程茗慧, 劉 丹, 宋海旭, 閆承慧, 張效林

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院寒地心血管病全國重點實驗室 心血管內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016

冠心病是動脈血管壁慢性炎癥反應(yīng)性疾病［1］,炎性因子可以誘發(fā)糖類和脂質(zhì)成分的積聚沉積在動脈粥樣硬化的血管壁,導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊破裂,進一步導(dǎo)致冠狀動脈內(nèi)血栓的形成。糖尿病是冠心病患者的主要致病因素之一。有研究報道,冠心病合并2型糖尿病的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢,因而,在臨床上對冠心病合并2型糖尿病的防治十分重要［2-3］。冠心病合并2型糖尿病的發(fā)病機制目前尚不清楚,有研究發(fā)現(xiàn),冠心病合并2型糖尿病作為一種復(fù)雜的代謝性疾病,冠狀動脈血管壁的慢性炎癥反應(yīng)在此過程中發(fā)揮著重要的作用［4］。趨化因子CCL21通過募集血液中單核細胞等炎癥細胞進入病變區(qū)域參與機體免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)性疾病。趨化因子受體7(chemokine receptor 7,CCR7)是趨化因子CCL21的一個受體分子［5］。Damas等［6］研究發(fā)現(xiàn),冠心病患者中趨化因子CCL21表達水平較正常對照者明顯增高。同時,Luchtefeld等［7］發(fā)現(xiàn),CCL21-/-LDL-/-小鼠Western diet喂養(yǎng)16周后,CCL21的表達缺失可以減緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。CCL21作為一種趨化因子為CCR7受體的配體,在發(fā)揮趨化因子引起冠狀動脈血管壁炎癥反應(yīng)的同時,激活CCR7受體引起動脈粥樣硬化血管壁的免疫炎性反應(yīng)［8-10］。本研究旨在探討冠心病合并2型糖尿病的發(fā)病與CCL21基因rs2812377多態(tài)位點的基因頻率的改變是否存在相關(guān)關(guān)系,進一步分析CCL21基因rs2812377多態(tài)與冠心病合并2型糖尿病患者血漿中CCL21表達水平是否相關(guān)?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2009年3月至2011年9月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的225例冠心病合并2型糖尿病患者為研究對象,并設(shè)為冠心病合并2型糖尿病組。納入標準:空腹血糖≥7.0 mmol/L,或者餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L;均經(jīng)冠狀動脈造影檢查。同時,納入因胸痛入院但冠狀動脈造影證實其冠狀動脈主支無狹窄且不滿足糖尿病診斷標準的95例患者設(shè)為正常對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。所有研究對象均知情并簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 對入選的冠心病合并2型糖尿病患者及正常對照人群,由專門從事本項目研究的科研工作人員詢問病史。同時,收集兩組研究對象的血漿生化指標及心肌酶學(xué)的情況。

1.2.2 樣本的采集 兩組研究對象均在清晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血,搖勻,儲存在-20℃冰箱,用封口膜封閉保存。

1.2.3 血漿中CCL21濃度的檢測 按照美國RD公司生產(chǎn)的CCL21酶聯(lián)檢測試劑盒說明書建立趨化因子CCL21檢測的標準曲線。CCL21血漿濃度的檢測采用96孔上樣板,經(jīng)過上樣、孵育、反復(fù)沖洗、顯色后,在酶標儀上檢測待測定的冠心病合并2型糖尿病患者及正常對照人群血漿中的CCL21的表達。

1.2.4 DNA提取 將凍存的靜脈血室溫放置后,加入到15 ml尖頭離心管中,離心10 min(3 000 r/min);裂解紅細胞;加入10% SDS 0.5 ml,10 mg/ml蛋白酶K 50 μl,37℃、18～20 h。引物設(shè)計和合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。利用美國BIO-RAD公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀對CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增工作,整個擴增體系為50 μl,其中,包含冠心病合并2型糖尿病患者225例及正常對照樣品95例基因組的DNA,同時,在擴增體系內(nèi)加入dNTP、聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液、上下游引物和rTaq酶。進行聚合酶鏈反應(yīng),待反應(yīng)結(jié)束后,將待檢測樣品取出送到上海生工生物工程有限公司進行聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的測定。

1.3 Mass array技術(shù)分析CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)基因型的頻率 應(yīng)用Mass array飛行質(zhì)譜分析儀對CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點3個基因型TT/GT/GG特點進行分析驗證。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組研究對象的性別比例、高血壓比例、吸煙比例、體質(zhì)量指數(shù),以及總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象一般資料比較

2.2 CCL21 rs2812377多態(tài)基因型及等位基因分布頻率比較 趨化因子基因 CCL21 rs2812377多態(tài)位點存在TT型、GT型和GG型3種基因型。兩組研究對象的趨化因子基因CCL21 rs2812377多態(tài)位點TT型、GT型和GG型3種基因型頻率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義［P<0.05,OR=1.62(95%可信區(qū)間1.14～2.29)］。見表2。正常對照組T等位基因、G等位基因的分布頻率分別為44.21%(84/190)、55.79%(106/190);冠心病合并2型糖尿病組T等位基因、G等位基因的分布頻率分別為33.78%(152/450)、66.22%(298/450)。兩組T等位基因、G等位基因的分布頻率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 CCL21 rs2812377多態(tài)基因型分布頻率比較/例(百分率/%)

2.3 冠心病合并2型糖尿病患者血漿中CCL21表達水平與rs58801單核苷酸多態(tài)關(guān)聯(lián)分析 分別收集35例冠心病合并2型糖尿病患者及20例正常對照組研究對象的血漿標本,其中,冠心病合并2型糖尿病患者CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點TT+GT和GG位點的入選樣本例數(shù)分別為18例、17例,正常對照組分別為11例、9例。冠心病合并2型糖尿病組血漿中CCL21水平為(844.73±146.82)pg/ml,高于正常對照組的(507.77±103.62)pg/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。冠心病合并2型糖尿病組血漿中TT+GT基因型攜帶者血漿CCL21水平為(800.31±120.21)pg/ml,低于GG型基因型攜帶者的(925.79±129.90)pg/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常對照組TT+GT基因型及GG基因型攜帶者血漿CCL21水平分別為(517.81±134.25)pg/ml、(495.50±63.31)pg/ml,兩種基因型比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

冠心病發(fā)病受遺傳、環(huán)境等危險因素的影響,血漿血糖水平升高也是冠心病發(fā)病的重要危險因素之一,糖代謝產(chǎn)生異常是導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的重要原因［3-4］,降低冠心病合并2型糖尿病患者不良心血管事件的發(fā)生率對于心血管疾病的防治十分重要［5-6］。

冠心病合并糖尿病患者的動脈粥樣硬化是一種血管壁慢性炎癥反應(yīng)性疾病,同時合并血液中血糖水平的增高及胰島素抵抗的一種代謝性疾病。作為一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病,血液循環(huán)中的單核細胞等炎性細胞從血液循環(huán)向受損的血管壁募集是動脈粥樣硬化病變發(fā)生的始動環(huán)節(jié)［7］。免疫系統(tǒng)激活的炎癥反應(yīng)在冠心病發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用,CCL21能夠趨化血液循環(huán)中的單核細胞移行進入動脈血管壁,引起動脈血管壁慢性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致血液循環(huán)中的脂質(zhì)沉積在動脈血管壁,造成動脈粥樣硬化斑塊的進展和不穩(wěn)定斑塊的形成［8-10］。趨化因子CCL21通過與其受體CCR7結(jié)合后,誘導(dǎo)免疫細胞的激活,并引起機體免疫耐受反應(yīng)的發(fā)生。有研究報道,給與CCL21-/-/ApoE-/-雙基因敲除的小鼠Western diet喂養(yǎng)后,小鼠的動脈粥樣斑塊面積明顯減少,同時出現(xiàn)免疫細胞調(diào)節(jié)功能紊亂的現(xiàn)象［11-15］。因此,對趨化因子CCL21與其受體CCR7的研究對冠心病合并2型糖尿病的免疫治療具有重要的臨床意義。

目前,關(guān)于趨化因子CCL21基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病相關(guān)關(guān)系的研究報道較少見。本研究對CCL21基因rs2812377基因多態(tài)位點進行病例-對照研究,結(jié)果顯示,CCL21基因rs2812377不同基因型攜帶者血漿中CCL21表達水平在冠心病合并2型糖尿病患者中表達明顯上調(diào)。進一步分析CCL21基因rs2812377多態(tài)位點等位基因的頻率分布特點顯示,T等位基因在冠心病合并2型糖尿病人群的分布頻率為33.78%,低于對照人群的44.21%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義分(P<0.05);而G等位基因在冠心病合并2型糖尿病的分布頻率為66.22%,高于對照人群的55.79%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這說明,CCL21基因 rs2812377多肽位點G等位基因與冠心病合并2型糖尿病的發(fā)生存在相關(guān)關(guān)系,可能是冠心病合并2型糖尿病發(fā)病的獨立危險因素。

本研究存在的局限性:本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CCL21基因rs2812377多態(tài)位點與冠心病的發(fā)病存在相關(guān)關(guān)系,應(yīng)該在急性心肌梗死患者中進一步印證CCL21基因rs2812377多態(tài)位點是否與急性心肌梗死的發(fā)病存在相關(guān)關(guān)系。同時,未來需要在體實驗對CCL21基因rs2812377單核苷酸多態(tài)位點G/T等位基因進行突變分析,分別觀察G等位基因和T等位基因的突變對冠心病合并2型糖尿病的模型鼠的發(fā)病是否存在相關(guān)關(guān)系。

綜上所述,趨化因子CCL21表達水平在冠心病合并2型糖尿病患者血漿中明顯上調(diào),CCL21基因rs2812377多肽位點G等位基因可能是冠心病合并2型糖尿病發(fā)病的危險因素。