李 會(huì)，胡 朗，李 探，王 會(huì)*

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004；2.江蘇省免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004）

Bhlhe41 是堿性螺旋- 環(huán)- 螺旋（bHLH）蛋白家族成員，是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，Bhlhe41 通過(guò)與Bmal1 蛋白質(zhì)的相互結(jié)合作用或通過(guò)對(duì)E-box 元素的競(jìng)爭(zhēng)抑制了Clock/Bmal1 誘導(dǎo)小鼠Per1 啟動(dòng)子的反式激活，從而調(diào)控晝夜節(jié)律及睡眠[1]。除此之外，在外周免疫系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 被發(fā)現(xiàn)高度表達(dá)于B-1 細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞，調(diào)控B-1 細(xì)胞的發(fā)育及細(xì)胞增殖，影響B(tài)-1 細(xì)胞的發(fā)育、增殖和自我更新[2]。本課題組前期利用自主構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 熒光示蹤和敲除小鼠Bhlhe41dTomato-Cre/+，首次鑒定發(fā)現(xiàn)Bhlhe41 示蹤新的過(guò)渡性B-1 細(xì)胞祖細(xì)胞亞群，并發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Bhlhe41 表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞中[3]。再者，Bhlhe41 在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用，如大腸癌、肺癌等[4-5]。近期也有研究報(bào)道，Bhlhe41在中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的增殖中也具有重要的作用，可成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的靶點(diǎn)分子[6]。作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，Bhlhe41 可調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的晝夜節(jié)律以及B1 細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞的生命活動(dòng)。除此之外，Bhlhe41 也參與調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展，但Bhlhe41 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和具體作用機(jī)制目前尚不清楚。研究小鼠Bhlhe41 的蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對(duì)研究Bhlhe41 的功能具有重要的意義，目前尚未見Bhlhe41蛋白結(jié)構(gòu)分析的相關(guān)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)工具對(duì)小鼠Bhlhe41 的蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，旨在為研究轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 在生理和病理?xiàng)l件下的功能及調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI 獲取小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 的氨基酸序列。

1.2 方法

利用生物信息學(xué)分析軟件ExPASy 分析Bhlhe41蛋白的理化性質(zhì)和疏水性（https://web.expasy.org/protparam），SOPMA 分析Bhlhe41 的二級(jí)結(jié)構(gòu)（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），SMART 分 析Bhlhe41 的 結(jié) 構(gòu) 域 特 征（http://smart.embl-heidelberg.de/），Swiss Model 分析Bhlhe41 的三級(jí)結(jié)構(gòu)（https://swissmodel.expasy.org/），String 分析Bhlhe41 的相互作用蛋白（https://cn.string-db.org/cgi/download?sessionId=bDYDvh98tw RA）。

2 結(jié)果

2.1 Bhlhe41 的理化性質(zhì)

小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 的分子式為C1955H3104N558O575S10， 含410 個(gè) 氨 基 酸 殘 基， 由20種基本氨基酸組成。Bhlhe41 蛋白質(zhì)分子量為43 946.15，等電點(diǎn)為8.07，含有帶正電荷的氨基酸殘基（賴氨酸+ 精氨酸）45 個(gè)，含有帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（谷氨酸+ 天冬氨酸）43 個(gè)。Bhlhe41 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為53.55，根據(jù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定參數(shù)在40 以下判定為穩(wěn)定蛋白質(zhì)，推測(cè)小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。Bhlhe41 的脂溶系數(shù)為82.07，親水系數(shù)為-0.361，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。利用ProtScale 軟件分析Bhlhe41 的親/ 疏水性，結(jié)果顯示大多數(shù)氨基酸分值為較低的負(fù)值，表明Bhlhe41 是親水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)（見圖1）。

圖1 小鼠Bhlhe41 疏水性分析

2.2 Bhlhe41 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA 分析小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，窗口參數(shù)（Window width）設(shè)置為17，相似閾值（Similarity threshold）設(shè)置為8，狀態(tài)數(shù)（Number of states）設(shè)置為4。結(jié)果如圖2 所示。分析結(jié)果顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有38.54% 的α- 螺旋（158 個(gè)氨基酸殘基），6.59% 的延伸鏈（27 個(gè)氨基酸殘基），51.22%的無(wú)規(guī)卷曲（210 個(gè)氨基酸殘基），3.66%的β-轉(zhuǎn)角（15 個(gè)氨基酸殘基）。

圖2 小鼠Bhlhe41 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.3 Bhlhe41 結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SMART 軟件對(duì)小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄抑制因子含有一個(gè)HLH 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)ORANGE 結(jié)構(gòu)域（見圖3A）。利用Swiss Model 軟件預(yù)測(cè)Bhlhe41 三級(jí)結(jié)構(gòu)，以Bhlhe41 為模板（O35779.1.A）進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3B 所示，GMQE 值為0.58，GMQE 值在0 ～1 之間，越接近1則建模質(zhì)量越好，表明預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)可靠。

圖3 小鼠Bhlhe41 結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.4 Bhlhe41 相互作用蛋白分析

利用String 在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 的相互作用蛋白，若關(guān)聯(lián)系數(shù)＞0.4，表明蛋白相互作用顯著。String 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示與Bhlhe41 構(gòu)建成為核心相互作用網(wǎng)絡(luò)的10 個(gè)分子分別是GSK3β、Clock、Cry1、Cry2、Csnk1e、Bhlhe40、Arnt1、Per2、Nr1d1、Npas2。見圖4。

圖4 Bhlhe41 相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 除了參與晝夜節(jié)律的調(diào)控外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其也參與調(diào)控外周B1 細(xì)胞和肺巨噬細(xì)胞的生命活動(dòng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展，可能成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的靶點(diǎn)分子。本文通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件分析發(fā)現(xiàn)Bhlhe41 是一種不穩(wěn)定的親水性堿性蛋白質(zhì)，含有一個(gè)HLH 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)ORANGE 結(jié)構(gòu)域，與其構(gòu)建成核心相互作用網(wǎng)絡(luò)的蛋白主要包括調(diào)控晝夜節(jié)律的基因GSK3β、Clock、Cry1、Cry2 等。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是其功能的基礎(chǔ)，本文通過(guò)深入分析Bhlhe41 的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為深入研究Bhlhe41 在生理和病理?xiàng)l件下的功能及調(diào)控機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究中，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 是一個(gè)不穩(wěn)定的親水性堿性蛋白質(zhì)，此結(jié)果可為后續(xù)Bhlhe41 蛋白的提純、鑒定和純化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄因子bHLH 家族中與DNA 結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?yàn)镠LH 結(jié)構(gòu)域N 端的堿性區(qū)域（由10 ～20 個(gè)氨基酸組成），HLH 區(qū)域則主要負(fù)責(zé)蛋白與蛋白間的相互作用，形成同型或異型二聚體。與bHLH 家族的蛋白結(jié)構(gòu)一致，我們的預(yù)測(cè)結(jié)果中也顯示Bhlhe41 的N 端含有一個(gè)HLH 結(jié)構(gòu)域，但是，目前鮮有報(bào)道Bhlhe41中HLH 結(jié)構(gòu)域的功能，還需深入探討。轉(zhuǎn)錄因子可以與其他蛋白質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。本研究通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Bhlhe41 構(gòu)建成為核心相互作用網(wǎng)絡(luò)的分子主要包括調(diào)控晝夜節(jié)律的基因Clock、Cry1、Cry2、Bhlhe40、Csnk1e、Arnt1、Per2、Nr1d1、Npas2。此外，Bhlhe41 可能也與絲氨酸/ 蘇氨酸激酶GSK3β 相互作用。晝夜節(jié)律基因參與多種生命活動(dòng)，如調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等，再者，晝夜節(jié)律基因也與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)[7-9]。因此，Bhlhe41 相互作用蛋白的預(yù)測(cè)可為進(jìn)一步研究其在不同生理狀態(tài)下和不同病理狀態(tài)下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供一定的依據(jù)。

綜上所述，小鼠轉(zhuǎn)錄抑制因子Bhlhe41 調(diào)控多種生命活動(dòng)，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析其蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征及其相互作用蛋白，可為研究Bhlhe41 在不同生理和病理?xiàng)l件下的作用與功能提供必要的信息，也可為Bhlhe1 參與的相關(guān)疾病研究和治療提供新的分子靶點(diǎn)和干預(yù)策略。