◎ 禹 潔， 周 佳， 蘇阿龍， 王麗君， 顧培良

（甘肅省食品檢驗研究院， 甘肅 蘭州 730300）

生物堿是廣泛存在于自然界中的一類含氮堿性物質，具有一定的毒理作用和藥理作用[1-3]?？鄥㈩惿飰A廣泛存在于苦參、苦豆子等豆科植物當中[4]?？鄥A和氧化苦參堿均屬于苦參類生物堿中的活性成分，兩者在特定的條件下能夠互相轉化[5]，具有抗腫瘤、抗炎癥、調整心律、保護心臟、提高免疫力等多種功效[6-7]。除此之外，在病蟲害預防及治理方面，苦參堿和氧化苦參堿是一類利用率高，效果顯著的植物源殺蟲劑，具有低毒性、低殘留等優(yōu)點，被廣泛被應用在防治各種松毛蟲、茶毛蟲等農林害蟲領域[8-9]?；惫麎A即13,14-脫二氫苦參堿，氧化槐果堿即13,14-脫二氫氧化苦參堿，均屬苦參類生物堿，有研究發(fā)現，其具有調節(jié)心律失常和一定的中樞神經藥理作用[10]。槐定堿即5β-苦參堿，是苦參堿（α-苦參堿）的差向異構體，研究表明，槐定堿對多種癌癥尤其是消化道類癌癥療效很好，且不良反應發(fā)生率較低。近年，槐定堿因具有穩(wěn)定、化學結構靈活、生物利用度高、安全性好等優(yōu)點，受到學界廣泛關注[11-13]。

狼牙刺（Sophora viciifolia Hance）為豆科槐屬多年生灌木，又名白刺花，通常生長于海拔1 000～1 500 m的陽坡或河谷地帶，廣泛分布于我國的陜西、甘肅等地。狼牙刺不同部位中均含有苦參堿、氧化苦參堿等多種生物堿，其中，氧化苦參堿的含量在果實中可高達3.6%[14-17]。此外，狼牙刺還是一種特色蜜源植物，因狼牙刺花而得名的狼牙蜜，產量大，品質獨特，內含豐富的礦物質、氨基酸、維生素和活性酶等營養(yǎng)物質，能夠被人體吸收，體現了較高的食用和藥用價值。狼牙蜜盛產于甘肅兩當縣、徽縣，是在得天獨厚的地理環(huán)境和優(yōu)渥的資源條件下，經過長期的自然選擇和精煉加工孕育而生的一種特殊產品，年產量達5萬多kg，遠銷中外，兩當縣也因此被譽為“狼牙蜜之鄉(xiāng)”[18-19]。2008年，原國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局將兩當狼牙蜜作為地理標志產品[20]。目前，對狼牙刺植株中生物堿的組成和含量測定已有不少報道[21-23]，蜂蜜中生物堿的測定采用固相萃取、QuEChERS提取和凈化，然后用高效液相色譜－串聯質譜法進行定性和定量分析[1-2]，但對狼牙蜜中苦參類生物堿的組成及含量測定至今未有報道。

本研究以兩當狼牙蜜中苦參類生物堿為研究對象，采用液液萃取結合高效液相-串聯質譜建立一種簡單、快速、準確的定性定量分析方法，旨在為狼牙蜜中苦參類生物堿的風險評估提供依據，更好地研究與開發(fā)與狼牙刺有關的植物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、三氯甲烷、甲酸：色譜純（德國默克公司）；乙酸銨：色譜純（上海安譜實驗科技股份有限公司）；氨水：分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

苦參堿（純度：98.9%)、氧化苦參堿（純度：99.1%)、氧化槐果堿（純度：99.4%)、槐定堿（純度：98.5%)，均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；槐果堿（純度：99.85%)，購于Stanford Chemicals 上海佰世凱化學科技有限公司。

蜂蜜：共65份，根據蜜源進行分類。其中，狼牙蜜10份，槐花蜜10份，棗花蜜10份，油菜蜜10份，椴樹蜜5份，枸杞蜜5份，桂花蜜5份，茴香蜜5份，野菊花蜜5份。樣品均來源于甘肅省兩當縣及蘭州市農貿市場和大型超市。

1.2 儀器與設備

5500QTRAP高效液相色譜串聯質譜儀（美國AB.SCIEX公司）；ME403T電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；Elmasonic P 300 H超聲波清洗機（德國Elma公司）；SORVALL LYNX 6000高速冷凍離心機（美國賽默飛公司）；VORTEX 3渦旋混合器（德國IKA公司）；N-EVAP116氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取攪拌均勻的蜂蜜樣品2 g（準確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入3 mL氨水使樣品溶解，再加入10 mL三氯甲烷，渦旋振蕩3 min，超聲提取30 min，8 000 r·min-1離心5 min，用吸管將下層三氯甲烷層轉移至新的50 mL離心管中，用10 mL三氯甲烷反復洗滌吸管，洗滌液轉移至殘渣中經上述相同操作進行提取。重復此過程3次，合并提取液于40 ℃氮氣吹干。殘留物以初始流動相溶解并定容至1 mL。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測。

1.3.2 標準溶液配制

（1）混合標準儲備液。準確稱取適量的5種苦參類生物堿標準物質于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成濃度為100 μg·mL-1的標準儲備溶液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

（2）混合標準中間液。準確量取配制的混合標準儲備液100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成濃度為1 μg·mL-1的混合標準中間液。

（3）標準系列工作液。臨用時，取配制的混合標準中間液適量，用初始流動相稀釋制成含5種苦參類生物堿濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標準系列工作液。

（4）基質標準溶液 。用空白基質蜂蜜樣品按1.3.1樣品前處理方法制得空白基質溶液，采用空白基質溶液配制成0.1、0.2、0.5、1.0 、2.0、5.0、10.0 、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的基質匹配標準工作液。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（50×2.1 mm，1.7 μm）；色譜柱溫度：30 ℃；進樣量：10.0 μL；流動相：A為2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B為2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.25 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～1.0 min，95% A；1.0～4.0 min，95%～10% A；4.0～6.0 min，10% A；6.0～6.1 min，10%～95% A；6.1～8.0 min，95% A。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（Electron Spray Ionization， ESI)，正離子模式掃描；離子化電壓（IonSpray Voltage， IS）：+5 500 V；動態(tài)多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring， MRM）模式，5種苦參類生物堿的質譜參數詳見表1。

表1 5種苦參類生物堿的質譜參數表

1.4 數據處理

將實驗獲取的數據在MultiQuant軟件進行處理分析，以5種苦參類生物堿的保留時間、定性離子、定量離子及兩個子離子的相對豐度比進行定性判斷；繪制基質標準曲線定量分析蜂蜜樣品中的不同目標物；采用Origin 2022軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質譜條件

在正離子模式下，找出加合離子峰，在一定的去簇電壓和碰撞能量下，選擇子離子中相對豐度較強的2對子離子作為定性和定量離子對。在去簇電壓不斷增大的變化過程中，簇離子會隨之減少，目標加合離子的響應強度增高，當電壓增大到一定數值時，由于源內裂解的發(fā)生，導致目標加合離子的響應隨之降低，從而優(yōu)化出最佳去簇電壓。當碰撞能量不斷增大過程中，目標加合離子響應會降低，特征子離子響應增強，當達到一定數值時，特征子離子會進一步碎裂，從而響應減弱，此過程可優(yōu)化出最佳碰撞能量（見表1）。

2.1.2 色譜條件

本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水；0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸銨；（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液）作為流動相時5種苦參類生物堿的保留時間及峰形。結果表明，乙腈-0.1%甲酸水體系下目標物分離效果不佳且拖尾現象嚴重；0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸銨體系下，因為乙酸銨的加入使5種苦參類生物堿的分離效果得到改善，但是出峰時間較早，可能存在目標物未完全洗脫的情況。（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液）作為流動相時，5種苦參類生物堿出峰時間適宜，目標物響應強度增加，峰形尖銳，分離效果較好，可能是由于加入緩沖鹽后，可以降低堿基與色譜柱中極性的硅醇基相互作用，從而改善因其導致的拖尾效應[24]。因此，采用（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液）作為流動相進行梯度洗脫，在8 min內完成目標物的測定（如圖1、2）。

圖1 5種苦參類生物堿標準溶液的MRM色譜圖

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

在萃取過程中，本研究比較了甲醇、乙腈、正己烷和三氯甲烷作為提取劑的提取效果。其中，正己烷對極性化合物的提取效果較差；甲醇作為提取劑，會出現微量沉淀物，提取效率低；乙腈和三氯甲烷都能使目標物富集，提取效果較好，但在最后的濃縮過程中三氯甲烷更易揮發(fā)，能更快氮吹干，進而縮短前處理時間，提高前處理的效率（如表2）。此外，本研究進行了多次重復提取，可以使目標物提取充分，降低損失，提高回收率。

2.2.2 料液比的優(yōu)化

蜂蜜中含糖量較高，一般在60%～80%，若直接提取可能由于蜂蜜本身黏度較大，目標物附著于糖分上，影響提取效果[25]。因此，先用適量水溶解狼牙蜜，使其成為均勻相，再進行后續(xù)提取步驟。直接用三氯甲烷萃取，提取效果較好。為了更進一步提高回收率，使用適量氨水溶解狼牙蜜，同時，因苦參類生物堿為堿性化合物，遂在萃取溶劑中加入適量堿，以增加其在三氯甲烷中的溶解度。

此外，本研究考察了狼牙蜜質量同氨水添加量的不同配比，隨著氨水添加量的增加，回收率也相應提高，由圖3可知，當狼牙蜜質量與氨水比例為1∶1.5時，提取效果最佳，回收率最高；當狼牙蜜質量與氨水比例為1∶2時，回收率略微下降，繼續(xù)增大氨水比例，回收率繼續(xù)降低。故選擇稱取2.00 g狼牙蜜，加入3 mL氨水進行溶解。

圖3 料液比對回收率的影響圖（n=3）

2.3 基質效應考察

基質效應是指對復雜目標物進行分析時，除了被分析物外，其他存在的物質對整個分析過程造成的影響?；|效應可以在很大程度上導致目標物信號的增強或抑制，從而影響定性和定量分析。干擾物質可以是樣品的組分、預處理萃取過程中釋放的化合物，或添加到流動相中以提高色譜分辨率的試劑等?？傊?，目標分析物的化學性質、基質的種類、基質與分析物的濃度比、提取工藝、色譜條件以及質譜儀器的種類和電離條件，都可以引起基質效應[26]。在高效液相-串聯質譜分析中，基質效應的考察顯得非常重要。基質效應采用標準曲線法，即基質效應是基質標準系列濃度曲線的斜率/溶劑標準系列濃度曲線的斜率進行評估[27]。基質效應小于100%，表明存在基質抑制；基質效應大于100%，表明存在基質增強。

本實驗選用空白蜂蜜樣品，按照1.3.1的前處理方法制得空白基質溶液，配制基質標準工作曲線。同時，用初始流動相配制溶液工作標準曲線，得到兩者斜率比，考察基質效應。結果顯示，5種苦參類生物堿均存在基質抑制效應。因此，本實驗配制基質標準曲線進行了分析定量，數據見表3。

表3 5種苦參類生物堿基質效應表

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法線性范圍及檢出限

參照2.1優(yōu)化后的儀器條件，對5種苦參類生物堿混合標準工作液進行測定，繪制以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標的標準曲線。5種苦參類生物堿在0.1～50 ng·mL-1濃度范圍線性關系良好，相關系數R2≥0.999 1。以標準溶液中目標組分最低水平的3倍信噪比為檢出限（LOD），10倍信噪比為定量限（LOQ），計算得到本方法的檢出限和定量限（見表4）。當稱樣量為2.00 g時，檢出限為0.10～0.20 μg·kg-1；定量限為0.30～0.45 μg·kg-1。

表4 5種苦參類生物堿的線性方程、相關系數、檢出限與定量限表

2.4.2 回收率和精密度

為了確證該方法的可行性，本實驗對狼牙蜜樣品進行加標回收實驗，同一批次狼牙蜜中添加3個含量水平的標準溶液，分別為0.5、5 μg·kg-1和20 μg·kg-1，按照1.3.1所述方法進行前處理后上機分析。由表5可知，5種苦參類生物堿的平均回收率在87.82%～93.18%之間，RSD≤3.8%。該結果表明，本實驗建立的檢測方法在不同濃度加標水平下，能夠體現較高的回收率和較好的精密度，能夠滿足狼牙蜜樣品中5種苦參類生物堿的檢測要求。

表5 5種苦參類生物堿在不同加標水平下的回收率和相對標準偏差表(%,n=6)

2.5 實際樣品測定

本實驗采用前處理方法和液相色譜-串聯質譜條件，對甘肅省兩當縣及蘭州市農貿市場和大型超市的65份蜂蜜進行了5種苦參類生物堿的分離提取及測定（圖4），各目標物含量如表6所示。實際樣品分析結果表明，5種苦參類生物堿普遍存在于不同蜜源的蜂蜜中，只有10批次油菜花蜜中未檢出苦參堿和槐定堿；10批次棗花蜜和5批次野菊花蜜中未檢出槐定堿。狼牙蜜中5種苦參類生物堿的含量均高于其他蜜源品種的蜂蜜，在10批次狼牙蜜中苦參堿最高含量達0.769 μg·kg-1，氧化苦參堿達到2.102 μg·kg-1，槐果堿達到2.332 μg·kg-1，氧化槐果堿為5.987 μg·kg-1，槐定堿為0.882 μg·kg-1。由于狼牙刺的不同器官中均含有苦參類生物堿，其作為一種特色蜜源植物，因而狼牙蜜中也普遍含有苦參類生物堿。

圖4 樣品中5種苦參類生物堿的MRM色譜圖

3 結論與討論

本研究建立了液液萃取結合高效液相色譜-串聯質譜同時測定狼牙蜜中5種苦參類生物堿的檢測方法，在堿性條件下液液萃取對目標物進行提取富集，同時，優(yōu)化色譜條件和質譜條件，采用基質外標法加以定量。實驗表明，5種苦參類生物堿在0.1～50 ng·mL-1濃度范圍線性關系良好（R2＞0.999 1），方法檢出限的范圍在0.1～0.2 μg·kg-1之間；定量限范圍在0.30 ～0.45 μg·kg-1之間。在不同的加標水平下，5種苦參類生物堿的平均回收率在87.82%～93.18%之間，RSD≤3.8%。由此可見，該方法提取率高，定量準確，適用于狼牙蜜中5種苦參類生物堿的檢測。同時，測定的不同蜜源品種蜂蜜中5種苦參類生物堿的含量差異較大，狼牙蜜中5種苦參類生物堿的含量均高于其他品種。

綜上所述，本研究重點關注兩當狼牙蜜中苦參類生物堿的含量測定，建立了一種高效、準確的檢測方法，旨在為狼牙蜜中苦參類生物堿的風險評估提供參考，為學界全面了解狼牙蜜的食用和藥用價值提供研究途徑和技術支撐。