◎ 林達(dá)峰,趙曉野,梁 瓊,王 儒
(海南省食品藥品檢驗(yàn)所??诜炙?,海南 ???570311)
本研究建立了火鍋底料中非法添加罌粟殼的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定法,采用乙腈和無(wú)水醋酸鈉萃取罌粟殼中的生物堿分。其中,色譜柱SHISEIDO CAPCELL PAK CR1∶4(5 μm,2.0 mm×150 mm)色譜分離;流動(dòng)相為20 mmol·L-1;乙酸銨∶乙腈(50∶50),0.5%甲酸為A相,乙腈為流動(dòng)相B相。該方法的嗎啡、可待因方法檢出限為12 μg·kg-1;定量限為40.0 μg·kg-1;線性范圍為1~40 ng·mL-1;罌粟堿、蒂巴因和那可丁為3 μg·kg-1;定量限為8 μg·kg-1,線性范圍為0.05~2 ng·mL-1,加標(biāo)回收率64.2%~101.1%。結(jié)果表明,用該方法可快速、準(zhǔn)確測(cè)定火鍋底料罌粟堿中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁、蒂巴因5種生物堿的含量,適用于火鍋調(diào)味料食品中罌粟殼的檢測(cè)。
罌粟殼含20余種生物堿類,堿性物質(zhì)會(huì)使人產(chǎn)生一種安逸和興奮的感覺,如果長(zhǎng)時(shí)間使用,可能會(huì)出現(xiàn)身體、心理、精神等方面的問(wèn)題。當(dāng)前,相關(guān)部門對(duì)于食品安全的重視日益提高,因此,快速準(zhǔn)確檢測(cè)食物中的生物堿類物質(zhì),具有十分重要的意義。具體來(lái)說(shuō),光譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法,是當(dāng)前對(duì)堿性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的重要手段[1]。
①儀器。AB5500+液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(Sciex);X1R型離心分離機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司);超純水產(chǎn)生器(美國(guó)密立浦公司);CP225D儀器(德國(guó)SARRIUS公司)。②試驗(yàn)材料和試藥。在磷酸中,可待因(批號(hào):171203-201005,含量:99.6%);嗎啡(批號(hào):171201-200822,含量:99.8%);鹽酸中的罌粟堿(批號(hào):171214-200404);蒂巴因(Tibanine);中國(guó)制藥工業(yè)研究所生產(chǎn)的那可?。ㄅ?hào):171224-200403)。③樣本(sample)。火鍋底料均為超市以及商鋪購(gòu)買的樣品[2]。
2.2.1 對(duì)狀態(tài)進(jìn)行分析
(1) 用 SHISEIDO CAPCELL PAK CR1∶4 (5 μ m、2.0×150 mm)、20 mmol·L-1醋酸銨-乙腈(50∶50)、0.5%的甲酸作 A相、乙腈作為流動(dòng)相 B相,以0.3 mL·min-1的速度進(jìn)行梯度洗脫,表1為分離生物堿的最佳梯度洗脫表。
表1 分離生物堿的最佳梯度洗脫表
(2)質(zhì)譜學(xué)狀況采用三重四極桿質(zhì)譜計(jì)和電化學(xué)噴射型離子源,采用正離子型采樣方式。套管氣體的氣壓為525 kPa;輔助氣體:6 L·min-1;回流:0.6 L·min-1。
2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制
①空白基體。各稱一份與待測(cè)組分相同的基質(zhì),不含被測(cè)定組分的樣品,依照被檢樣品的配制步驟,制成空白基體。②標(biāo)準(zhǔn)品。精確稱取適量嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因及那可丁標(biāo)樣,并將其與0.5%甲酸鹽的甲醇水混合制成1 mg·mL-1的溶液,用作標(biāo)準(zhǔn)液。
2.2.3 對(duì)試樣進(jìn)行預(yù)處理
稱量樣品2 g,置于具塞的50 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi),加5 mL的水,打圈1 min,然后加15 mL的乙腈,攪拌1 min。在超聲波萃取20 min之后,向其中添加1.5 g的無(wú)菌乙酸,然后添加6 g的無(wú)水硫酸鎂,使其在漩渦中旋轉(zhuǎn)1 min,然后在4 000 r·min-1的速度下進(jìn)行1 min的離心,然后純化[3]。將50 mg PSA、150 mg的無(wú)水硫酸鎂放在具塞的聚四氟乙烯的2 mL離心管中,用1 mL的微量吸管將1 mL以上的上清液放進(jìn)該離心管中,使其旋轉(zhuǎn)1 min,然后在5 000 r·min-1的速度下進(jìn)行1 min的分離,取出上清液0.5 mL在2 mL的離心管內(nèi),再添加20 mmol·L-1醋酸銨溶液0.5 mL,混勻,過(guò)0.45 μm微孔濾膜待測(cè)。
(1)線性區(qū)間在100 mL的小瓶子中精確地抽出1.00 mL以上的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用稀釋的溶劑(用20 mmol·L-1醋酸銨-乙腈=50∶50作為稀釋溶劑)將其定容至刻度。精密吸取本品1.00 mL于200 mL小瓶子內(nèi),以稀釋的有機(jī)溶劑定容至刻度,即得對(duì)照品[4]。精密吸取上述嗎啡及可待因溶液1.00、1.00、1.00、1.00、2.00 mL和4.00 mL于50、20、10、5、5 mL和5 mL容量瓶?jī)?nèi),使用稀釋的溶劑將其稀釋到刻度,制成濃度分別為1、2.5、5、10、20 ng·mL-1和40 ng·mL-1溶液;吸取上述蒂巴因、罌粟堿、那可丁溶液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL和1.00 mL于50、50、50、50、50 mL和25 mL容量瓶中,用稀釋溶劑稀釋至刻度,制成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1 ng·mL-1和2 ng·mL-1溶液,作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。
表2 5種生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線表
結(jié)果表明,嗎啡、可待因堿性標(biāo)準(zhǔn)為1~40 ng·mL-1,蒂巴因、罌粟堿和那可丁的線性關(guān)系為0.05~2 ng·mL-1,其相關(guān)性大于0.990。
(2)探測(cè)極限。以基線的3個(gè)噪音數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn),確定罌粟堿、那可丁和蒂巴因的最低含量為0.1 ng·mL-1,嗎啡和可待因的最小含量是2.5 ng·mL-1。根據(jù)該測(cè)定的結(jié)果,本方法罌粟堿、那可丁、蒂巴因的實(shí)際檢出限分別為0.010 μg·kg-1、0.011 μg·kg-1和0.026 μg·kg-1;嗎啡、可待因的實(shí)際檢出限為0.542 μg·kg-1和0.142μg·kg-1。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足方法要求。
(3)準(zhǔn)確度測(cè)試用5 ng·mL-1作為基體對(duì)照液,測(cè)定6個(gè)樣品的峰積,測(cè)定其含量,計(jì)算出嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的相對(duì)含量,相對(duì)誤差為0.8%~2.3%,具有較好的準(zhǔn)確度。
(4)樣品的加樣加標(biāo)法。每2 g各添加一份標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試樣制備中的步驟進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。用該法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),得到了滿意的結(jié)果。
(5)方法應(yīng)用。應(yīng)用本方法對(duì)餐飲食品中監(jiān)督抽檢的火鍋底料進(jìn)行檢測(cè),方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、信號(hào)穩(wěn)定,所得數(shù)據(jù)均能滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,為監(jiān)督抽檢任務(wù)奠定基礎(chǔ)。
(6)選取合適的流相組分。由于嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可丁均溶解在甲醇中,因此,在A的流動(dòng)相A中,采用100%的甲醇。結(jié)果表明,這些化合物的提取效果并不理想。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,流動(dòng)相為乙酸銨∶乙腈(50∶50),0.5%甲酸為A相,乙腈為流動(dòng)相B相,得到了不同的結(jié)果。
(7)選取一種樣本萃取液。結(jié)果表明,無(wú)論在強(qiáng)酸還是弱堿性環(huán)境下,罌粟皮中的生物堿溶解度均明顯提高,導(dǎo)致嗎啡、可待因、蒂巴因等生物堿在色譜柱上的滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng),從而使色譜峰形態(tài)變差,呈現(xiàn)明顯的高、低兩個(gè)峰。結(jié)果表明,在弱堿環(huán)境下,樣品的保持時(shí)間較長(zhǎng),且色譜性能較好。
針對(duì)以上問(wèn)題,本研究擬采用含5種生物堿在弱堿環(huán)境下可溶解于有機(jī)溶劑的特性,采用弱堿環(huán)境下的有機(jī)溶劑萃取罌粟殼多糖,研究其萃取效果。在此條件下,對(duì)火鍋湯的樣本進(jìn)行測(cè)量時(shí),應(yīng)當(dāng)將5 g樣本稱取到25 mL的比色管中,在堿性條件下,添加15 mL的純甲醇(添加0.625 mL的氨水),按照以上程序,利用超聲進(jìn)行提取,進(jìn)行定容并搖晃。
(8)確定凈化工藝。由于樣品中含有大量的活性組分,對(duì)樣品中的活性組分有很大的影響,因而,對(duì)樣品中活性組分的分離就顯得尤為重要。對(duì)此,本研究采用MCX色譜對(duì)萃取物進(jìn)行了分離,得到了較好的分離純化效果。然而,因其組分比較復(fù)雜,在過(guò)固相時(shí),其流動(dòng)速度會(huì)變得緩慢,且不易進(jìn)行淋洗,處理過(guò)程比較煩瑣[5]。PSA是一種極性的吸收劑,它既包含伯胺基,又包含仲胺基,具有很強(qiáng)的陰離子交換能力,對(duì)于除去油脂和糖分有著很好的效果,而C18對(duì)除去湯料中的顏料有很好的效果。因此,PSA和C18被選作可以除去雜質(zhì)干擾的純化劑。
(1)對(duì)火鍋原料中的罌粟皮含量的測(cè)定,參照QuECHERS方法對(duì)其進(jìn)行了測(cè)定。在生產(chǎn)實(shí)踐中,嗎啡的回收率只有32.5%,且回收率不高。針對(duì)傳統(tǒng)的火鍋底料中含有大量生物堿類成分的問(wèn)題,項(xiàng)目擬采用先用清水從鍋底中浸出的罌粟皮中的生物堿類成分,然后采用乙腈進(jìn)行萃取,并加入無(wú)水乙酸,使其從液相向有機(jī)相中遷移,然后用脫水的硫酸鎂除去水相中的水溶液。經(jīng)試驗(yàn)證明,該合成路線能顯著增加提取率,特別是對(duì)嗎啡的提取率,達(dá)到了試驗(yàn)要求。
(2)嗎啡等生物堿類為強(qiáng)的化學(xué)成分,采用18-C18柱層析,可獲得較好的分離效果。結(jié)果表明,對(duì)嗎啡類的生物堿類化合物,如嗎啡等,在C18柱上幾乎沒(méi)有滯留,因而不能進(jìn)行層析。在此基礎(chǔ)上,本研究采用高效的陽(yáng)離子交換型和反相型C18為填充劑,配比為1∶4的新型高效液相色譜柱,解決了原有的柱效問(wèn)題,具有重復(fù)性好、滯留時(shí)間長(zhǎng)、易于均衡等優(yōu)點(diǎn),可用于嗎啡等強(qiáng)極性物質(zhì)的高效拆分。
綜上所述,本研究采用了一種混合陽(yáng)離子MCX的溶膠相萃取柱進(jìn)行分離研究。用該方法對(duì)5種物質(zhì)進(jìn)行2 min的快速分離,結(jié)果準(zhǔn)確、快速,且重現(xiàn)性好。因此,本研究成果可用于我國(guó)食品中罌粟堿等物質(zhì)的快速準(zhǔn)確分析,具有重要的理論和實(shí)際意義。