準(zhǔn)測定神經(jīng)興奮毒性的程度變化；電化學(xué)傳感器具有微型化優(yōu)勢，可在多種環(huán)境下進(jìn)行記錄，實(shí)現(xiàn)自宏觀的活體腦水平至微觀的細(xì)胞水平的全面而深入的探索[36]；檢測方便快捷，可與電生理記錄等技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)的同步檢測，有助于研究谷氨酸與其他腦損傷途徑之間的聯(lián)系；此外，電化學(xué)技術(shù)檢測谷氨酸對(duì)設(shè)備的要求相對(duì)較低，成本相對(duì)低廉，易于推廣?；谏鲜鰞?yōu)勢，電化學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為時(shí)下谷氨酸檢測研究的重要手段[6]。本文對(duì)適用于神經(jīng)興奮毒性評(píng)估的谷氨酸傳感電化學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 谷氨酸電化學(xué)檢測的工作原理進(jìn)展

2.1 酶基檢測原理

與單胺類遞質(zhì)和抗壞血酸等具有較強(qiáng)氧化還原特性的電化學(xué)活性物質(zhì)相比，呈電化學(xué)惰性的谷氨酸很難用一般的電化學(xué)方法直接檢測到。因此，谷氨酸電化學(xué)檢測通常涉及生物酶的應(yīng)用。目前，使用最廣泛的生物酶是谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase，GluOx)。在該酶作用下，谷氨酸可被氧化，并產(chǎn)生電化學(xué)活性較強(qiáng)的中間產(chǎn)物 H2O2，后者作為報(bào)告分子可在施加一定電壓的電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的電子可被電極監(jiān)測到(如圖1(a)所示)[6]。由于所測得的H2O2信號(hào)幅值與反應(yīng)底物谷氨酸濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，因此可通過定標(biāo)推算出測試液中的谷氨酸濃度[37]。

圖1 酶基谷氨酸傳感器的檢測原理Fig.1 Sensing principles of enzyme-based glutamate sensors

近年來，納米科技的蓬勃發(fā)展使大量可供生物傳感使用的納米材料涌現(xiàn)[38]。以碳納米管、氧化石墨烯等為代表的碳基納米材料表面具有大量的功能活性基團(tuán)[39]，與等量微米或毫米材料相比，具有更多的金屬納米顆粒的錨定位點(diǎn)[40-41]，有助于特定形態(tài)納米復(fù)合物的生長[42]。使用金屬納米顆粒制備的電極表面比等質(zhì)量普通金屬電極表面提供更多的活性位點(diǎn)，極大地提高反應(yīng)效率[43]。使用單一納米材料[44]或者多種材料整合成的納米復(fù)合物[45]可使傳感器的靈敏性、選擇性、響應(yīng)時(shí)間等技術(shù)參數(shù)均得到大幅改善。2010 年，Jamal 等[46]將鉑納米顆粒與 GluOx 一同裝載于金納米線陣列上，顯著增強(qiáng)了電極對(duì) H2O2的檢測能力，制成了線性傳感范圍為 0.02～20 mmol·L－1，檢出限為 1.0 μmol·L－1的酶基谷氨酸傳感器。2017年，Dalkiran 等[47]將 Co3O4、石墨烯與殼聚糖制成的納米復(fù)合物修飾于玻碳電極表面，發(fā)現(xiàn)該方法可顯著增強(qiáng) GluOx 對(duì)谷氨酸的親和性。2019 年，Maity 等[48]將固定 GluOx 的鉑納米顆粒修飾到玻碳電極表面的多壁碳納米管上，獲得較快的電極響應(yīng)(3 s)，線性范圍為 10～100 μmol·L－1，檢出限低至 0.88 μmol·L－1，適于神經(jīng)興奮毒性檢測。

然而，報(bào)告分子 H2O2的氧化峰電位相對(duì)較高(＋0.6～＋0.8 V)。在該電勢下，腦內(nèi)廣泛存在的抗壞血酸、尿酸，以及在記錄區(qū)可能共存的其他遞質(zhì)均會(huì)干擾谷氨酸檢測的特異性和準(zhǔn)確性。為了解決這一難題，近年來已發(fā)展出多種方法。其中，最常用的是干擾物隔離方法，即利用表面負(fù)電荷互斥或聚合物材料孔隙限制等原理，用特異性隔絕膜對(duì)上述生物活性物質(zhì)進(jìn)行選擇性隔離[37]。此外，可以采用自參比記錄方法。這一方法通常需借助微電極陣列來完成，通過將酶涂層記錄位點(diǎn)記錄的電流減去無酶對(duì)照位點(diǎn)記錄的電流，可獲得去除了干擾的谷氨酸信號(hào)[49]。為了進(jìn)一步增強(qiáng)抗干擾性能，自參比記錄方法也可聯(lián)合隔絕膜[50]。這一方法的優(yōu)勢在于不僅可以去除抗壞血酸等物質(zhì)的干擾，還可以將疾病產(chǎn)生的包括 H2O2在內(nèi)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物(非谷氨酸酶催化來源的 H2O2)干擾去除，是目前在體電化學(xué)檢測谷氨酸的重要記錄方法[51]。除以上兩個(gè)方法之外，還有改良電極表面修飾物方法。有些學(xué)者在引入谷氨酸氧化酶之前，在電極表面修飾作為氧化還原介體的普魯士藍(lán)[52]或鋨氧化還原聚合物[53]介導(dǎo)H2O2的還原反應(yīng)。在谷氨酸檢測時(shí)，工作電勢可設(shè)定在 0 V，甚至負(fù)電勢，傳感器的谷氨酸選擇性得到增強(qiáng)，這一類電極稱作第二代傳感器(如圖1(b)所示)[26]。也有報(bào)道通過碳納米管與納米金顆粒的聯(lián)用將 GluOx 工作產(chǎn)生的電子直接傳遞給電極，而無須經(jīng)由報(bào)告分子。這一類電極被稱作第三代傳感器(如圖1(c)所示)[54]。

綜上，基于 GluOx 發(fā)展的酶基谷氨酸傳感器及其檢測方法已較為成熟，適用于生理?xiàng)l件和一般病理?xiàng)l件下的谷氨酸電化學(xué)檢測。然而，谷氨酸在 GluOx 作用下的氧化過程需要 O2的參與[37]，而缺血性腦卒中等疾病所產(chǎn)生的局部缺氧環(huán)境顯然對(duì)該反應(yīng)不利[55]，在一定程度上可能會(huì)影響谷氨酸檢測的準(zhǔn)確性，從而造成結(jié)果偏低的情況。因此，Andreescu 實(shí)驗(yàn)室在 2014 年嘗試將具有氧轉(zhuǎn)移能力的 CeO2納米顆粒嵌入到電極表面的殼聚糖基質(zhì)中，并發(fā)現(xiàn)該方法可使 GluOx 涂膜鉑電極在無氧環(huán)境中對(duì)谷氨酸的靈敏度仍能保持在有氧環(huán)境中的 80% 左右，檢出限可保持在有氧環(huán)境的 2 倍左右[56]。但這一方法仍無法完全擺脫對(duì) O2的依賴[57]，因此，在不同程度的缺氧條件下所得到的谷氨酸檢測結(jié)果缺乏可比性。為了從根本上解決這一問題，其他以谷氨酸為底物且無須 O2參與氧化過程的生物酶也開始進(jìn)入人們的視野。其中，較早得到研究的生物酶是谷氨酸脫氫酶[58]。但其缺點(diǎn)是在檢測過程中需要輔酶NADP＋的參與，這不僅增加了檢測的復(fù)雜性，也在一定程度上增加了研究成本。2018 年，中國科學(xué)院化學(xué)研究所的毛蘭群研究組發(fā)現(xiàn)鐵氧化還原蛋白依賴的谷氨酸合成酶的逆反應(yīng)可用于測定谷氨酸，該過程不依賴 O2，也無須輔酶參與，線性范圍為 1～20 μmol·L－1，適用于痕量谷氨酸的檢測[59]。這一新酶的發(fā)現(xiàn)為電化學(xué)檢測谷氨酸領(lǐng)域提供了一種全新的思路，有望在不遠(yuǎn)的未來應(yīng)用于新型谷氨酸傳感器的制備。

2.2 非酶檢測原理

酶基谷氨酸傳感器是當(dāng)下谷氨酸檢測研究中的主要工具，由于涉及的生物酶——GluOx 是目前市面上價(jià)格最高的酶之一，導(dǎo)致酶基傳感器的成本居高不下。近年來，納米技術(shù)的興起推動(dòng)了以新型納米材料為傳感元件的非酶檢測技術(shù)，已成為近年來替代酶基傳感技術(shù)的熱點(diǎn)方向，并在糖類檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[41,60]。2009年，Heli 等[61]利用銅納米顆粒首次以非酶檢測原理測定了線性范圍為 100～1 000 μmol·L－1的谷氨酸含量，檢出限為 30 μmol·L－1。2013 年，Jamal 等[62]發(fā)現(xiàn)鎳納米線陣列電極也可用于檢測谷氨酸，線性范圍為 0.5～8.0 mmol·L－1，檢出限為 135 μmol·L－1。上述檢測方法的基本原理是堿性溶液中的銅或鎳等金屬納米材料可在特定的電勢條件下形成具有極強(qiáng)氧化活性的高價(jià)態(tài) Cu(III)[63]或 Ni(III)[64]，從而對(duì)氧化還原電位較高的有機(jī)物進(jìn)行氧化。與 GluOx 不同的是，上述非酶檢測過程無須 O2，適用于缺氧條件下的谷氨酸檢測；此外，由于不需要生物酶，因此使得非酶傳感器的整體造價(jià)比較便宜。

然而，至今尚缺乏可供在組織或細(xì)胞水平使用的谷氨酸非酶傳感器。究其原因，主要為三點(diǎn)。第一，較差的選擇性。銅納米顆粒除了能夠檢測到谷氨酸之外，對(duì)賴氨酸等其他類型氨基酸也有響應(yīng)[61]。鎳納米線對(duì)抗壞血酸與尿酸的抗干擾性能較好，但無法較好地區(qū)分谷氨酸與葡萄糖[62]，而在腦中，葡萄糖濃度[65]顯著高于谷氨酸[4]，因此成為該方法的主要干擾物。第二，傳感器的濃度檢測范圍不適用于生物環(huán)境。神經(jīng)興奮毒性狀態(tài)下的胞外谷氨酸濃度最高可升至100 μmol·L－1[17]，但也只是探及上述非酶電極的檢測范圍下限。第三，檢測環(huán)境要求為強(qiáng)堿性。這一要求使得上述電極均無法在活體條件下對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行直接檢測。雖然非酶檢測技術(shù)應(yīng)用于中樞谷氨酸遞質(zhì)的檢測仍面臨很多問題，但隨著納米材料的發(fā)展，相信不遠(yuǎn)的將來可實(shí)現(xiàn)具有良好實(shí)用性的谷氨酸非酶檢測技術(shù)。

2.3 受體介導(dǎo)檢測原理

受體介導(dǎo)谷氨酸檢測技術(shù)的概念最早由Maeda 等[66]于 1995 年提出。首先，他們用一根玻璃微電極通過“外面向外”膜片鉗技術(shù)獲取一張含有谷氨酸受體的錐體細(xì)胞膜膜片。然后，將該玻璃微電極靠近所要記錄的細(xì)胞表面，當(dāng)細(xì)胞釋放的谷氨酸與電極尖端膜片上的谷氨酸受體結(jié)合后，受體通道開放產(chǎn)生電流，從而記錄到谷氨酸的釋放信號(hào)。與上述的酶基與非酶谷氨酸檢測方法相比，該技術(shù)雖然適用于單細(xì)胞研究，但其制備工藝與操作較復(fù)雜，后續(xù)報(bào)道少見。2019年，Li 等[67]在以還原性氧化石墨烯為基礎(chǔ)的場效應(yīng)晶體管上固定了代謝性谷氨酸受體，并將分離的海馬神經(jīng)元也培養(yǎng)到同一場效應(yīng)晶體管上。當(dāng)神經(jīng)元釋放的谷氨酸與所固定的受體結(jié)合時(shí)，即可產(chǎn)生電流信號(hào)。這一方法的靈敏度極高，谷氨酸的檢測范圍為 0.001～100 pmol·L－1，檢出限低至 10 fmol·L－1，且響應(yīng)迅速。而通過在針灸針或柔性材料等基底上構(gòu)建場效應(yīng)晶體管傳感器，該技術(shù)可用于活體動(dòng)物腦內(nèi)遞質(zhì)的檢測，具有較好的發(fā)展前景[68-70]。

3 谷氨酸傳感器的設(shè)計(jì)與制備工藝進(jìn)展

3.1 工作電極的設(shè)計(jì)

以最常見的酶基谷氨酸傳感器為例，其工作電極的基本結(jié)構(gòu)可大體分為[71]：記錄電極(通常為貴金屬或碳基材料)、酶涂層和隔絕膜涂層。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可將工作電極的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)分為三類。第一，用于活體記錄的埋植電極。多為經(jīng)光刻[72]或印刷技術(shù)[73]加工而成的微電極陣列，其基底為陶瓷片或硅片，方便插入腦組織中，且損傷較小，可同時(shí)記錄多個(gè)空間位置的谷氨酸信息[51]。第二，用于檢測胞外提取液的電極，多與微透析管配合[74]。該類電極無須與腦組織接觸，主要采用平面記錄槽樣結(jié)構(gòu)，當(dāng)提取液通過引流管流經(jīng)平面電極表面時(shí)進(jìn)行檢測[75]。第三，用于細(xì)胞水平記錄的微電極。常采用微米級(jí)碳纖維電極，借助微操縱器可將其移動(dòng)至感興趣的細(xì)胞或神經(jīng)末梢附近，以記錄谷氨酸釋放信號(hào)[76]。這一類傳感器的適用范圍較廣，稍作改良也可在前兩類的應(yīng)用場景中使用[52]。

上述工作電極多采用電導(dǎo)聯(lián)方式將檢測信號(hào)經(jīng)金屬導(dǎo)線傳遞至記錄設(shè)備。近年也發(fā)展出可通過藍(lán)牙傳輸信號(hào)的無線型電化學(xué)傳感器[77]，可對(duì)自由活動(dòng)狀態(tài)下的動(dòng)物模型或患者開展實(shí)時(shí)電化學(xué)檢測，有助于研究人員獲得更接近生理?xiàng)l件下的信息，具有較好的應(yīng)用前景。

3.2 適用于多目標(biāo)同步檢測的傳感器設(shè)計(jì)

神經(jīng)興奮毒性在諸多嚴(yán)重腦疾病的發(fā)病過程中并非獨(dú)立出現(xiàn)，常伴隨著氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等一系列變化[12]。這意味著在對(duì)患者或疾病動(dòng)物模型的腦損傷情況進(jìn)行綜合評(píng)估時(shí)，僅采用單一的谷氨酸檢測是不全面的。因此，近年來，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)開始嘗試對(duì)谷氨酸與其他物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合檢測，或?qū)㈦娀瘜W(xué)技術(shù)與其他研究手段(如電生理技術(shù)、光遺傳學(xué)技術(shù))相結(jié)合，以期對(duì)疾病的發(fā)病與治療過程進(jìn)行更為綜合深入的研究。

目前，針對(duì)多物質(zhì)同步檢測的設(shè)計(jì)可分為三類。第一，兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立傳感器的聯(lián)用。2019年，Zhao 等[78]首次將酶基谷氨酸傳感器與全固態(tài) Ca2＋選擇性微電極聯(lián)用，在缺血模型上同步記錄到了因血管夾閉引起的紋狀體、海馬與皮層等處谷氨酸濃度的緩慢上升與 Ca2＋含量的迅速下降。第二，微電極陣列的應(yīng)用。憑借微電極陣列的多個(gè)記錄位點(diǎn)，可以完成谷氨酸與其他生物活性物質(zhì)的同步記錄[79]?；诠饪碳夹g(shù)的微電極陣列制備工藝已較為成熟，位點(diǎn)間距可以控制在30～50 μm，因而可確保多個(gè)記錄位點(diǎn)都集中在同一核團(tuán)中，有利于對(duì)核團(tuán)的生理功能進(jìn)行綜合解讀。第三，基于同一根工作電極，利用不同活性物質(zhì)(包括報(bào)告分子)在電極表面獨(dú)特的氧化還原特性[80]，使用快相循環(huán)伏安法等電化學(xué)方法進(jìn)行同步監(jiān)測[77]。可以預(yù)見，通過將該檢測策略與微電極陣列結(jié)合，可以極大地?cái)U(kuò)展所能檢測的物質(zhì)種類和信號(hào)類型。

對(duì)電化學(xué)傳感器進(jìn)行改良，制成多功能傳感探頭，可實(shí)現(xiàn)多種研究手段的有機(jī)整合。2018年，Budai 等[81]在同一根玻璃毛坯內(nèi)裝入直徑為9 μm 的碳纖維與直徑為 125 μm 的光纖，制得一種兼具光刺激與電化學(xué)檢測能力的新型傳感器。此外，Lindau 實(shí)驗(yàn)室提出的膜片鉗電化學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)使用單個(gè)記錄探頭對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行電生理與電化學(xué)的同步記錄[82]，但這一方法目前尚難以在神經(jīng)元上進(jìn)行。而經(jīng)改良的微電極陣列也可用于同步記錄谷氨酸電化學(xué)信號(hào)與電生理信號(hào)[83]。

3.3 酶涂膜固定方法

目前，對(duì)第 3.1 小節(jié)中所述第一類與第二類電極進(jìn)行酶涂膜固定多采用滴涂法，將含有酶與基質(zhì)的混合液滴加到電極表面，待干燥后完成酶固定[37]。對(duì)第三類電極進(jìn)行酶涂膜固定以蘸取法為主，將電極尖端多次插入含酶的混合液中(另包括交聯(lián)劑和/或基質(zhì))，直至足量的酶黏附于電極表面[52]。隨著研究的深入，出于對(duì)痕量樣品測定的需求，以及期望盡可能減少埋植過程對(duì)腦組織的損傷，傳感器微型化已成為一個(gè)主要趨勢[84]，而這也對(duì)電極表面的酶固定方法提出了更高的要求。

殼聚糖(chitosan)是一類多糖凝膠，因擁有大量氨基基團(tuán)而具有良好的生物相容性，已在多種傳感器的制備工藝中用作酶固定基質(zhì)[85]。2014 年，Shi 等[86]將 GluOx、氧化還原反應(yīng)介體與殼聚糖混合，通過電化學(xué)方法提高微電極陣列表面附近混合溶液的 pH 值，直至超過殼聚糖的 pKa 水平(為 6.3)，最終使得殼聚糖沉淀析出，并將其裹挾的酶分子也一同沉積到電極表面，這顯著提高了酶固定位點(diǎn)的選擇性。交聯(lián)劑是用于促進(jìn)酶與電極表面基質(zhì)緊密連接的材料，常見的交聯(lián)劑包括戊二醛和聚乙二醇二縮水甘油醚。2013 年，Vasylieva 等[87]發(fā)現(xiàn)，以戊二醛(而非 聚乙二醇二縮水甘油醚)為交聯(lián)劑的谷氨酸傳感器可能會(huì)降低 GluOx 的底物選擇性，導(dǎo)致所測的谷氨酸濃度偏高。但同年，Gerhardt 實(shí)驗(yàn)室建議將戊二醛與作為基質(zhì)的小牛血清蛋白混合均勻后再與酶混合，隨后使用該混合液進(jìn)行酶涂膜[88]，而不建議采用各個(gè)組分分開獨(dú)立涂膜的方法[89]。經(jīng)過測試，證明戊二醛影響 GluOx 對(duì)谷氨酸的選擇性主要源于采用了不合理的酶固定方法，而采用建議的方法則可以較好地避免這一問題。

3.4 隔絕膜的使用策略

隔絕膜是傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)高選擇性檢測的重要因素，常用的隔絕膜材料主要包括 Nafion 與聚苯二胺(單體為鄰苯二胺或間苯二胺)[37]。其中，Nafion 通過材料表面積聚的負(fù)電荷來隔離抗壞血酸與尿酸等帶有負(fù)電荷的干擾物，涂膜可通過蘸取法；聚苯二胺主要依靠聚合材料中的孔隙大小來限制尺寸較大的抗壞血酸、多巴胺等物質(zhì)的通過，涂膜需借助電鍍法。需要注意的是，Nafion 涂覆電極在不使用時(shí)需保存在高濕度環(huán)境或液體中，否則，涂層易開裂，無法再起到隔離干擾物的作用。為了確定電化學(xué)測量谷氨酸的最佳隔絕膜材料，2012 年，Westerink 研究組對(duì)常用隔絕膜材料做了一份詳細(xì)的分析研究[90]。在體外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)單一使用聚間苯二胺的電極對(duì)谷氨酸的選擇性最強(qiáng)，對(duì)抗壞血酸、多巴胺、二羥苯乙酸與尿酸均展現(xiàn)出良好的抗干擾特性。此外，也有學(xué)者提出，在電極表面電鍍生成聚鄰苯二胺時(shí)加入小牛血清蛋白，以進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)谷氨酸的選擇性[52,91]。

4 電化學(xué)技術(shù)檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸水平的應(yīng)用進(jìn)展

4.1 檢測樣品的選擇

動(dòng)物疾病模型可以復(fù)制模擬出與患者相似的發(fā)病過程，是電化學(xué)技術(shù)研究神經(jīng)興奮毒性現(xiàn)象和損傷機(jī)制等問題的極佳實(shí)驗(yàn)對(duì)象。通過埋植電極對(duì)活體腦組織直接進(jìn)行電化學(xué)記錄[78]，或通過微透析管將胞外液連續(xù)提取后進(jìn)行體外檢測[92]，是目前電化學(xué)技術(shù)評(píng)估神經(jīng)興奮毒性程度的重要方法。但在體實(shí)驗(yàn)仍具有一些局限，例如：對(duì)于細(xì)胞水平的谷氨酸損傷機(jī)制，以及與其他損傷途徑間的溝通機(jī)制等方面的研究，很難在在體水平開展。因此，也有學(xué)者在腦片或者培養(yǎng)細(xì)胞中通過一些方法模擬特定的神經(jīng)疾病或創(chuàng)傷，如通過創(chuàng)建缺氧缺糖環(huán)境來模擬缺血性腦卒中[93]，從而使用微電極或場效應(yīng)晶體管技術(shù)進(jìn)行記錄。另外，考慮到以埋植電極方式對(duì)人腦谷氨酸水平進(jìn)行檢測具有一定感染風(fēng)險(xiǎn)，也有學(xué)者嘗試對(duì)體液(如血液)中的谷氨酸含量進(jìn)行研究[94]。

4.2 電化學(xué)檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸在生理學(xué)研究中的應(yīng)用

量子化遞質(zhì)釋放是突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放的最主要特征。這一概念由 Katz 等[95]于 20 世紀(jì) 50 年代研究蛙的神經(jīng)肌肉接頭處終板電位時(shí)提出，即突觸信號(hào)以“階躍疊加”方式進(jìn)行編碼，而量子為突觸信號(hào)的基本單位。隨后，Heuser 等[96-97]的電鏡結(jié)果證實(shí)突觸囊泡為量子化釋放的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，說明量子的大小取決于突觸囊泡內(nèi)遞質(zhì)的含量。2019 年，Cans 實(shí)驗(yàn)室對(duì)體外分離純化后獲得的谷氨酸能囊泡進(jìn)行電化學(xué)檢測，測得的谷氨酸量子水平約為 8 000 個(gè)分子[98]。然而，由于囊泡分離過程存在較大的遞質(zhì)丟失概率[5]，因此，該數(shù)值可能顯著偏小。而黃衛(wèi)華實(shí)驗(yàn)室利用鉑納米顆粒修飾工藝和聚乙二醇二縮水甘油醚交聯(lián)固定法，制得 5 μm 直徑的谷氨酸碳纖電極，可用于抵近體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上的神經(jīng)末梢，并進(jìn)行記錄，測得的單個(gè)谷氨酸量子為 126 000 個(gè)分子[99]。精確評(píng)估量子大小對(duì)更好地理解量子化釋放的精細(xì)調(diào)控機(jī)制及其對(duì)神經(jīng)信息處理的影響具有重要生理意義。

4.3 電化學(xué)檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸在疾病研究中的應(yīng)用

腦卒中是目前世界上第二大死亡原因和第三大致殘?jiān)騕100]，并因此成為電化學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。與其他缺血性腦卒中模型相比，十一血管閉塞模型被認(rèn)為可以更好地模擬前腦缺血情況[101]。Caragine 等[101]在這一大鼠模型上將谷氨酸檢測與腦電圖和腦血流記錄聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)血管閉塞后，腦電圖幾乎陷入靜默，腦血流也基本跌至0，而病灶內(nèi)谷氨酸濃度在約 2 min 后開始升高，當(dāng)血管閉塞 5～10 min 后可達(dá) 84～140 μmol·L－1。在再灌注階段可看到腦血流恢復(fù)，甚至超過原有水平，谷氨酸水平緩慢抬升片刻后也開始下降，但腦電圖卻始終處于靜默狀態(tài)[17]，說明已造成明顯的腦功能損傷。

癲癇作為最常見的神經(jīng)疾病之一，在全球范圍內(nèi)約有 5 000 萬患者，以反復(fù)、短暫的癇性發(fā)作或異常的行為、感覺為主要特征。癲癇的具體發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，但究其核心通常認(rèn)為是“興奮/抑制失衡”導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)異常的過度或同步活動(dòng)[102]。Spencer 實(shí)驗(yàn)室在 20 世紀(jì) 90 年代初通過在體微透析采樣聯(lián)合高效液相頻譜方法，首次在顳葉癲癇患者病灶內(nèi)檢測到與癲癇發(fā)作相關(guān)的谷氨酸釋放增強(qiáng)現(xiàn)象[103]。但受限于高效液相頻譜的采樣頻率，癲癇發(fā)作期間，谷氨酸的釋放模式仍不確定。Gerhardt 研究組借助在體谷氨酸電化學(xué)檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予藥物誘發(fā)大鼠局灶性癲癇發(fā)作時(shí)，可在病灶區(qū)出現(xiàn)瞬時(shí)的谷氨酸濃度上升，其后伴隨大量高頻棘突狀谷氨酸釋放信號(hào)[104]。以上研究表明，谷氨酸的高頻釋放現(xiàn)象可能成為癲癇病灶判定的新型標(biāo)記物。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是目前癡呆癥最常見的病因，患者主要表現(xiàn)為持續(xù)的進(jìn)行性智能衰退，而 Tau 蛋白與特征性病理表現(xiàn)之一的神經(jīng)元纖維纏結(jié)密切相關(guān)[105]。近期，有研究顯示，Tau 蛋白可能引起海馬體的過興奮，從而產(chǎn)生 AD 伴發(fā)的癲癇[106]。為證明這一機(jī)制，Reed 研究組在 AD 模型鼠上發(fā)現(xiàn)，P301L Tau 蛋白的表達(dá)可導(dǎo)致齒狀回與海馬 CA3 區(qū)的高鉀溶液刺激誘發(fā)谷氨酸釋放水平分別增高 4 和7 倍，并顯著降低谷氨酸清除效率。而相應(yīng)地，負(fù)責(zé)囊泡谷氨酸填充的囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體含量上升，以及負(fù)責(zé)清除胞外谷氨酸的海馬區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 1 含量下降[107]。而黃衛(wèi)華實(shí)驗(yàn)室則發(fā)現(xiàn)與AD 相關(guān)的 Aβ1-42寡聚體可以顯著降低體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)終末處的谷氨酸能量子水平[108]。以上研究使人們對(duì) Tau 蛋白與 Aβ1-42寡聚體在 AD 發(fā)病過程中的作用有了更深的理解。

5 總結(jié)與展望

近年來，應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸檢測評(píng)估的電化學(xué)技術(shù)在檢測原理、傳感器設(shè)計(jì)與制備以及應(yīng)用等方面都獲得了長足的進(jìn)展。目前，新型納米材料與新型生物酶的開發(fā)以及晶體管技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域的應(yīng)用都大力推動(dòng)了谷氨酸檢測原理的多元化發(fā)展，尤其是以谷氨酸合成酶逆反應(yīng)檢測、非酶檢測以及受體介導(dǎo)檢測等為代表的新方向，有望在不遠(yuǎn)的未來用于下一代谷氨酸傳感器的制備。隨著光刻與印刷技術(shù)的推廣應(yīng)用，以及酶固定與隔絕膜材料使用策略的深入驗(yàn)證，谷氨酸傳感器的制備工藝已得到極大的完善，可在活體腦組織、胞外液與體液，以及細(xì)胞層面進(jìn)行神經(jīng)興奮毒性相關(guān)谷氨酸濃度的檢測。出于對(duì)患者和動(dòng)物疾病模型的病理機(jī)制與治療過程進(jìn)行更為全面深入評(píng)估的需求，將谷氨酸與其他物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合檢測，或?qū)㈦娀瘜W(xué)檢測方法與其他研究手段(如電生理技術(shù)、光遺傳學(xué)技術(shù))相結(jié)合，成為這一領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。基于以上方法學(xué)進(jìn)展，電化學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于嚴(yán)重腦疾病中谷氨酸所致腦損傷的機(jī)制研究。這些研究對(duì)制定合理有效的治療方案、腦保護(hù)策略，以及研發(fā)新藥等領(lǐng)域都具有重大而深遠(yuǎn)的意義。

隨著近年來活體人腦電化學(xué)研究的進(jìn)步，相信谷氨酸電化學(xué)檢測也將于不遠(yuǎn)的將來突破現(xiàn)有的技術(shù)與倫理等方面的限制，而最終應(yīng)用于人腦。這一突破將有利于腦內(nèi)病灶位置的精確判定、神經(jīng)干預(yù)方案的參數(shù)選擇與調(diào)整等方面的發(fā)展。而考慮到臨床電化學(xué)應(yīng)用在安全性、穩(wěn)定性、低損傷性等多方面的要求，未來面向臨床應(yīng)用的谷氨酸電化學(xué)傳感器也需要在材料、制備工藝、微型化、外形設(shè)計(jì)以及相應(yīng)的植入方法等方面作為重要的落腳點(diǎn)，開展新一階段的研發(fā)工作。