曾永明，周靜萱，欒 潔，黃小芮，陳松武

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，廣西 南寧 530002)

油茶籽是山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)油茶樹的種子，油茶樹有東方樹美譽，是我國主要的木本油料樹種，至今有2000多年的栽培和利用歷史。茶籽油、茶樹油或油茶籽油是從油茶籽中提取的不干性油脂，其脂肪酸的天然配比及組分與橄欖油相似，被稱為東方橄欖油；另外，茶籽油中含有橄欖油所不具有的活性物質(zhì)：茶多酚和山茶苷，其不飽和脂肪酸含量大于90%，且不含芥酸，比其它食用油更耐貯藏，不易酸敗，因此茶籽油有長壽油和東方神油的美稱。

最近，國家林業(yè)草原局、國家發(fā)展改革委、國家財政部聯(lián)合印發(fā)《加快油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展三年行動方案(2023—2025年)》，明確3年新增油茶種植127.8萬hm2(1917萬畝)、改造低產(chǎn)林85萬hm2(1275.9萬畝)，確保到2025年，全國油茶種植面積達到600萬hm2(9000萬畝)以上、茶油產(chǎn)能達到200萬t/a。我國油茶主要分布在長江中下游及以南地區(qū)，種植面積達437萬hm2，以湖南、江西和廣西油茶的種植面積最大，這3個省區(qū)總的種植面積占全國總種植面積的75%[1-2]。其中，廣西共種植油茶面積45.3萬hm2，約占全國油茶總面積的10. 4%，年產(chǎn)油茶籽25萬t，茶油6.48萬t，一二三產(chǎn)業(yè)綜合總產(chǎn)值達180億元，茶油種植面積、產(chǎn)量及產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值均居全國第3位，平均單產(chǎn)名列全國第一位。廣西油茶林主要集中在百色、柳州、河池、賀州4市，有20個縣油茶面積超過 6667 hm2(10萬畝)，其中三江侗族自治縣面積最大，達到4.727萬hm2(70.9萬畝)，是中國油茶之鄉(xiāng)和全國經(jīng)濟林(油茶)產(chǎn)業(yè)建設(shè)示范縣[3]。

食品中持久性有機物(Persistent organic pollutants，POPs)之一的增塑劑鄰苯二甲酸酯(Phthalate esters，PAEs)屬于有毒化合物，會干擾人體內(nèi)分泌，造成人體免疫力下降，對人身體有傷害。PAEs是由鄰苯二甲酸與特定的酯反應產(chǎn)生的、具有軟化作用的結(jié)構(gòu)類似的持久性有機污染物[4]。PAEs與塑料基質(zhì)之間以非共價鍵的形式結(jié)合，極易溢出，可通過各種暴露途徑進入人體。經(jīng)流行病學研究發(fā)現(xiàn)PAEs是一種明確的兒童持久過敏癥的環(huán)境誘導劑[5]。PAEs還會造成兒童性早熟、損傷遺傳基因、引起心血管疾病等。然而，我國目前還未真正實現(xiàn)食品生產(chǎn)過程中從農(nóng)田到餐桌的全程監(jiān)管，因此，市場監(jiān)督和監(jiān)測成了控制產(chǎn)品質(zhì)量的最后一道關(guān)口，也是保障人民身體健康的最重要一道防線。監(jiān)控油茶產(chǎn)業(yè)的持久性有機物污染問題是食品安全的關(guān)鍵因素，對于整個產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展起著非常重要的作用。隨著油茶產(chǎn)業(yè)的大力推廣，油茶籽質(zhì)量安全的問題引起政府和公眾的重視。關(guān)于油茶籽中PAEs的檢測方法尚未見報道[12～16]。由于油茶籽樣品富含油脂、蛋白質(zhì)和色素，基質(zhì)復雜，故將PAEs從樣品中分離富集出來成為決定分析結(jié)果可靠性的重要前提[10]。近年來，氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術(shù)已逐步應用于痕量有機分析[11]。本研究結(jié)合自身實驗室和參與該項工作的實際情況，參照GB 5009.271—2016《食品安全國家標準 食品中鄰苯二甲酸酯的測定》的要求[6]，運用多管漩渦混合比較了不同吸附劑對油茶籽基質(zhì)的凈化效果，建立了氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(GC-MS/MS)(MRM)測定油茶籽中17種PAEs的分析方法，對PAEs的標準曲線、檢出限/定量限、精密度、加標回收率一一進行方法驗證研究。該方法操作簡便，凈化效果好，準確度高，對于進行油茶籽樣品的PAEs監(jiān)測具有重要意義，可作為食用林產(chǎn)品中PAEs日常檢測的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

Satorius CE622-1CCN 電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，TDZ5高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司、湖南)，IKAMS 3 basic旋渦混合器基本型(艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司)，M32全自動高通量平行濃縮儀(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)，GCMS-TQ8050NX氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津(香港)有限公司、日本)。

1.1.2 化學試劑

無水硫酸鎂(MgSO4，分析純，上海麥克林生化有限公司)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18，粒徑 45 μm，深圳逗點生物技術(shù)有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA，粒度 4 μm，深圳逗點生物技術(shù)有限公司)；多壁碳納米管(NANO，粒徑2～5 nm，上海麥克林生化有限公司)；弗羅里硅土(Florisil，粒度 4 μm，深圳逗點生物技術(shù)有限公司)；石墨化炭黑 (GCB，粒徑38～120 μm，深圳逗點生物技術(shù)有限公司)；正己烷(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；丙酮(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；氯化鈉(分析純，西隴科學股份有限公司)；甲苯(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；二氯甲烷(色譜純，成都科隆化學品有限公司)；異辛烷(色譜純，成都科隆化學品有限公司)。

1.1.3 標準物質(zhì)

17種PAEs(鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP))混合標準溶液：2000 mg/L(上海安譜實驗科技股份有限公司)，16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標：100 μg/mL(天津阿爾塔科技有限公司)。

1.1.4 試驗樣品

油茶籽樣品采集于柳州市柳城縣沙埔鎮(zhèn)古仁村老古仁屯，新鮮油茶籽樣品 2000 g。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理樣品預處理，然后制得待分析樣品

1)樣品提?。憾喙茕鰷u混合-吸附劑凈化方法。精準稱取 10 g 研磨碎的油茶籽樣品于 50 mL 離心管中，加入正己烷/丙酮(體積比9∶1)混合液 20 mL，均質(zhì) 1 min，加入氯化鈉 2 g，以 2500 r/min 的速度多管漩渦混合 2 min，以 5000 r/min 的速度離心 5 min，待凈化。

2)提取液凈化：取上清液 4 mL 于已預先裝有 600 mg 無水硫酸鎂(MgSO4)、100 mg 十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、100 mg N-丙基乙二胺(PSA)和 5 mg 多壁碳納米管(NANO)的 15 mL 離心管中，以 2500 r/min 的速度多管漩渦混合 2 min，然后以 5000 r/min 的速度離心 5 min。取上清液 2 mL 到另一 15 mL 離心管中，在 40 ℃ 下氮氣吹到近干，加入質(zhì)量濃度為 5 μg/mL 的內(nèi)標溶液 20 μL，再在 40 ℃ 下氮氣吹至近干，用 1 mL 丙酮/異辛烷溶液(體積比1∶1)溶解，過 0.22 μm 有機濾膜，上氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS/MS測定。

3)標準溶液配制：準確移取PAEs混合標準品 50 μL 于 10 mL 容量瓶中，用丙酮/異辛烷(體積比 1 ∶ 1)稀釋，定容至 10 mL，充分搖勻，配制成17種PAEs標準中間液，再用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋的方法，分別加入質(zhì)量濃度為 5 μg/mL 的內(nèi)標溶液 20 μL，配制成質(zhì)量濃度為 0.00、0.02、0.05、0.10、0.20、0. 50 μg/mL 的PAEs標準曲線使用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4)空白試驗：除不加試驗樣品外，均按1)、2)測定步驟進行，操作過程中應避免接觸塑料制品。

1.2.2 儀器條件

1)色譜條件：色譜柱：島津Rtx-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度 60 ℃，以 40 ℃/min 升溫至 150 ℃，保持 1 min，再以 10 ℃/min 升溫 170 ℃，保持 1 min，再以 10 ℃/min 升溫 220 ℃，保持 1 min，最后以 5 ℃/min 升溫至 310 ℃，保持 3 min。進樣口溫度 290 ℃，載氣為高純氦氣(99.999%)，流速 1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量 1.0 μL。

2)質(zhì)譜條件：離子源：電子轟擊(EI)離子源，電離能量 70 eV，離子源溫度 280 ℃，傳輸線溫度 290 ℃，溶劑延遲 4 min。分別對17種鄰苯二甲酸酯(PAEs)和16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標進行全掃描(Q3 Scan)，以化合物最大的m/z作為母離子；然后在全掃描數(shù)據(jù)組中調(diào)用產(chǎn)物離子(product)掃描方法，創(chuàng)建Product Ion Scan方法，優(yōu)化碰撞電壓，用最優(yōu)碰撞電壓對母離子進行再次裂解，確定m/z最大的子離子用于定性，根據(jù)各化合物的出峰順序及母離子、子離子的m/z、碰撞電壓等參數(shù)建立氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS/MS多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方法。17種PAEs和16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標的質(zhì)譜信息見表1。

表1 17種PAEs 的離子對信息、碰撞電壓和保留時間

根據(jù)表1中各參數(shù)，得到PAEs污染物多反應監(jiān)測(MRM)方法，將該方法設(shè)定在氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)中，每次測樣時調(diào)出該方法，根據(jù)上述色譜和質(zhì)譜設(shè)定的條件，將待測樣品打入氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)中進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

影響提取回收率的關(guān)鍵因素是提取溶劑對目標物的溶解性大小，PAEs是一類弱極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，優(yōu)先選用常用的極性較弱試劑：正己烷、甲苯和二氯甲烷進行萃取[7]，研究了對空白樣品加標(0.10 mg/kg)提取平均回收率的影響，結(jié)果見表2。實驗結(jié)果表明，正己烷的提取效果最好。加入一定量的丙酮能夠更好的提取PAEs，分別用正己烷/丙酮(體積比9∶1)和正己烷/丙酮(體積比1∶1)對上述加標樣進行提取試驗，發(fā)現(xiàn)提取效果相似，且均優(yōu)于正己烷直接提取，但丙酮/正己烷(體積比1∶1)提取液中含有大量色素類雜質(zhì)，提取液顏色較深。因此，本研究選擇正己烷/丙酮(體積比9∶1)混合液作為PAEs的提取溶劑[8]。

表2 萃取溶劑對17種PAEs回收率的影響

2.2 QuEchERs凈化條件的優(yōu)化

油茶籽中PAEs提取液的干擾物含量較高，直接進樣分析會污染儀器，同時會因極強的基質(zhì)效應造成檢驗結(jié)果不準確。常用的凈化吸附劑有十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、 N-丙基乙二胺(PSA)、多壁碳納米管(NANO)、弗羅里硅土(Florisil)、石墨化炭黑 (GCB)等，其中PSA能去除樣品中的有機酸、茶多酚和兒茶素類物質(zhì)；C18能吸附非極性物質(zhì)，可去除少量色素、甾醇、脂肪和維生素等；NANO、Florisil、GCB的添加均可吸附色素類物質(zhì)，而NANO對色素的去除效果最優(yōu)，因此選擇C18、PSA、NANO作為凈化吸附劑。影響 QuEchERs 凈化效果的參數(shù)主要有吸附劑的用量、基質(zhì)溶劑的種類、基質(zhì)溶劑的用量、凈化時間等；因此選取這幾個因素，按照1.2.1的方法處理油茶籽樣品，考察了添加 0.20 mg/kg 水平加標質(zhì)量分數(shù)下的凈化效果，以17種PAEs目標物的平均回收率為考察指標來確定最優(yōu)化的QuEchERs 凈化條件[8]。

2.3 提取凈化條件的驗證

選擇了21份油茶籽空白樣品分成3組進行低、中、高三種濃度加標，按照 2.1～2.2 中的方法驗證提取和凈化條件，結(jié)果(表3)表明每組油茶籽空白樣品的加標優(yōu)化結(jié)果相似，說明該前處理方法適用于實際油茶籽中PAEs檢測。

表3 加標回收率試驗數(shù)據(jù)

2.4 儀器條件的優(yōu)化

2.4.1 色譜柱的選擇

PAEs是一類弱極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，本研究選擇弱極性島津Rtx-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行目標物的分離，實驗結(jié)果表明17種鄰苯二甲酸酯(PAEs)均得到了有效分離，且峰型尖銳對稱。

2.4.2 質(zhì)譜條件的選擇

在確定各種PAEs的母離子后，采用子離子掃描方式進行二級質(zhì)譜分析，分別選取豐度較強的主要碎片離子作為定量子離子，豐度次強的主要碎片離子作為參考定性子離子，通過優(yōu)化碰撞能量、離子能量、質(zhì)譜分辨率等質(zhì)譜參數(shù)，使各種PAEs的基峰離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度均達到最大。為優(yōu)化質(zhì)譜的參數(shù)，分別對17種PAEs和16種氘代同位素的鄰苯二甲酸酯內(nèi)標進行全掃描(Q3 Scan)，以化合物最大的m/z作為母離子，有助于消除雜質(zhì)的干擾；然后調(diào)用產(chǎn)物離子(product)掃描方法，創(chuàng)建Product Ion Scan方法，優(yōu)化碰撞電壓，對母離子進行再次裂解，確定m/z最大的子離子用于定性，根據(jù)各化合物的出峰順序及母離子、子離子的m/z、碰撞電壓等參數(shù)分別建成多反應監(jiān)測(MRM)方法。選用(MRM)采集模式，一方面是因為它能夠有效提高多種鄰苯二甲酸酯(PAEs)的分辨率，降低假陽性的檢出率，另一方面它具有專屬性強，靈敏度高，抗干擾能力強，是目前最靈敏的 MS 模式，尤其適用于多種持久性有機污染物的測定[7]。根據(jù)歐盟2002 /657 /EC指令規(guī)定可知[9]，只需要選擇兩個或兩個以上離子對作為確證點，就可準確定性定量。在選定的色譜條件下，利用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS/MS多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方式，對17種PAEs基質(zhì)加標溶液進行進樣分析，17種目標物均得到了良好的分離，且具有較高的靈敏度。

2.5 基質(zhì)效應的消除

對于痕量檢測來說，基質(zhì)效應是定量分析中必須考慮的問題?；|(zhì)效應評價主要以基質(zhì)匹配標準曲線斜率和純?nèi)軇藴是€斜率的比來確定的。當斜率比<0.9 時，為基質(zhì)抑制效應；當 0.9≤斜率比≤1.1 時，基質(zhì)效應可以忽略；當斜率比>1.1 時，為基質(zhì)增強效應[7]。為了消除基質(zhì)效應，本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。

2.6 標準曲線

選取已知空白油茶籽樣品，用1.2.1的前處理方法，得到基質(zhì)提取液，再使用逐級稀釋的方法制備與3)質(zhì)量濃度一致的基質(zhì)標準系列溶液，且分別加入質(zhì)量濃度為 5 μg/mL 的內(nèi)標溶液 20 μL，然后進行氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)(MRM)測定，以每種PAEs的質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子對的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見表4，17種PAEs在各自線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均高于 0. 999。

表4 標準曲線參數(shù)表

2.7 方法檢出限、定量限

對空白油茶籽樣品加標 0.01 mg/kg 進行測試，以3倍信噪比為檢出限(LOD)，10倍信噪比為定量限(LOQ)，17種PAEs的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)的計算結(jié)果見表5。

表5 檢出限、定量限試驗數(shù)據(jù)

2.8 回收率及精密度

在優(yōu)化后的實驗條件下，采用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS/MS多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方式進行油茶籽空白樣品加標回收試驗，添加水平分別為0.02、0.10、0.50 mg/kg 三種不同質(zhì)量分數(shù)，每個質(zhì)量分數(shù)做7個平行，回收率計算結(jié)果詳見表3。在3個不同添加水平下，17種PAEs的加標回收率為90.0%～115.0%，相對標準偏差(RSD)為0.2%～4.5%，表明方法的準確度和精密度均較好，見表6。

表6 精密度試驗數(shù)據(jù)

2.9 實際樣品檢測

利用本研究建立的氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS/MS多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)方法對2021～2022年抽檢的其中6份油茶籽樣品中的17種PAEs進行測定,所有樣品均檢出鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP),質(zhì)量分數(shù)范圍為0.0012～0.23 mg/kg,檢出率和檢出含量均較高的項目包括鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP),詳見表7。

表7 油茶籽樣品檢測結(jié)果 mg/kg

3 結(jié)論

目前，針對不同種類的PAEs，檢測人員會采用不同的檢測方法確保檢測結(jié)果的準確性，鄰苯二甲酸酯類化合物依據(jù)標準GB 5009.271—2016，利用GC-MS采用離子掃描(SIM)法檢測。本研究利用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方式建立一種同時檢測油茶籽17種PAEs持久性有機污染物的MRM方法，并且采用多管漩渦混合-吸附劑凈化方法，可一次提取油茶籽中的17種PAEs，極大提高了檢測的效率，節(jié)約了檢測的時間成本。

17種PAEs在各自線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.999；實驗測得檢出限/定量限均小于方法中給出的最低檢出限/定量限；分別對空白油茶籽樣品加標0.02、0.10、0.50 mg/kg 三種不同質(zhì)量分數(shù)平行測定7次，測得相對標準偏差(RSD)為0.2%～4.5%，<10%；17種PAEs的加標回收率為90.0%～115.0%；方法學參數(shù)驗證良好。該方法應用于實際樣品測定，平行性好，準確度好，靈敏度高[10]，適用于批量樣品處理，可用于不同油茶籽樣品中PAEs的日常檢測工作和實驗基地樣品監(jiān)測。

本研究進行了真實樣品采集、處理及檢測，檢測過程采取了有效的質(zhì)量控制措施，檢測過程均符合要求，檢測結(jié)果準確。通過驗證研究，該方法的標準曲線、檢出限/定量限、精密度和準確度均滿足方法學要求。