◎ 李錦晶，李 凡，易 渡，張沿軍

（康寶萊蕾碩（湖南）天然產(chǎn)物有限公司，湖南 長沙 410100）

大蒜在我國的種植歷史悠久，作為食物、香料，在國內(nèi)的產(chǎn)銷量一直較高。同時(shí)，其作為具有藥用價(jià)值的食材，在各種疾病的治療中作為傳統(tǒng)民間藥物使用[1]，其健康益處主要與有機(jī)含硫成分有關(guān)[2-3]。大蒜中的有機(jī)含硫化合物主要是蒜氨酸和大蒜素2種活性成分，通常用來表征大蒜和大蒜相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。由于蒜氨酸酶的存在，蒜氨酸是相當(dāng)不穩(wěn)定的，可以迅速轉(zhuǎn)化為大蒜素；大蒜素性質(zhì)極不穩(wěn)定，容易分解，不能長期保存。2種活性成分的極性以及穩(wěn)定性差異較大，導(dǎo)致準(zhǔn)確測(cè)定大蒜及制品中的蒜氨酸和大蒜素含量的方式也差異較大。其中，蒜氨酸通常用液相色譜測(cè)定[4-5]；大蒜素有用氣質(zhì)聯(lián)用儀[6-7]進(jìn)行測(cè)定， 但更多采用分光光度法[8-9]或者反相色譜[10-11]測(cè)定。因此，建立一種同時(shí)測(cè)定2種物質(zhì)的方法，可以極大提高分析效率。

在本研究中，我們開發(fā)了一種將蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)化生成大蒜素的方法， 并建立了一種控制其轉(zhuǎn)化的方法。測(cè)定方法的關(guān)鍵在于防止蒜氨酸轉(zhuǎn)化為大蒜素，并在樣品制備和分析中，同時(shí)穩(wěn)定蒜氨酸和大蒜素。本研究采用改進(jìn)的柱前衍生的樣品制備方法，不僅可以減少傳統(tǒng)提取方法中常見的干擾，而且可以同時(shí)測(cè)定蒜氨酸和大蒜素。

1 材料與方法

1.1 材料

蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品， USP, 目錄# 1012950; 乙腈，HPLC級(jí)；乙酸銨，ACS級(jí)； 三水合醋酸鈉，ACS ；鄰苯二甲醛（OPA）試劑，安捷倫# 5061-3335 （打開后可在冰箱中保存不超過2周）; 十水四硼酸鈉，GR級(jí)；半鹽酸羧甲氧基胺，ACS級(jí) 。

1.2 儀器

Waters 2695液相色譜儀，包括泵、脫氣器、自動(dòng)進(jìn)樣器、溫度控制模塊和PDA檢測(cè)器；分析天平；旋渦混合器；研磨機(jī)；超聲發(fā)生器；振蕩器；離心機(jī)。

1.3 溶劑準(zhǔn)備

①蒜氨酸酶抑制劑溶液（1 mg·mL-1）：100 mg半鹽酸羧甲氧基胺到100 mL純凈水中。②硼酸緩沖溶液（pH 9.0）: 將1.9 g十水四硼酸鈉溶解在約100 mL的純凈水中，用0.2 mol·L-1硼酸調(diào)整pH值為9.0。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蒜氨酸測(cè)試樣品溶液的制備

稱取100 ～1 000 mg （精確到0.1 mg) 之間的粉末樣品裝入35 mL螺旋蓋試管中，加入蒜氨酸酶抑制劑溶液 （1 mg·mL-1） 20 mL，渦旋30 s。超聲15 min，每隔5 min手動(dòng)搖5 s。用0.2 μm針式過濾器過濾，丟棄前幾滴濾液，收集約5 mL樣品至一個(gè)小燒杯中。

1.4.2 衍生化程序

在小瓶中加入硼酸緩沖液50 μL， 樣品液10 μL，渦旋10～15 s，再加入OPA試劑10 μL，旋渦10～15 s，等待2 min左右加入純水130 μL，將此溶液放入HPLC進(jìn)樣瓶用于分析。

1.4.3 大蒜素測(cè)試樣品溶液的制備

稱取100～1 000 mg （精確到0.1 mg）之間的粉末樣品裝入35 mL螺旋蓋試管中，加入20 mL醋酸鈉緩沖液，渦旋30 s左右。超聲15 min，每隔5 min手動(dòng)搖動(dòng)5 s。靜置10 min后，加入半鹽酸羧甲氧基胺 約20 mg，渦旋30 s。用0.2 μm針式過濾器過濾，丟棄前幾滴濾液，放入HPLC進(jìn)樣瓶用于分析。

1.5 測(cè)定蒜氨酸及大蒜素的色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA,150×4.6 mm；檢測(cè)波長：254 nm、520 nm；流動(dòng)相A：20 mmol乙酸銨；流動(dòng)相B：乙腈/水=90/10（體積比）；梯度洗脫程序見表1；樣品溫度：5 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL（如表1）。

表1 梯度洗脫程序表

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備

1.6.1 蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)原液

精確稱量約10 mg（精確到0.01 mg）蒜氨酸參考標(biāo)準(zhǔn)倒入10 mL容量瓶中，加入約6 mL水，將溶液超聲處理10 min，用水稀釋至刻度，搖勻備用。

1.6.2 蒜氨酸工作標(biāo)準(zhǔn)溶液

工作標(biāo)準(zhǔn)溶液1：將1 mL蒜氨酸原液標(biāo)準(zhǔn)溶液移至10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻。工作標(biāo)準(zhǔn)溶液2：將2.5 mL蒜氨酸原液標(biāo)準(zhǔn)溶液移到5 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度并搖勻。工作標(biāo)準(zhǔn)溶液3：蒜氨酸原液標(biāo)準(zhǔn)溶液作為工作標(biāo)準(zhǔn)溶液3。每次工作溶液使用時(shí)，用0.2 μ注射器過濾器過濾儲(chǔ)存溶液，并遵循衍生化程序進(jìn)行衍生化。

1.6.3 大蒜素工作標(biāo)準(zhǔn)溶液

取1.0 mL蒜氨酸工作標(biāo)準(zhǔn)溶液2（約0.50 mg·mL-1），加入100 μL粗蒜氨酸酶溶液，室溫靜置10 min。用水稀釋，用0.2 μ注射器過濾器過濾。

其中，162.26: 大蒜素的分子量；354.42: 蒜氨酸分子量的2倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化溶液pH值對(duì)蒜氨酸產(chǎn)率和穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，蒜氨酸面積隨著緩沖液的pH值增加而增加。當(dāng)緩沖液的pH值在4.0 ～ 5.5之間時(shí)，蒜氨酸的衍生轉(zhuǎn)化效率較低；當(dāng)緩沖液pH值為5.5～10.0時(shí)，蒜氨酸衍生化反應(yīng)效率轉(zhuǎn)化較高且沒有明顯變化。伴隨堿度的增加，蒜氨酸衍生化產(chǎn)物變得更加穩(wěn)定。當(dāng)pH值在9.0～10.0之間時(shí)，降解率不超過5%，蒜氨酸穩(wěn)定時(shí)間至少為48 h。

圖1pH 值對(duì)蒜氨酸穩(wěn)定性的影響圖

2.2 提取液pH值對(duì)大蒜素產(chǎn)率和穩(wěn)定性的影響

考察了不同pH值下大蒜素的得率和穩(wěn)定性。在大蒜素樣品的制備過程中，使用了一系列pH值為4.0 ～8.0的提取液。在5 ℃下保存，分別在0、8、10、15和21 d時(shí)評(píng)價(jià)大蒜素的穩(wěn)定性。

結(jié)果如圖2所示，當(dāng)pH值為4.0時(shí)，大蒜素產(chǎn)率很低，且沒有明顯變化。當(dāng)pH值為4.5 ～8.0時(shí)，反映出大蒜素在酸性條件下比在堿性條件下更易分解。當(dāng)pH值在5.0～8.0之間時(shí)，大蒜素保持穩(wěn)定至少10 d。綜合考慮大蒜素得率、穩(wěn)定性和蒜氨酸酶活性[12]，選擇pH 6.0的緩沖液作為提取液。

圖2pH值對(duì)大蒜素穩(wěn)定性的影響圖

2.3 溫度對(duì)大蒜素溶液的影響

考察了大蒜素在不同貯藏溫度下的穩(wěn)定性。提取后，大蒜素樣品溶液分別在室溫和5 ℃下保存0、2、4、10、16和40 h，0、8、10、15和21 d后進(jìn)行評(píng)價(jià)。

從圖3、圖4可以看出，大蒜素在溫度為5 ℃時(shí)最為穩(wěn)定，15 d后僅略有下降，降解率不超過5%。在室溫（25 ℃）下，該化合物的分解趨勢(shì)更為明顯，但呈漸進(jìn)式，16 h后分解速率為9%。

圖3 25 ℃大蒜素樣品的穩(wěn)定性圖

圖4 5℃大蒜素樣品的穩(wěn)定性圖

2.4 精密度

每個(gè)樣品按試驗(yàn)方法制備6個(gè)重復(fù)樣品， 將樣品與新配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對(duì)比分析。計(jì)算了各樣品中蒜氨酸和大蒜素的含量。如表2、表3所示，蒜氨酸和大蒜素6個(gè)結(jié)果的RSD均不大于2%。

表2 大蒜提取物中蒜氨酸及大蒜素的精密度結(jié)果表（大蒜提取物， R11255)

2.5 準(zhǔn)確度 （加標(biāo)回收率）測(cè)試

考慮到基體干擾方法的準(zhǔn)確度，本研究采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，已知量的蒜氨酸和大蒜素原液被添加到樣品溶液中，為方便測(cè)定， 根據(jù)各樣品中目標(biāo)化合物本底值不同，分別以3個(gè)水平加標(biāo)，每個(gè)水平做3次重復(fù)，測(cè)量的加標(biāo)樣品中每個(gè)組分的量相對(duì)于樣品中相應(yīng)組分的加入量被計(jì)算為回收率。在此基礎(chǔ)上，以精密度試驗(yàn)得到的大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的濃度，作為試驗(yàn)樣品中蒜氨酸和大蒜素的基線含量，分別計(jì)算了加標(biāo)樣品中發(fā)現(xiàn)的蒜氨酸和大蒜素的數(shù)量與預(yù)期的蒜氨酸和大蒜素的回收率。

如表4所示，蒜氨酸和大蒜素的加標(biāo)回收率均在80%～120%之間。原料和片劑這兩種基質(zhì)的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果差別不大， 6種目標(biāo)化合物的平均回收率在90%～110%, 說明此方法具有較高的穩(wěn)定性和精密度。

表4 大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸的準(zhǔn)確度結(jié)果表

3 結(jié)論

當(dāng)前，學(xué)界許多研究對(duì)于蒜氨酸以及大蒜素的測(cè)定都是采用分開的方法，而本研究通過柱前衍生化反應(yīng)，選取pH 6作為萃取條件，使用安捷倫ZORBAX Eclipse AAA色譜柱為分離柱，同時(shí)測(cè)定蒜氨酸以及大蒜素。樣品再現(xiàn)性以及加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠、精密度較好，可應(yīng)用于大蒜原料、大蒜片中的蒜氨酸及大蒜素的測(cè)定。