金四華,賈富民,何培莉,賈羽晴,稅 斐,劉旭玲,劉 星,王 新,徐 嫚,耿照玉*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,合肥 230036)

匍匐性狀是雞品種中存在的一種特有的矮小表型,其特征為脛短身矮、翅膀短小。IHH基因是影響軟骨細(xì)胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)因子,其介導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖、分化和造骨細(xì)胞分化過程,在機(jī)體的骨骼發(fā)育中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明,IHH是調(diào)控匍匐性狀的關(guān)鍵基因[1],但還需從細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步研究驗(yàn)證該機(jī)理,從而有助于更加深入地了解匍匐性狀。

IHH屬于一個(gè)非常保守的Hedgehog分泌蛋白家族。在哺乳動(dòng)物中,IHH有兩個(gè)結(jié)構(gòu)高度相似的成員,Sonic hedgehog (SHH)和 Desert hedgehog (DHH)[2]。IHH主要由生長(zhǎng)板中的前肥大軟骨細(xì)胞和早期肥大軟骨細(xì)胞分泌和表達(dá)。前期研究證實(shí),IHH是調(diào)控骨生長(zhǎng)發(fā)育的主要因子,通過與受體結(jié)合,活化Smoothed (Smo)膜蛋白,從而將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其在軟骨細(xì)胞增殖、分化和成骨分化等方面起著重要的作用[3-4]。St-Jacques等[5]發(fā)現(xiàn),早期肥大軟骨細(xì)胞分泌的IHH可以調(diào)控其周圍軟骨細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。PTHrP-IHH信號(hào)通路是軟骨內(nèi)成骨中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路,PTHrP通過下調(diào)骨形態(tài)蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)信號(hào),抑制成骨細(xì)胞的分化[6]。IHH與PTHrP各自或共同調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的分化。Murakami和Noda[7]發(fā)現(xiàn),在成年大鼠股骨骨折愈合過程中,IHH主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,這表明IHH可能是軟骨內(nèi)骨化的調(diào)節(jié)因子。目前,已有研究證實(shí)IHH信號(hào)通路在骨骼生長(zhǎng)發(fā)育及維持穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用[8-9],但I(xiàn)HH對(duì)軟骨細(xì)胞表型及功能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

因此,本研究通過構(gòu)建過表達(dá)載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡,試劑盒法檢測(cè)ALP活性,旨在從細(xì)胞水平上探究過表達(dá)IHH對(duì)體外培養(yǎng)的雞軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響,為改善雞匍匐性狀提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞原代軟骨細(xì)胞于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽分子遺傳育種與生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞間培養(yǎng),質(zhì)粒pEGFP-N1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;Transgen反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;TransStart Green qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoR Ι和BamH Ι購(gòu)自TaKaRa;無毒素質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司;Cell Counting Kit-8購(gòu)自南京翼飛雪生物科技有限公司;細(xì)胞周期試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(ThermoFisher, USA);PCR儀(Eppendoorf,Germany);熒光定量PCR儀(Roche,Switzerland);流式細(xì)胞儀(BD,USA);酶標(biāo)儀(BIO-RAD,USA)。

1.3 方法

1.3.1IHH克隆引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中IHH基因全長(zhǎng)編碼序列(IHH, 1 227 bp, NM_204 957.2),結(jié)合插入的載體酶切位點(diǎn)信息,設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增信息,并在引物上游引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和Kozak序列(GCCACC),下游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。該引物由上海生工生物工程有限公司合成,見表1。

1.3.2 重組過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)IHH基因及pEGFP-N1載體(OV-NC)序列設(shè)計(jì)引物,在上、下游引物插入EcoR Ι、BamH Ι酶切位點(diǎn)。PCR方法擴(kuò)增IHH基因片段,采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶,然后用凝膠試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pEGFP-N1載體用EcoR Ι、BamH Ι進(jìn)行雙酶切,酶切后,回收目的片段和線性載體,采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,于37 ℃轉(zhuǎn)化培養(yǎng)14 h,挑選單菌落,篩選陽(yáng)性克隆,進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取。雙酶切凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒DNA大小正確后,將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,并于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì),質(zhì)粒命名為OV-IHH。

表1 IHH基因克隆引物序列Table 1 Primers used for cloning IHH gene

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將雞軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞以1×106的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染40 h后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,并收取細(xì)胞,提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,qPCR檢測(cè)IHH基因的mRNA表達(dá)量。再分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞在24、48、72 h的IHH基因表達(dá)效率,以確定轉(zhuǎn)染最佳時(shí)間。試驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、空載體組(OV-NC)和過表達(dá)組(OV-IHH),每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將雞軟骨細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi),分別在培養(yǎng)24、48和72 h后加入10 μL的CCK-8試劑,輕輕搖晃混勻,37 ℃靜置孵育3 h, 酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 利用Cell cycle staining Kit 細(xì)胞周期試劑盒進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。取轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞,胰酶消化后用PBS洗滌,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清,加入1 mL 75%乙醇,-20 ℃固定;取固定的細(xì)胞8 000 r·min-1離心4 min,PBS洗滌后,加入100 μg·mL-1的RNAase 100 μL重懸細(xì)胞,37 ℃孵育30 min;再加入400 μL PI(50 μg·mL-1)染色液混勻,置4 ℃條件下避光孵育30 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

利用Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。取轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞,把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內(nèi),PBS洗滌后用胰酶消化細(xì)胞,加入細(xì)胞培養(yǎng)液,混勻后1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,收集細(xì)胞,用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù);取1～5×105重懸的細(xì)胞,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入500 μL結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞;隨后加入Annexin V-PE,輕輕混勻后加入10 μL 7-ADD,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 試劑盒檢測(cè)ALP活性 將雞軟骨細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度為4×105個(gè)·孔-1,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí),將過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染48 h后,采用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化至21 d,分化后的細(xì)胞使用ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法處理,并整理成“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式,再利用Sigmaplot 14.0軟件進(jìn)行圖形繪制;應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否擴(kuò)增成功。IHH基因PCR產(chǎn)物大小約1 227 bp,與GenBank中報(bào)道的IHH序列大小相對(duì)應(yīng),表明IHH基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功。

用限制性內(nèi)切酶EcoR Ι、BamH Ι雙酶切重組過表達(dá)質(zhì)粒,獲得4 000 bp的pEGFP-N1載體和1 227 bp的IHH基因片段(圖1),表明重組過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。IHH基因重組過表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定為陽(yáng)性,將質(zhì)粒送到通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與在GenBank中檢索的IHH基因cDNA序列進(jìn)行比對(duì),測(cè)序結(jié)果中的基因序列與GenBank登錄序列完全一致,表明重組過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.重組過表達(dá)質(zhì)粒;2.空載體;3.重組過表達(dá)質(zhì)粒雙酶切;4.PCR產(chǎn)物 M. DNA marker; 1. Recombinant overexpression plasmid; 2. Empty vector; 3. Double enzyme digestion of recombinant overexpression plasmid; 4. PCR product圖1 重組過表達(dá)質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.1 Double enzyme digestion electrophoretogram of recombinant overexpression plasmid

2.2 重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鑒定及效率檢測(cè)

由圖2可知,將空載體和重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞40 h后,在熒光顯微鏡下,OV-NC組和OV-IHH組都可觀察到綠色熒光,表明重組過表達(dá)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后,與對(duì)照組和OV-NC組相比,OV-IHH組IHH基因mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.01),IHH基因的表達(dá)效率擴(kuò)大2 700倍左右(圖3),表明過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

為探究重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的最佳時(shí)間,將重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞,分別在24、48和72 h收取細(xì)胞,提RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測(cè)。由圖4可知,重組過表達(dá)質(zhì)粒在24、48和72 h的IHH基因的表達(dá)效率分別擴(kuò)大了4 300、5 580和4 430倍,因此取轉(zhuǎn)染后48 h為過表達(dá)效率最佳時(shí)間。

OV-NC為空載體;OV-IHH為重組過表達(dá)質(zhì)粒,下同 OV-NC is the empty vector; OV-IHH is the recombinant overexpression plasmid, the same as below圖2 重組過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鑒定Fig.2 The transfection identification of recombinant overexpression plasmid

2.3 過表達(dá)IHH對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞,由圖5可知,與對(duì)照組和OV-NC組相比,OV-IHH組細(xì)胞OD值顯著增加(P<0.01)。表明過表達(dá)IHH基因促進(jìn)細(xì)胞增殖。

*表示差異顯著,**表示差異極顯著,下同 * means significant difference, ** means extremely significant difference, the same as below圖3 重組過表達(dá)質(zhì)粒的IHH過表達(dá)效率Fig.3 IHH overexpression efficiency of recombinant overexpression plasmids

圖4 重組過表達(dá)質(zhì)粒在不同時(shí)間的IHH過表達(dá)效率Fig.4 IHH overexpression efficiency of recombinant overexpression plasmids at different times

2.4 過表達(dá)IHH對(duì)軟骨細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

由圖6可知,對(duì)照組、OV-NC組和OV-IHH組的S期細(xì)胞占比分別為8.04%、9.81%和19.56%。與對(duì)照組和OV-NC組相比,OV-IHH組S期細(xì)胞占比顯著增加(P<0.01)。表明過表達(dá)IHH基因促進(jìn)細(xì)胞增殖。由圖7可知,對(duì)照組、OV-NC組和OV-IHH組的細(xì)胞凋亡比例分別為7.98%、8.94%和2.23%。與對(duì)照組和OV-NC組相比,OV-IHH組細(xì)胞凋亡顯著減少(P<0.01)。表明過表達(dá)IHH基因抑制細(xì)胞凋亡。

2.5 過表達(dá)IHH對(duì)ALP活性的影響

由圖8可知,對(duì)照組、OV-NC組和OV-IHH組的ALP活性分別為78.15、78.41、101.20 U·mg-1。與對(duì)照組和OV-NC組相比,OV-IHH組的ALP活性顯著升高(P<0.01),表明過表達(dá)IHH基因促進(jìn)了細(xì)胞的分化能力。

圖5 過表達(dá)IHH對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of IHH overexpression on the cell proliferation

圖6 過表達(dá)IHH對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.6 Effect of IHH overexpression on the cell cycle

圖7 過表達(dá)IHH對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of IHH overexpression on the cell apoptosis

圖8 過表達(dá)IHH對(duì)ALP活性的影響Fig.8 Effect of IHH overexpression on the ALP activity

3 討 論

近年來,隨著群體中匍匐性狀的鑒定,禽類骨骼發(fā)育成為人們?nèi)找骊P(guān)注的問題,脛骨、軟骨發(fā)育不良嚴(yán)重影響著禽類的生產(chǎn)性能。為了進(jìn)一步探討IHH影響雞匍匐性狀的作用機(jī)制,本研究構(gòu)建了IHH的重組過表達(dá)質(zhì)粒,并成功轉(zhuǎn)染到雞軟骨細(xì)胞中。所用軟骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室前期培養(yǎng),并經(jīng)軟骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白Col Ⅱ的免疫熒光檢測(cè)確定為軟骨細(xì)胞[10]。查閱資料發(fā)現(xiàn),IHH是HH家族中的一員,主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞,在軟骨細(xì)胞增殖和分化方面起調(diào)節(jié)功能[11]。在軟骨細(xì)胞增殖和肥大時(shí),IHH是必需的[5,12]。因此,本研究繼續(xù)探討了IHH對(duì)雞軟骨細(xì)胞增殖凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)IHH使得雞軟骨細(xì)胞的S期細(xì)胞占比顯著增加,促進(jìn)了細(xì)胞增殖。而Deng等[13]研究發(fā)現(xiàn),IHH下調(diào)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞周期在G1至S期之間受到阻滯。這也從側(cè)面佐證了本試驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)IHH使得雞軟骨細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例顯著下降,抑制了細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果與前人的報(bào)道類似,如在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨和培養(yǎng)的雞軟骨細(xì)胞中研究中發(fā)現(xiàn),IHH的激活對(duì)軟骨細(xì)胞肥大化加速發(fā)揮重要作用[14-15]。此外,研究發(fā)現(xiàn)敲除IHH基因?qū)е滦∈蟮乃闹兌?軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制[13,16]。張潔靖[17]在研究大鼠軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),經(jīng)HH信號(hào)通路作用后,細(xì)胞活性受到影響,細(xì)胞凋亡也因此被損害,結(jié)果表明在軟骨損傷過程中,IHH有可能參與其中。Mak等[18]將軟骨中HH信號(hào)提高,促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大,關(guān)節(jié)軟骨數(shù)量減少。

本研究對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行干擾和過表達(dá)IHH處理后,通過體外誘導(dǎo)分化后檢測(cè)其細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性,以探究IHH對(duì)雞軟骨細(xì)胞分化的影響。ALP是機(jī)體中重要的酶類,當(dāng)相應(yīng)細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化時(shí),可根據(jù)ALP活性進(jìn)行判定。在不同類型細(xì)胞中,ALP含量不同。在成熟軟骨細(xì)胞中,只有少量的ALP存在,而當(dāng)細(xì)胞處于肥大化時(shí)期,或者是細(xì)胞出現(xiàn)鈣化時(shí),ALP含量增加,表現(xiàn)出較高的活性[19]。因此,越來越多的研究根據(jù)ALP活性判斷軟骨細(xì)胞是否成熟。Deng等[13]研究發(fā)現(xiàn),IHH敲除降低了軟骨細(xì)胞的ALP活性和礦物質(zhì)沉積。這些結(jié)果提示,IHH下調(diào)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的抑制作用可能與TGF-β/Smads和OPG/RANKL信號(hào)通路有關(guān)。此外,有研究證實(shí)了過表達(dá)IHH增加MC3T3-E1細(xì)胞中ALP活性和OCNmRNA表達(dá)水平[20]。在本研究中,過表達(dá)IHH,ALP活性升高。結(jié)果表明IHH基因能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了IHH基因過表達(dá)載體;過表達(dá)IHH可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和分化,研究結(jié)果為從細(xì)胞水平上進(jìn)一步解析IHH基因?qū)﹄u匍匐性狀的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。