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        牛胚胎基因組選擇研究進(jìn)展

        2023-11-30 08:53:06牛一凡楊柏高張培培馮肖藝曹建華郝海生杜衛(wèi)華鄒惠影朱化彬馬友記趙學(xué)明
        畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2023年11期
        關(guān)鍵詞:卵裂囊胚胚胎

        牛一凡,楊柏高,張培培,張 航,馮肖藝,曹建華,余 洲, 郝海生,杜衛(wèi)華,鄒惠影,朱化彬,馬友記,趙學(xué)明*

        (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730050)

        近年來(lái),胚胎基因組選擇(embryonic genome selection,EGS)技術(shù)可為牛繁殖育種工作提供諸多便利,逐漸成為牛繁殖育種研究的熱點(diǎn)。EGS可以很容易地挑選出大量的全同胞胚胎和半同胞胚胎,只選擇理想性別和基因型優(yōu)良的胚胎進(jìn)行移植;此外,可以淘汰攜帶隱性致死基因或其他染色體畸變的胚胎,降低致死基因的頻率;還可以通過(guò)加大選擇強(qiáng)度來(lái)加快育種進(jìn)程,縮短世代間隔[1]。將基因組選擇與生物技術(shù)相結(jié)合,能進(jìn)一步加快牛的遺傳改良[2]。近年來(lái),隨著胚胎生物技術(shù)的發(fā)展和牛育種工作的需求增加[3],EGS技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。本文綜述了牛EGS技術(shù)的研究應(yīng)用,并且分別概述了EGS技術(shù)常用的活檢方法、擴(kuò)增方法及該項(xiàng)技術(shù)當(dāng)前存在的問(wèn)題,旨在為相關(guān)領(lǐng)域的科研工作提供參考。

        1 牛EGS常用活檢方法

        胚胎活檢指的是在胚胎移植之前,通過(guò)化學(xué)、機(jī)械和激光等方法在透明帶打孔來(lái)獲得胚胎細(xì)胞,了解胚胎的遺傳特點(diǎn),選擇適宜的胚胎進(jìn)行移植。牛EGS常用機(jī)械法進(jìn)行活檢,根據(jù)所用分割器械的不同又分為針?lè)ā⒊槲ㄅc微刀法。由于3種活檢方法采取的措施不同,對(duì)胚胎造成的物理?yè)p傷也不同,對(duì)活檢胚胎后續(xù)發(fā)育能力和移植妊娠率均有不同程度的影響。據(jù)報(bào)道,針?lè)?、抽吸法和微刀法活檢胚胎冷凍保存解凍后的移植妊娠率分別為57%、43%和31%[4]。因此,選擇適當(dāng)?shù)幕顧z方法對(duì)于胚胎后續(xù)利用及冷凍保存具有重要意義。

        1.1 針?lè)?/h3>

        針?lè)ㄍǔ8m合于早期的胚胎(卵裂期到桑葚胚期)[2]。如圖1A所示,該法的基本步驟是將胚胎置于含0.4%牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中,用吸液管固定胚胎,用細(xì)針將透明帶(不損傷卵裂球)刺出一個(gè)小口,用活檢移液管從桑椹胚中抽出2~3個(gè)細(xì)胞,或從囊胚滋養(yǎng)外胚層抽出4~5個(gè)細(xì)胞,將吸出的胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有蛋白酶K的裂解緩沖液中[4-5]。該方法對(duì)胚胎透明帶的損傷較小,后續(xù)冷凍保存后解凍的移植妊娠率可以高達(dá)57%。

        1.2 抽吸法

        如圖1B所示,抽吸法的基本步驟是將胚胎置于含有0.4%牛血清白蛋白的PBS中,用吸液管固定,同時(shí)用活檢移液管刺穿透明帶,用活檢移液管從桑椹胚中抽出2~3個(gè)細(xì)胞,或從囊胚滋養(yǎng)外胚層抽出4~5個(gè)細(xì)胞,將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有蛋白酶K的裂解緩沖液中。該方法對(duì)透明帶的損傷適中,冷凍保存后解凍的移植妊娠率為43%[4-5],比針?lè)ǖ?4%。

        A.使用活檢針進(jìn)行穿刺透明帶獲取活檢胚胎細(xì)胞;B.使用活檢移液管進(jìn)行穿刺透明帶獲取活檢胚胎細(xì)胞;C.使用微刀片進(jìn)行胚胎切割獲取活檢胚胎細(xì)胞A.Biopsy needle was used to puncture the zona pellucida to obtain biopsied embryonic cells; B.Biopsy pipette was used to puncture the zona pellucida to obtain biopsied embryonic cells; C.Microblade was used for embryo cutting to obtain biopsied embryonic cells圖1 牛EGS常用3種活檢方法模式圖Fig.1 Pattern diagram of 3 common biopsy methods for bovine EGS

        1.3 微刀法

        如圖1C所示,微刀法的基本步驟是將胚胎僅置于PBS緩沖液中,置于用微刀片劃過(guò)底部的培養(yǎng)皿中,劃痕可以固定胚胎[6],不再用手持移液管。將微刀片按壓在胚胎的邊緣上,緩慢地左右移動(dòng),直到胚胎的一小部分被切掉。然后,在培養(yǎng)皿中加入與先前PBS緩沖液等量的含0.8%牛血清蛋白的PBS,以防止細(xì)胞附著在刀片或培養(yǎng)皿底部。然后用吸液管取出活檢細(xì)胞并將其放入含有蛋白酶K的裂解緩沖液中[4-5]。此方法易對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育造成不利影響,Tutt等[7]報(bào)道,采用該方法對(duì)牛高質(zhì)量體內(nèi)桑葚胚和囊胚進(jìn)行活檢后,妊娠率降低了5%~10%。以上3種牛EGS常用活檢方法各有優(yōu)缺點(diǎn),具體如表1所示。

        表1 牛EGS常用3種活檢方法的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of 3 biopsy methods for bovine EGS

        2 牛EGS常用擴(kuò)增方法

        牛EGS的關(guān)鍵是要在不過(guò)度破壞胚胎后續(xù)發(fā)育能力的同時(shí)獲得足夠數(shù)量胚胎細(xì)胞DNA。然而,一方面,通過(guò)胚胎活檢分割出的少量胚胎細(xì)胞所獲取的DNA量不足以進(jìn)行后續(xù)的全基因組測(cè)序、單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism,SNP)基因分型等工作;另一方面,增加活檢胚胎細(xì)胞數(shù)量雖然可以提高DNA的擴(kuò)增成功率,但會(huì)嚴(yán)重降低活檢胚胎后續(xù)發(fā)育能力。Lauri等[8]報(bào)道,取牛胚胎30個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活檢后的胚胎冷凍存活率(62%)低于10個(gè)細(xì)胞的活檢胚胎(89%)。由此可見(jiàn),從少量胚胎細(xì)胞中提取足夠的DNA是進(jìn)行EGS的關(guān)鍵,為此,人們通常采用全基因組擴(kuò)增(whole genomic amplification,WGA)技術(shù)對(duì)少量細(xì)胞的DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲得足夠的DNA。目前,胚胎基因組選擇常用的擴(kuò)增技術(shù)包括多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification, MDA)、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)和通過(guò)轉(zhuǎn)座子插入的線(xiàn)性放大(linear amplification via transposon insertion, LIANTI)[9]。

        2.1 MDA

        MDA最早是由Dean等[10]改進(jìn)傳統(tǒng)的WGA技術(shù)而形成的,是一種全新的非PCR等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10-12]。如圖2A所示,該方法充分利用了phi29 DNA聚合酶強(qiáng)大的處理能力與高保真性[13],在恒溫30 ℃的條件下,先是隨機(jī)的6堿基引物在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA退火結(jié)合,再發(fā)生鏈置換擴(kuò)增反應(yīng),被置換產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物又成為新的復(fù)制模板,再進(jìn)行擴(kuò)增,如此循環(huán),最后產(chǎn)生大量片段大小>10 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物[14]。由于該方法屬于恒溫?cái)U(kuò)增,所以會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。為了克服MDA的缺陷,許多學(xué)者改良了MDA技術(shù),如Sidore等[15]于2016年提出了數(shù)字液滴多重置換擴(kuò)增(dd MDA);Zhou等[16]于2021年提出凝膠多重置換擴(kuò)增(gel MDA)。

        2.2 MALBAC

        2012年,Lu等[17]應(yīng)用MALBAC進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序,Zong等[18]同時(shí)利用MALBAC方法成功地實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平的單核苷酸位點(diǎn)變異(single nucleo-tide variants,SNV)和拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)的研究。如圖2B所示,該技術(shù)結(jié)合了PCR和MDA兩種技術(shù),同時(shí)兼顧了基因組擴(kuò)增過(guò)程中的保真性和均一性,并實(shí)現(xiàn)了基因組的高覆蓋率。該技術(shù)擴(kuò)增的基本步驟先是預(yù)擴(kuò)增階段的部分隨機(jī)引物退火;再通過(guò)具有鏈置換活性的DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)鏈延伸;然后半擴(kuò)增子產(chǎn)生3′和5′端互補(bǔ)的完整擴(kuò)增子;全擴(kuò)增子環(huán)化以防止全擴(kuò)增子在第一時(shí)期PCR中進(jìn)一步擴(kuò)增和交叉雜交,而在第二時(shí)期PCR中作為靶標(biāo)[19]。最后,產(chǎn)生長(zhǎng)度為0.2~2.0 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物[20]。

        2.3 LIANTI

        2017年,Chen等[21]報(bào)道了LIANTI技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)在整個(gè)基因組的擴(kuò)增過(guò)程中都是線(xiàn)性擴(kuò)增技術(shù)。如圖2C所示,該技術(shù)擴(kuò)增的基本步驟首先是使用Tn5轉(zhuǎn)座酶與T7啟動(dòng)子結(jié)合成二聚體LIANTI轉(zhuǎn)座體,然后使用該轉(zhuǎn)座體,隨機(jī)插入單細(xì)胞基因組DNA,再使用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得線(xiàn)性擴(kuò)增的RNA轉(zhuǎn)錄本,之后再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和第二鏈合成得到線(xiàn)性擴(kuò)增的雙鏈DNA模板,這樣就得到了足夠進(jìn)行正常建庫(kù)的DNA樣本[22]。LIANTI對(duì)于全基因組的覆蓋率可以達(dá)到97%,等位基因缺失(allele dropout,ADO)率也只有17%,由于使用了更高效的DNA聚合酶,LIANTI技術(shù)的單堿基擴(kuò)增錯(cuò)誤率被降到了10-7以下[21]。

        上述3種牛EGS常用擴(kuò)增方法各有優(yōu)缺點(diǎn),具體如表2所示。

        A.恒溫條件下,含有6個(gè)隨機(jī)堿基(N)的引物與基因組DNA隨機(jī)退火,在phi29 DNA聚合酶的作用下發(fā)生鏈置換擴(kuò)增反應(yīng);B.引物與模板隨機(jī)結(jié)合,在65 ℃時(shí),DNA鏈發(fā)生置換聚合反應(yīng),得到半擴(kuò)增子;在94 ℃變性、0 ℃退火和65 ℃延伸循環(huán)后,半擴(kuò)增子形成全擴(kuò)增子后進(jìn)行PCR擴(kuò)增;C.(a)LIANTI轉(zhuǎn)座體的合成;(b)LIANTI步驟:利用LIANTI轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶,經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增,將基因組DNA片段線(xiàn)性擴(kuò)增成基因組RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成,構(gòu)建基因組文庫(kù)A.Under the condition of constant temperature, the primers containing 6 random bases (N) were randomly degraded with genomic DNA and amplified by phi29 DNA polymerase; B.When the primers were randomly combined with the template, the replacement polymerization of DNA chain took place at 65 ℃, and the semi-amplification was obtained after denaturation at 94 ℃, degeneration at 0 ℃ and extension cycle at 65 ℃, and then PCR amplification was carried out after the semi-amplification was formed; C.(a) Synthesis of LIANTI transposon; (b) LIANTI step: using LIANTI transposon and transposase, genomic DNA fragments were linearly amplified into genomic RNA by in vitro transcription, and then reverse transcribed and synthesized to construct genomic library圖2 牛EGS常用3種擴(kuò)增技術(shù)原理示意圖Fig.2 Schematic of the 3 commonly used amplification techniques for bovine EGS

        3 EGS技術(shù)在牛上的應(yīng)用進(jìn)展

        目前,在馬[31]、山羊[32]、綿羊[33]等家畜主要應(yīng)用植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis)來(lái)檢測(cè)性別決定基因或其他致病基因,很少涉及到全基因組層面的分析。根據(jù)現(xiàn)有EGS技術(shù)的報(bào)道,該技術(shù)主要應(yīng)用在日本黑牛上,主要目的是為了獲取牛的基因型數(shù)據(jù)、選育提高牛的胴體性狀、對(duì)牛的基因組估計(jì)育種值進(jìn)行估計(jì)。

        2017年,Fujii等[34]利用刀片法切割從透明帶孵化出來(lái)的日本黑牛和安格斯牛延長(zhǎng)概念的胚胎細(xì)胞中提取DNA,經(jīng)MDA擴(kuò)增出足夠量的DNA后,再通過(guò)密度為30K的SNP芯片分析來(lái)檢測(cè)基因分型的準(zhǔn)確性,以開(kāi)發(fā)一個(gè)結(jié)合延長(zhǎng)概念移植技術(shù)的牛胚胎植入前基因組選擇系統(tǒng),獲得準(zhǔn)確的基因分型數(shù)據(jù),從而通過(guò)該技術(shù)估計(jì)基因組育種值。

        此外,2019年,Fujii等[35]對(duì)日本黑牛屠體性狀進(jìn)行了基因組選擇,通過(guò)分別對(duì)體內(nèi)囊胚分割產(chǎn)生的約5個(gè)活檢細(xì)胞、約15個(gè)活檢細(xì)胞提取的DNA經(jīng)MDA后進(jìn)行密度為50K的SNP芯片分析,并且活檢后玻璃化囊胚的胚胎移植40日妊娠率達(dá)到41.9%。首次證明了在日本黑牛胴體性狀中使用胚胎附植前基因組選擇系統(tǒng)的可行性,表明胚胎附植前基因組選擇在日本黑牛胴體性狀的實(shí)際應(yīng)用中具有潛力。

        2021年,Fujii等[36]還報(bào)道了卵裂球分離技術(shù)為牛體外受精胚胎的移植前基因組選擇提供了一種簡(jiǎn)單的方法,他在2~8細(xì)胞階段分離體外受精胚胎的卵裂球來(lái)產(chǎn)生單卵雙胚胎。其中一個(gè)單卵半胚胎用于估計(jì)育種值進(jìn)行基因組選擇,而另一個(gè)用于胚胎移植,并且卵裂球分離技術(shù)不會(huì)降低胚胎基因組選擇的效率。他還評(píng)估了第8天分離的卵裂球產(chǎn)生的半囊胚DNA經(jīng)WGA后進(jìn)行SNP基因分型的準(zhǔn)確性,均得到了良好的檢出率。他發(fā)現(xiàn)的卵裂球分離技術(shù)產(chǎn)生的第8天半囊胚進(jìn)行準(zhǔn)確的SNP基因分型和基因組估計(jì)育種值的計(jì)算是可能的。表3匯總了以上3篇報(bào)道中應(yīng)用SNP芯片分析胚胎DNA的檢出率。

        4 牛EGS存在的問(wèn)題

        雖然EGS技術(shù)已被成功用于日本黑牛,但仍存在一些問(wèn)題亟待解決。首先,胚胎活檢是胚胎基因組選擇的前提,但活檢的顯微操作需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)支持[36],并且活檢本身會(huì)損害胚胎,影響妊娠率[33]。其次,WGA容易出現(xiàn)擴(kuò)增偏置、污染和覆蓋度較差等問(wèn)題[37]。最后,活檢的胚胎需要經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的冷凍保存后才會(huì)選出所需胚胎進(jìn)行移植,活檢胚胎的冷凍存活率低也是制約EGS發(fā)展的重要問(wèn)題[38]。

        4.1 胚胎活檢中存在的問(wèn)題

        影響胚胎活檢后剩余胚胎質(zhì)量的因素有很多。首先就是胚胎活檢后的細(xì)胞數(shù)量會(huì)減少[39],這可能會(huì)影響胚胎的生存能力[40-41],從而降低妊娠率[42-44]。目前,從4細(xì)胞期到桑葚胚期活檢會(huì)導(dǎo)致早期胚胎停止發(fā)育[45-47]、囊胚率較低[48-51]等,同時(shí)囊胚期活檢對(duì)發(fā)育中的胚胎的危害小于卵裂球活檢[52],所以囊胚期的胚胎活檢仍是目前首選的方法[53-54]。與此同時(shí),較少的細(xì)胞活檢對(duì)囊胚的破壞較小,但會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗的風(fēng)險(xiǎn)升高,而增加活檢細(xì)胞的數(shù)量會(huì)使擴(kuò)增失敗的風(fēng)險(xiǎn)降低,但會(huì)增加囊胚破裂的風(fēng)險(xiǎn)[55]。Mara 等[56]也提到胚胎活檢考慮的主要因素是:1)采集的胚胎細(xì)胞數(shù)量應(yīng)該盡量不影響活檢胚胎正常發(fā)育;2)獲得足夠數(shù)量的DNA以進(jìn)行分析;3)對(duì)胚胎的損害最小。所以目前,囊胚滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm,TE)活檢所采集的細(xì)胞數(shù)量一般為5~10個(gè)[57]。其次就是囊胚由TE和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)組成,根據(jù)Lawrenz等[58]的研究,TE活檢的可靠性比ICM活檢相對(duì)更高。

        4.2 WGA中存在的問(wèn)題

        成功的全基因組擴(kuò)增是當(dāng)代胚胎基因組選擇的基石[19]。Del等[59]已經(jīng)證明下一代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)對(duì)鑒定胚胎活檢中突變有用,但現(xiàn)代測(cè)序平臺(tái)要求下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)至少需要1 ng DNA;第三代測(cè)序至少需要1 μg DNA;讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)也需要高摩爾重量的DNA作為模板,通常DNA片段需要是>10 kb[60]。因此,為了滿(mǎn)足測(cè)序的要求,需要WGA具備以下條件:1)使用具有高加工效率和高保真度的酶,即具有校對(duì)活性,以確保較低的錯(cuò)誤率和較長(zhǎng)的擴(kuò)增子;2)通過(guò)使用通用引物和調(diào)整退火或再退火條件(即循環(huán)條件)來(lái)增加啟動(dòng)次數(shù);3)在擴(kuò)增(例如通過(guò)片段化)之前降低基因組的復(fù)雜性[19]。然而,目前的擴(kuò)增方法在擴(kuò)增成本、擴(kuò)增均勻性、基因組覆蓋度等方面還存在不足,還有待繼續(xù)改進(jìn)。

        4.3 活檢胚胎冷凍中存在的問(wèn)題

        胚胎冷凍保存會(huì)降低活檢胚胎的活力,進(jìn)而影響EGS的應(yīng)用。首先,胎冷凍保存的方法主要包括緩慢冷凍法和玻璃化冷凍法[61],但在牛上玻璃化胚胎比慢速冷凍胚胎具有更高的存活率[62]。Miki等[63]使用小鼠模型檢查了從TE活檢到玻璃化的不同時(shí)間間隔與囊胚存活率和囊胚生長(zhǎng)能力的相關(guān)性,表明了囊胚玻璃化應(yīng)在TE活檢后1 h或3 h以上進(jìn)行,在再擴(kuò)張過(guò)程中對(duì)活檢囊胚進(jìn)行玻璃化處理可能會(huì)降低植入后發(fā)育的能力,從而降低妊娠率。此外,根據(jù)Wilsher等[64]的報(bào)道,存活率還跟活檢囊胚的大小有關(guān),根據(jù)大小細(xì)分胚胎表明,較小胚胎(≤550 μm)玻璃化冷凍的妊娠率更低。

        5 小結(jié)與展望

        胚胎基因組選擇技術(shù)體系在畜牧業(yè)中具有重要應(yīng)用價(jià)值,然而為保障胚胎發(fā)育潛力和移植妊娠率,現(xiàn)有的胚胎活檢體系只能切割微量細(xì)胞用于后續(xù)的全基因組擴(kuò)增,微量細(xì)胞數(shù)的限制無(wú)法實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增后基因組的覆蓋度和準(zhǔn)確性。因此需要開(kāi)發(fā)微量細(xì)胞的高效擴(kuò)增體系,目前研究進(jìn)展中,由于現(xiàn)有單細(xì)胞基因組擴(kuò)增方法還不足以獲得所有基因組位點(diǎn)信息,致使胚胎基因組選擇技術(shù)的應(yīng)用受限。隨著擴(kuò)增體系的進(jìn)一步發(fā)展,研究人員需要改良單細(xì)胞擴(kuò)增體系,改造高效的高保真聚合酶以及擴(kuò)增方法等,進(jìn)一步提高WGA準(zhǔn)確性、并需要完善育種SNP芯片以及胚胎活檢細(xì)胞數(shù)量和后期凍存體系,使得移植妊娠率與鮮胚無(wú)異,從而保障EGS可以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的地步。

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