蘇兆卿 黎 朝* 鄧玉林*

1(北京理工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)工融合研究院 北京 100081)

2(北京理工大學(xué) 生物醫(yī)藥成分分離與分析北京市重點實驗室 北京 100081)

1 引 言

隨著人類對太空的不斷探索，太空飛行下宇航員的健康問題須得到關(guān)注[1]。微重力作為空間的特殊環(huán)境之一，對宇航員的身體存在著潛在的威脅。研究表明，人體長期處于失重環(huán)境會產(chǎn)生骨丟失[2]、肌肉萎縮[3]、心臟功能減弱[4]和因力的變化而導(dǎo)致的流體相關(guān)問題[5]。因此，研究微重力下人體的損傷機制對宇航員的健康保護(hù)十分重要。細(xì)胞是生物學(xué)中構(gòu)成生物體的基本單位，其增殖、分化、衰老、損傷與人體的生命活動息息相關(guān)[6-7]。線粒體作為細(xì)胞有氧呼吸的主要場所，是細(xì)胞中最重要的細(xì)胞器之一[8]?？缒る娢徊钚纬傻木€粒體膜電位是否穩(wěn)定是線粒體功能是否正常的重要指標(biāo)，其降低或崩潰是細(xì)胞凋亡過程中的重要特征[9]。因此，在模擬微重力(simulated microgravity，SMG)環(huán)境下，對細(xì)胞中線粒體膜電位進(jìn)行多時間點監(jiān)測對了解微重力環(huán)境下人體的損傷機制具有重要意義。

可視化監(jiān)測技術(shù)具有直觀、成本低、操作簡單等優(yōu)點，現(xiàn)已被應(yīng)用于各個領(lǐng)域中的靶向物監(jiān)測[10-11]。其中，熒光成像可視化技術(shù)具有響應(yīng)快速、信噪比高、靈敏度高和非侵入性等優(yōu)點，已成為監(jiān)測活細(xì)胞線粒體膜電位變化的有力方法[12-13]。然而，傳統(tǒng)的熒光探針存在聚集誘導(dǎo)猝滅效應(yīng)，即在固態(tài)或聚集態(tài)下會發(fā)生猝滅，從而導(dǎo)致光穩(wěn)定性差、成像前需要漂洗等不足。模擬微重力實驗具有儀器(雙軸回旋儀)復(fù)雜、監(jiān)測周期長、停止模擬后效應(yīng)恢復(fù)快等缺點，此外，聚集誘導(dǎo)猝滅染料的光穩(wěn)定性差及不免洗等缺點不利于模擬微重力下長期、實時性的成像[14]。2001 年，唐本忠院士課題組發(fā)現(xiàn)了聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission，AIE)現(xiàn)象[15]，即分子在稀溶液中不發(fā)光，在聚集態(tài)下有著很強的熒光[16-17]。近年來，越來越多的線粒體靶向聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針被設(shè)計并開發(fā)出來，為線粒體膜電位的監(jiān)測可視化提供了有力工具[18]。聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)賦予了熒光探針免洗、光穩(wěn)定性高的特點，不僅可以對細(xì)胞的線粒體進(jìn)行長時間的可視化示蹤，還可以在樣品完成模擬微重力后進(jìn)行迅速成像，為及時捕捉微重力效應(yīng)奠定了堅實的基礎(chǔ)[19-23]。

本文用線粒體膜電位聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針 TPEPh-In(TPI)來探究模擬微重力下多時間點的神經(jīng)膠質(zhì)瘤母瘤(U87-MG)細(xì)胞的膜電位變化。TPI 具有線粒體靶向性優(yōu)異、生物相容性好、光穩(wěn)定性高及免洗特性，這些優(yōu)異特性使 TPI 可以對 U87-MG 細(xì)胞進(jìn)行長時間染色，同時，可以在短時間內(nèi)完成樣品線粒體膜電位的成像。此外，針對長時間(＞72 h)模擬微重力時細(xì)胞會因氣泡的剪切力而無法貼壁的問題，本文提出了利用生物基質(zhì)膠培養(yǎng)并保護(hù)細(xì)胞，同時用 TPI 進(jìn)行熒光可視化成像的方法構(gòu)建 AIE 探針-水凝膠 3D 成像體系，以此克服長時間模擬微重力存在的問題。本工作將聚集誘導(dǎo)發(fā)光和空間生命科學(xué)相結(jié)合，為研究細(xì)胞的模擬微重力效應(yīng)提供了有力的方法。

2 材料和方法

2.1 材料與儀器

TPE-Ph-In(TPI)固體粉末從香港科技大學(xué)唐本忠院士課題組獲得。氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)購買于西格瑪奧德里奇(上海)公司，線粒體綠色熒光探針(Mito-Tracker Green，MTG)與四甲基羅丹明甲基酯(tetramethylrhodamine,methyl ester，TMRM)、線粒體電子傳遞鏈抑制劑(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)和胰蛋白酶消化液(體積質(zhì)量為 0.25%)購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。胎牛血清(FBS)購買于德國的 PAN-Biotech GmbH 公司。細(xì)胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)購買于北京索萊寶科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)購買于美國的賽默飛世爾(上海)管理有限公司。生物基質(zhì)膠(Matrigel)購買于美國的康寧公司。

模擬微重力的 SM-31 雙軸回旋儀由中國科學(xué)院空間應(yīng)用工程與技術(shù)中心提供，細(xì)胞培養(yǎng)箱購買于美國的賽默飛世爾科技公司，核磁共振氫譜(1H NMR)由美國的 Bruker AVIII 400 MHz NMR spectrometer 測試，紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜均由英國的 Edinburgh FS5-SS Fluorescence Spectrometer 在室溫下測定，激光共聚焦顯微鏡圖像由日本的 Nikon N-SIM Super-resolution Microscopes 拍攝，細(xì)胞毒性測試所用的酶標(biāo)儀由美國 Biotek 公司的 Cytation 3 提供，細(xì)胞計數(shù)通過美國的 Nexcelom Cellometer Mini Automated Cell Counter 完成。

2.2 實驗方法

2.2.1 TPI 的光物理性質(zhì)

紫外光譜的測定：稱取適量 TPI 固體粉末，將其溶于 DMSO 中，配置成濃度為 10－3mol·L—1的儲存液。用移液槍緩慢吸取 200 μL 儲存液，并加入 1 800 μL 的 DMSO，配置成濃度為10－4mol·L—1的 2 mL 工作液。在 FS5-SS 熒光光譜儀中先測定同體積空白 DMSO 中的紫外吸收，再測定已配置好的 TPI 工作液。扣除空白背景之后，即得到 TPI 的紫外吸收光譜。

熒光光譜(AIE 曲線)的測定：稱取適量 TPI固體粉末溶于 70 μL 的二氯甲烷中，并超聲加速溶解。待固體粉末完全溶解，即溶液呈現(xiàn)澄清狀后，迅速用移液槍吸取 TPI 溶液平均分配到 7 個5 mL 的玻璃瓶中，得到每個瓶子 10 μL 的 TPI 儲存液。將玻璃瓶放置在 50 ℃ 的烘箱中 10 min。待溶劑蒸發(fā)完全后，取出玻璃瓶，分別向每個瓶中加入不同比例的 DMSO 和水，使水的體積分?jǐn)?shù)分別為 0%、10%、30%、50%、70%、90%、95%，進(jìn)而形成 TPI 濃度為 10－4mol·L—1的工作液。在 FS5-SS 熒光光譜儀中用之前測定好的紫外吸收來設(shè)置激發(fā)波長，進(jìn)而得到最終的 AIE曲線。

2.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

本實驗的實驗對象為神經(jīng)膠質(zhì)瘤母瘤細(xì)胞(U87-MG)。細(xì)胞培養(yǎng)在 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為 5% 的無菌環(huán)境中。完全培養(yǎng)基的配置：10%的胎牛血清、1% 的青霉素鏈霉素和 1% 的非必需氨基酸(NEAA)按照順序緩慢加入 500 mL 的DMEM 中，搖勻以作下一步備用。用 25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶來進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)與擴增。用體積質(zhì)量為 0.25% 的胰蛋白酶消化液將生長到亞融合處的細(xì)胞從表面分離出來，并接種到不同大小的培養(yǎng)容器中，以進(jìn)行下一步實驗。

2.2.3 細(xì)胞毒性測定

細(xì)胞毒性測定通過 CCK-8 試劑盒與 U87-MG細(xì)胞完成。將等量的 U87-MG 細(xì)胞接種到 96 孔板中(8 000 個細(xì)胞/孔)，并每孔加入配置好的完全培養(yǎng)基 100 μL。在 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為 5% 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 24 h 后，用移液槍將培養(yǎng)基移除，并加入已經(jīng)配置好的不同濃度(0、1 μmol·L－1、2 μmol·L－1、5 μmol·L－1)的 TPI 培養(yǎng)基混合溶液。待共同孵育 48 h 后，用移液槍緩慢移除 TPI 培養(yǎng)基混合溶液。待共同孵育 48 h 后，用移液槍緩慢移除 AIE 培養(yǎng)基混合工作液，每孔加入 100 μL的新鮮完全培養(yǎng)基及 10 μL 的 CCK-8 檢測液，孵育 1 h。使用酶標(biāo)儀來測量孵育后的溶液在450 nm 的吸光度，并將結(jié)果進(jìn)行歸一化處理，完成細(xì)胞毒性的測定。

2.2.4 光穩(wěn)定性實驗

TPI 的光穩(wěn)定性實驗是通過對染色的 U87-MG 細(xì)胞進(jìn)行多次層掃，并通過計算信號丟失率來進(jìn)行測定。將 U87-MG 細(xì)胞分別等量地接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿(20 mm2)中，并加入配置好的完全培養(yǎng)基 1.5 mL。待孵育 24 h 完全貼壁后，用移液槍將舊的培養(yǎng)基緩慢吸出，并加入新鮮完全培養(yǎng)基以及適量的 TPI 與 TMRM 的工作液，使其體系分別達(dá)到 2 μmol·L－1和 100 μmol·L－1的濃度。孵育 15 min 后，用磷酸緩沖鹽溶液緩慢清洗TMRM 所染色的細(xì)胞 3 次。所有的樣品均被激光共聚焦顯微鏡掃描 120 次，然后通過計算其平均熒光強度得到信號丟失率。

2.2.5 共定位實驗及線粒體染色機理實驗

線粒體靶向性與線粒體靶向機理通過 MTG及 CCCP 進(jìn)行測定。U87-MG 細(xì)胞分別等量地接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿(20 mm2)中，并加入配置好的完全培養(yǎng)基 1.5 mL。待孵育 24 h 完全貼壁后，用移液槍將舊的培養(yǎng)基緩慢吸出，并加入新鮮完全培養(yǎng)基以及適量的 AIE 與 MTG 的工作液，使其體系分別達(dá)到 2 μmol·L－1和 100 μmol·L－1的濃度。孵育 15 min 后，用磷酸緩沖鹽溶液緩慢清洗 MTG 所染色的細(xì)胞 3 次。通過激光共聚焦顯微鏡拍攝圖像，并利用 ImageJ Fiji 來計算共定位皮爾遜系數(shù)。TPI 的線粒體靶向機理測定同理，在加入 TPI 后將 CCCP 加入到體系中，使體系中的 CCCP 濃度達(dá)到 10 μmol·L－1。通過激光共聚焦顯微鏡拍攝，并通過計算平均熒光強度，得到線粒體染色機理。

2.2.6 模擬微重力下不同時間點線粒體膜電位的監(jiān)測

以 U87-MG 細(xì)胞作為監(jiān)測模擬微重力下不同時間點線粒體膜電位變化的模型細(xì)胞。將 U87-MG 細(xì)胞分別等量(50 000 個細(xì)胞/皿)地接種到 6皿細(xì)胞培養(yǎng)皿(20 mm2)中，并加入配置好的完全培養(yǎng)基 1.5 mL。待細(xì)胞完全貼壁后，用移液槍將舊的培養(yǎng)基緩慢吸出，并加入新鮮完全培養(yǎng)基以及適量的 TPI 工作液，使體系的 AIE 濃度達(dá)到2 μmol·L－1。將整個體系放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h 后取出，向培養(yǎng)皿中加滿新鮮的培養(yǎng)基 AIE溶液，以防止旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生剪切力，并放進(jìn)雙軸回旋儀中進(jìn)行回旋?；匦齼x設(shè)置為隨機轉(zhuǎn)速模式。對照組的樣品放置在同樣的培養(yǎng)箱內(nèi)。待模擬微重力完成后，迅速取出完成模擬的樣品，并快速對剩余的樣品進(jìn)行模擬?？焖賹⑼瓿赡M的樣品進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡成像，從樣品取下到完成成像的整個過程少于 10 min。

2.2.7 AIE-水凝膠三維成像體系的建立

將適量細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行消化離心后，加入 1 mL 培養(yǎng)基緩慢吹勻配置成細(xì)胞工作懸液。從冰盒中迅速取出 0.37 mL 的 Matrigel 與0.25 mL 的細(xì)胞工作懸液混勻，比例為細(xì)胞工作液∶Matrigel＝1∶1.5。迅速將混勻的 Matrigel 細(xì)胞工作混合液加入培養(yǎng)皿的底部，搖勻。輕輕放置到 37 ℃ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中成膠固化 1 h。待檢查 Matrigel 是否完全凝固于培養(yǎng)皿底部后，加入1 mL 濃度為 2 μmol·L－1的含有 AIE 工作液的新鮮培養(yǎng)基，與 Matrigel 細(xì)胞混合液進(jìn)行共同孵育。

2.2.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計學(xué)分析由 Graphpad prism 9 進(jìn)行。平均熒光強度和皮爾遜系數(shù)由 ImageJ Fiji 計算得到。在本次工作中，所有的實驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行 3 次以上的重復(fù)實驗，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)意義分析。

3 結(jié) 果

3.1 TPI 的分子表征與光物理性質(zhì)

TPI 的分子結(jié)構(gòu)與核磁共振氫譜如圖1 所示，其光學(xué)性質(zhì)如圖2 所示。如圖2(a)所示，TPI在 440 nm 處有明顯的吸收峰。如圖2(b)～(c)所示，在 DMSO 中，TPI 以單分子狀態(tài)存在，沒有明顯的熒光；隨著水的比例逐漸增加，TPI 的熒光強度逐漸增強。與此同時，TPI 的最大發(fā)射波長為 680 nm，避免了生物自發(fā)光的干擾。

圖2 TPI 的光物理性質(zhì)Fig.2 Optical properties of TPI

3.2 TPI 的生物學(xué)測試

TPI 的生物相容性、光穩(wěn)定性與線粒體靶向性測試如圖3 所示。如圖3(a)所示，當(dāng) TPI 的濃度為 3 μmol·L－1時，U87-MG 細(xì)胞依然保持較高的活性，這證明 TPI 的生物相容性較好，也為之后 U87-MG 細(xì)胞的長期染色奠定了堅實的基礎(chǔ)。同時，長期的共孵育染色需要 TPI 保持較高的光穩(wěn)定性。如圖3(b)所示，向 U87-MG 細(xì)胞分別加入 TPI 與 TMRM 進(jìn)行共染色，并通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行多次掃描。當(dāng)掃描次數(shù)為 120 次時，TMRM 的熒光強度信號丟失了至少 40%，而 TPI 的熒光強度信號保持在較高的水平，表明 TPI 的光穩(wěn)定性較好。隨后，本研究通過共定位實驗測試了 TPI 的線粒體膜電位靶向性能。首先，利用 TPI 與 MTG 共定位實驗證明TPI 的線粒體靶向性。如圖3(c)所示，激光共聚焦顯微鏡成像下可以分析出 TPI 與 MTG 共染色能較好地重合在一起，其共定位皮爾遜系數(shù)達(dá)到了 0.94，體現(xiàn)了出色的線粒體靶向性能。然后利用 CCCP 來證明 TPI 能夠靶向線粒體膜電位，即 TPI 是否能夠表征線粒體膜電位的變化。如圖3(d)所示，向被 TPI 染色的 U87-MG 細(xì)胞中加入適量的 CCCP 后，TPI 的熒光強度不斷下降，直至幾乎消失，結(jié)合 CCCP 作為線粒體膜電位抑制劑，可以推斷出 TPI 具備表征線粒體膜電位變化的能力[24]。

圖3 TPI 的生物相容性、光穩(wěn)定性和線粒體靶向性測試Fig.3 Evaluation of biocompatibility, photostability and mitochondria targeting ability of TPI

3.3 模擬微重力下不同時間點線粒體膜電位的監(jiān)測

在進(jìn)行模擬微重力實驗之前，需確定提前加入 TPI 進(jìn)行染色是否會影響細(xì)胞狀態(tài)。如圖4 所示，通過對比對照組與 TPI 的明場狀態(tài)可知：提前加入 TPI 染色不會對細(xì)胞狀態(tài)有明顯影響。此外，模擬微重力 24 h 后，對 U87-MG 細(xì)胞進(jìn)行染色，其激光共聚焦顯微鏡成像證實了這一點。隨后進(jìn)行正式的模擬微重力實驗，圖5(a)詳細(xì)概述了實驗流程與思路。本實驗利用隨機轉(zhuǎn)速模式的雙軸回旋儀 SM-31 完成微重力的模擬。提前 6 h 加入 TPI 對 U87-MG 細(xì)胞進(jìn)行染色，并在放入回旋儀裝置之前填充滿新鮮的培養(yǎng)基，封好透氣的封口膜，防止培養(yǎng)基側(cè)漏。整個操作過程需小心緩慢進(jìn)行，以防因產(chǎn)生氣泡而對細(xì)胞形成剪切力，使細(xì)胞無法牢固貼壁，進(jìn)而不能完成成像捕捉。模擬微重力下，不同時間點的監(jiān)測對及時捕捉細(xì)胞的模擬微重力效應(yīng)十分重要。在本次實驗中，共設(shè)計了 12 h、16 h、24 h、36 h 及 48 h等 5 個時間點，利用 TPI 的光穩(wěn)定性強、免洗等性能，及時、迅速地捕捉模擬微重力下的細(xì)胞線粒體膜電位變化。圖5(b)以柱狀圖的形式呈現(xiàn)不同時間點處理后的 TPI 平均熒光強度。結(jié)合圖5(c)可以看出，線粒體膜電位在 5 個時間點均未發(fā)生明顯變化。其中值得注意的是，在16～24 h 的模擬微重力下，TPI 的熒光強度略微下降(與對照組相比)，這可能是因為模擬微重力下，線粒體發(fā)生的氧化應(yīng)激作用引起的線粒體損傷導(dǎo)致膜電位下降，而后，隨著細(xì)胞在一定范圍內(nèi)適應(yīng)模擬微重力環(huán)境，線粒體膜電位又完全恢復(fù)。但與圖3(d)中加入 CCCP 后線粒體膜電位的明顯變化相比，在整個模擬微重力過程中，TPI監(jiān)測到的線粒體膜電位的變化不明顯，這從側(cè)面說明，U87-MG 細(xì)胞的線粒體膜電位在面對模擬微重力環(huán)境等刺激條件時，變化不大，即使有微小的波動也能夠通過自身的適應(yīng)性進(jìn)行調(diào)整。

圖4 TPI 與 U87-MG 細(xì)胞提前共孵育下的細(xì)胞明場與激光共聚焦顯微鏡成像圖Fig.4 Confocal laser fluorescence images and bright-field (BF) of U87-MG cells co-incubation of TPI

3.4 利用 AIE 水凝膠三維成像體系進(jìn)行長時間微重力的模擬及三維成像

本文進(jìn)一步進(jìn)行了 72 h(3 d)的模擬微重力實驗，以此來監(jiān)測長期模擬失重狀態(tài)下 U87-MG 細(xì)胞的線粒體膜電位的變化情況。圖6 展示了 AIE-水凝膠 3D 成像體系建立的主要原因：當(dāng)隨機回旋的時間增加至 72 h 時，部分樣品中的細(xì)胞貼壁不牢固，被旋轉(zhuǎn)過程中產(chǎn)生的氣泡切下，導(dǎo)致無法在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行成像，從而完成對樣品統(tǒng)計學(xué)意義上的捕捉與分析。為解決這個問題，本文提出利用生物相容性較好的生物基質(zhì)膠 Matrigel 對 U87-MG 細(xì)胞進(jìn)行 3D 培養(yǎng)，并防止在長時間模擬微重力中細(xì)胞被氣泡切下[25]。圖7(a)與 2.2.7 小節(jié)的研究方法部分地展示了整個方法的操作過程。由于基質(zhì)膠在常溫下易成膠，因此，整個體系的操作過程需在冰上進(jìn)行，操作需穩(wěn)定、迅速。圖7(b)展示了 Matrigel 培養(yǎng)的 U87-MG 細(xì)胞在 TPI 染色后的 3D 成像圖。從圖7(b)中可以清晰地觀察到 U87-MG 細(xì)胞三維分布在整個空間中，側(cè)面證明了生物基質(zhì)膠Matrigel 的存在對 TPI 的細(xì)胞染色無影響。隨后，本文利用此體系進(jìn)行了 72 h 模擬微重力實驗。圖7(c)、圖7(d)分別以激光共聚焦顯微鏡的三維成像三視圖、柱狀圖呈現(xiàn) 72 h 模擬微重力下的實驗結(jié)果?？梢杂^察到，在 Matrigel 的保護(hù)下，U87-MG 細(xì)胞的生長狀況良好，由此說明：Matrigel 有助于長期監(jiān)測細(xì)胞的微重力效應(yīng)。通過分析三視圖的平均熒光強度，72 h 模擬微重力時，U87-MG 細(xì)胞線粒體膜電位的變化依舊不明顯。原因可能歸結(jié)為兩點：第一，在 72 h 時，細(xì)胞依舊可以適應(yīng)模擬微重力效應(yīng)，在生長良好的狀態(tài)下，72 h 的模擬微重力對細(xì)胞的損傷不明顯；第二，Matrigel 對細(xì)胞有保護(hù)作用，使細(xì)胞對外界刺激的適應(yīng)性與恢復(fù)性增強，因此使得模擬微重力效應(yīng)無法被監(jiān)測到。

圖6 模擬微重力下經(jīng) TPI 染色 24 h、48 h、72 h 時 U87-MG 細(xì)胞的貼壁明場與激光共聚焦顯微鏡成像圖Fig.6 Confocal laser fluorescence images and bright-field (BF) of U87-MG cells stained by TPI for 24, 48 and 72 h under simulated microgravity

圖7 建立 3D 水凝膠體系來進(jìn)行 72 h 模擬微重力下 U87-MG 細(xì)胞線粒體膜電位的監(jiān)測Fig.7 72 h monitoring mitochondrial membrane potential of U87-MG cells by AIE-Matrigel 3D system under simulated microgravity

4 討論與分析

空間生命科學(xué)作為研究宇宙空間特殊環(huán)境因素作用下的生命現(xiàn)象及其規(guī)律的學(xué)科，其基礎(chǔ)研究對宇航員在太空中的身體健康至關(guān)重要[26]。微重力作為太空中重要的特殊環(huán)境之一，被大量模擬于地面實驗中。本工作利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針完成模擬微重力下 U87-MG 細(xì)胞線粒體膜電位的不同時間點監(jiān)測。TPI 具有顯著的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)，其出色的生物相容性、良好的光穩(wěn)定性及免洗特性為模擬微重力條件下長期、快速地監(jiān)測細(xì)胞線粒體膜電位的變化提供了有力的幫助。此外，長時間(72 h)微重力的模擬會使整個體系產(chǎn)生氣泡，進(jìn)而對細(xì)胞產(chǎn)生巨大的剪切力，使細(xì)胞面臨貼壁不牢固的問題。針對此問題，以及真實模擬人腦 3D 環(huán)境的需要，本研究開發(fā)出 AIE-水凝膠 3D 成像體系，完成長時間模擬微重力效應(yīng)的監(jiān)測。AIE-水凝膠 3D 成像體系的開發(fā)與 AIE在模擬微重力下的長期快速監(jiān)測都為空間生命科學(xué)問題的研究提供了新的研究方向和思路。

聚集誘導(dǎo)發(fā)光技術(shù)與空間生命科學(xué)的結(jié)合是一個相對較新的領(lǐng)域。目前，國內(nèi)外利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光技術(shù)解決空間生命科學(xué)問題的研究較少，本課題組在之前的研究中開發(fā)了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的內(nèi)源性 H2O2響應(yīng)探針 ASCPB，完成對模擬微重力下 U87-MG 細(xì)胞與 AC16 細(xì)胞的氧化應(yīng)激監(jiān)測[27]。與之前的研究相比，本工作在利用AIE 探針完成線粒體膜電位監(jiān)測的同時，還建立了 72 h 的 AIE-水凝膠 3D 成像體系，克服了之前工作中只能對 48 h 的微重力效應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測的弊端，完成了 72 h 的長期監(jiān)測。AIE-水凝膠 3D 成像體系是本工作中最大的創(chuàng)新點，為未來復(fù)雜環(huán)境下細(xì)胞效應(yīng)的長期監(jiān)測提供了堅實的基礎(chǔ)。

5 結(jié) 論

結(jié)果表明，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的線粒體探針 TPI 擁有出色的生物相容性、光穩(wěn)定性及線粒體靶向性，為多時間點監(jiān)測模擬微重力下線粒體的膜電位提供了有力的幫助。此外，本文構(gòu)建了 AIE-3D 水凝膠成像體系，成功實現(xiàn)了 U87-MG 細(xì)胞的培養(yǎng)，并利用 TPI 染色完成了 3D 成像。本工作為研究細(xì)胞的微重力效應(yīng)提供了有力的方法，將聚集誘導(dǎo)發(fā)光技術(shù)與空間生命科學(xué)相結(jié)合，為解決復(fù)雜環(huán)境下的人體損傷機理提供了快速、簡便的監(jiān)測手段。