張 暉，張黎明，王赫然，鄭雄飛

（1.中國科學(xué)院沈陽自動(dòng)化研究所機(jī)器人學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016；2.中國科學(xué)院機(jī)器人與智能制造創(chuàng)新研究院，遼寧 沈陽 110169；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

1 引言

嚴(yán)重創(chuàng)傷、壓迫性損傷以及醫(yī)源性損傷等都可能導(dǎo)致創(chuàng)口周圍神經(jīng)受損，嚴(yán)重影響著感知和運(yùn)動(dòng)等功能。周圍神經(jīng)損傷作為臨床上作為常見的病癥之一，全球每年新增患者高達(dá)百萬，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)［1］。目前，小尺度的神經(jīng)損傷可以通過手術(shù)縫合的方式進(jìn)行治療，當(dāng)神經(jīng)受損長度超過20mm時(shí)就需要進(jìn)行自體神經(jīng)移植或者神經(jīng)支架修復(fù)等治療方式［2］。自體移植的神經(jīng)不僅來源有限，還會(huì)導(dǎo)致供給區(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)缺損和無法匹配修復(fù)尺寸等問題［3］。目前商品化的產(chǎn)品主要有中空神經(jīng)導(dǎo)管和脫細(xì)胞神經(jīng)支架兩種類型。其中神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)存在管壁較薄容易塌陷、缺乏空間三維結(jié)構(gòu)無法長距離引導(dǎo)以及降解太慢限制神經(jīng)恢復(fù)速度等問題，而脫細(xì)胞神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)存在著交叉感染、免疫排斥和脫細(xì)胞基質(zhì)供給等風(fēng)險(xiǎn)［4］。此外，由于神經(jīng)缺損具有高度隨機(jī)性，現(xiàn)有商品化支架并不能滿足對缺損神經(jīng)修復(fù)的快速性和匹配度要求，限制了神經(jīng)支架的大規(guī)模應(yīng)用和推廣。

近些年，仿生神經(jīng)支架的制備工藝成為了一項(xiàng)熱點(diǎn)研究內(nèi)容，并且發(fā)展出了多種制備方式，其中仿生多通道結(jié)構(gòu)神經(jīng)導(dǎo)管的制備工藝主要以鑄造工藝為主。文獻(xiàn)［5］中通過對含有鹽溶液的聚合物進(jìn)行鑄造成型，基于無機(jī)鹽結(jié)晶析出原理制備了多孔薄膜結(jié)構(gòu)，最后從鹽溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)角度對支架的孔隙率、比表面積和微管直徑等參數(shù)進(jìn)行了研究。文獻(xiàn)［6］通過明膠材料在模具內(nèi)低溫凝膠的工藝路線制備了多孔神經(jīng)導(dǎo)管，基于明膠吸水特性實(shí)現(xiàn)了導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的形狀恢復(fù)功能，簡化了神經(jīng)導(dǎo)管和體內(nèi)神經(jīng)的連接過程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明明膠材料制備的多孔導(dǎo)管具有良好的生物降解性和促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)功能。文獻(xiàn)［7］中利用3D打印制作的模具進(jìn)行水凝膠材料的灌注，通過低溫物理凝膠方式構(gòu)建了不同幾何形狀的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，并對植入后的水凝膠導(dǎo)管降解性能進(jìn)行了分析，指出水凝膠導(dǎo)管在神經(jīng)修復(fù)以及臨床應(yīng)用方面具有潛在的價(jià)值。文獻(xiàn)［8］通過在模具中灌注高濃度膠原蛋白并控制模具中鋼絲的直徑和數(shù)量的方式，實(shí)現(xiàn)了多通道膠原蛋白神經(jīng)支架的制備，并進(jìn)行了神經(jīng)支架植入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了多通道結(jié)構(gòu)對防止外部結(jié)締組織的浸潤、減少神經(jīng)細(xì)胞生長因子的流失和提高神經(jīng)生長的方向性方面的作用。文獻(xiàn)［9］采用打印的構(gòu)建了膠原和F127材料的復(fù)合管腔結(jié)構(gòu)，通過京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)并去除溶芯材料，從而制備了膠原管腔支架結(jié)構(gòu)。

由以上研究可知，目前多通道神經(jīng)支架對神經(jīng)的再生和橋接具有良好的促進(jìn)作用，現(xiàn)階段主要是通過模具灌注成型的方法來制造，這種制造方法在支架尺寸、通道數(shù)目以及通道直徑方面具有很大的局限性，難以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)修復(fù)的快速性和高匹配度要求，并且鑄造成型工藝流程相對復(fù)雜，有機(jī)溶劑通常具有毒性。因此，這里提出擠出式3D打印成型方式對神經(jīng)支架進(jìn)行批量化制造，以常用生物墨水甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）和明膠為打印墨水，基于明膠材料溶芯原理構(gòu)建水凝膠支架微管陣列結(jié)構(gòu)，從微管直徑、微管間距、孔隙率和力學(xué)性能方面對神經(jīng)支架的成型質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，為微管陣列神經(jīng)支架的制備提供了一種快速個(gè)性化的方法。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲基丙烯酸酐購自Sigma-Aldrich公司，276685；A型豬皮明膠購自Sigma-Aldrich公司，V 900863；PBS磷酸鹽緩沖劑（0.01M，PH7.2-7.4）購自鼎國昌盛，BF-0011；苯基（2，4，6-三甲基苯甲?；┝姿徜圎}（LAP）購自Sigma-Aldrich公司，900889-1G；實(shí)驗(yàn)所用水均來自Milli-Q Direct純水系統(tǒng)。

使用甲基丙烯酸酐與明膠反應(yīng)制成GelMA。在500ml燒杯中先后加入300ml的PBS溶液和30g的明膠，將燒杯放入水浴鍋中，設(shè)置水溫度為60℃，磁力攪拌至完全溶解。然后將溫度降至50℃，取30ml甲基丙烯酸酐，用注射器緩慢滴入明膠溶液中，加熱攪拌1h。將上層反應(yīng)產(chǎn)物裝進(jìn)3.5kDa透析袋，在40℃下對蒸餾水透析一周。將得到的產(chǎn)物GelMA放入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥處理，封裝后儲(chǔ)存在4℃冰箱中。

將凍干態(tài)GelMA溶解于PBS緩沖液中配置成5%、7%和9%（w/v）的GelMA溶液，添加0.1%（w/v）LAP搖晃溶解，形成可紫外光交聯(lián)固化的光敏材料。將顆粒狀明膠溶解于PBS緩沖液中配置成10%（w/v）明膠溶液，完全溶解后進(jìn)行離心（2000r/min）以及過濾（0.22μm）處理，分裝后放于4℃冰箱中避光保存。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)采用自主研發(fā)的高精度生物3D 打印機(jī)（SIA Bioprinter Pro），打印機(jī)整體上可分為三部分，分別為三軸運(yùn)動(dòng)平臺(tái)、精密擠出多噴頭系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)，并且內(nèi)部可提供紫外滅菌環(huán)境，如圖1所示。三軸運(yùn)動(dòng)平臺(tái)運(yùn)動(dòng)精度達(dá)0.1μm，可滿足長寬高（50×30×20）mm尺度打印的需求；精密擠出噴頭采用滾珠絲杠推桿裝置實(shí)現(xiàn)，直線位移精度為1μm，對打印過程中墨水的定量擠出實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制；溫控系統(tǒng)中打印底板以及五個(gè)打印噴頭均具有單獨(dú)控溫功能，底板的溫度調(diào)節(jié)范圍為-10℃到60℃，打印頭的溫度調(diào)節(jié)范圍為10℃到60℃，溫度控制精度為0.5℃，可滿足多種材料不同溫度復(fù)合打印的需求。實(shí)驗(yàn)中采用500μL的玻璃進(jìn)樣針作為料倉，進(jìn)樣針底部通過金屬連接件與武藏不銹鋼針頭連接，針頭出絲直徑最小為50μm。

圖1 生物3D打印機(jī)Fig.1 Biological 3D Printer

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用GelMA 為基質(zhì)材料，明膠為支撐和溶芯材料。在打印過程中，明膠材料為圓柱體提供穩(wěn)定的支撐，同時(shí)作為溶芯材料暫時(shí)占據(jù)微管位置。GelMA和明膠水凝膠具有溫度敏感特性，在降低溫度時(shí)，其模量會(huì)逐漸升高。當(dāng)儲(chǔ)能模量與損耗模量達(dá)到平衡時(shí)，材料會(huì)呈現(xiàn)適合打印的凝膠狀態(tài)，此時(shí)繼續(xù)降溫會(huì)呈現(xiàn)過凝膠狀態(tài)，影響擠出絲的形貌和保真度。打印機(jī)的兩個(gè)噴頭中分別裝載GelMA和明膠材料，調(diào)節(jié)噴頭溫度和底板溫度，進(jìn)行逐層打印，如圖2所示。在實(shí)驗(yàn)中，5%、7%和9%的GelMA打印溫度分別設(shè)置為18℃、20℃和22℃，明膠的打印溫度設(shè)置為24℃，保證水凝膠材料均勻擠出成絲。打印底板溫度設(shè)置為10℃，增強(qiáng)材料的物理凝膠強(qiáng)度，提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。打印后使用365nm紫外光照射整體支架結(jié)構(gòu)45s，對結(jié)構(gòu)中的GelMA材料進(jìn)行交聯(lián)，穩(wěn)定支架形態(tài)，提高支架力學(xué)性能。最后將交聯(lián)后的支架放于PBS溶液內(nèi)升溫至37℃，1h后明膠溶解在PBS溶液中，形成支架內(nèi)的微管陣列結(jié)構(gòu)。

圖2 微管陣列神經(jīng)支架工藝流程圖Fig.2 Technological Process of Neural Scaffold with Multichannel Characteristics

實(shí)驗(yàn)后通過顯微鏡對支架切片結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，使用軟件ImageJ測量支架幾何參數(shù)，對微管陣列的直徑和間距進(jìn)行評價(jià)。使用液氮對支架進(jìn)行冷凍，在真空冷凍干燥機(jī)中凍干12h，切片后進(jìn)行噴金處理，使用掃描電子顯微鏡觀察。

對支架尺寸和微管特征進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，微管陣列神經(jīng)支架打印實(shí)驗(yàn)中，支架幾何尺寸為φ4.0×30mm，微管陣列尺寸通過控制每段打印軌跡中材料屬性的方式進(jìn)行設(shè)置，如表1 所示。實(shí)驗(yàn)使用3D 打印機(jī)配套自研軟件Biopcoder 進(jìn)行參數(shù)配置和G代碼生成。

表1 微管陣列實(shí)驗(yàn)參數(shù)表Tab.1 Experimental Parameters Table of Multichannel Characteristics

3 結(jié)果與分析

GelMA和明膠墨水具有較強(qiáng)的溫敏特性，在溫度由高到低的變化過程中，兩者將從液態(tài)逐漸向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變，當(dāng)溫度升高后將重新液化。5%的GelMA溶液和10%的明膠溶液在從0℃升溫到37℃過程中流變學(xué)特性會(huì)發(fā)生變化，如圖3所示。隨著溫度的升高，材料的儲(chǔ)能模量（G'）和損耗模量（G''）會(huì)逐漸降低，兩者相交的位置為凝膠點(diǎn)。從曲線可以看出10%的明膠在37℃下?lián)p耗模量遠(yuǎn)大于儲(chǔ)能模量，呈現(xiàn)液態(tài)，能夠溶解在PBS 溶液中被去除。GelMA以及明膠墨水在升溫和降溫過程中表現(xiàn)出不同的流變學(xué)特性，降溫過程的凝膠點(diǎn)會(huì)低于升溫過程的凝膠點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)前生物墨水的準(zhǔn)備是一個(gè)降溫過程，因此采用降溫過程的凝膠點(diǎn)作為打印溫度的參考。5%、7%和9%的GelMA凝膠點(diǎn)溫度分別為18℃、20℃和22℃附近，明膠的凝膠點(diǎn)溫度為24℃附近。

在顯微鏡下觀察打印的神經(jīng)支架以及微管陣列結(jié)構(gòu)，如圖4所示。

圖4 神經(jīng)支架和掃描電子顯微鏡圖像Fig.4 Nerve Scaffold and Scanning Electron Microscopy Images

在明膠溶芯材料的支撐作用下，打印后的微管陣列神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)具有較高的完整度，如圖4（a）所示。將交聯(lián)的支架進(jìn)行溶芯處理，可以看出溶芯后支架未發(fā)生塌陷情況，說明支架具有相對較高的力學(xué)性能，并且支架形成了光滑的表面。將神經(jīng)支架進(jìn)行切片處理后，對內(nèi)部的微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，微管密度高達(dá)6.8條/mm2，并且支架內(nèi)部形成了高度統(tǒng)一的微管陣列結(jié)構(gòu)，利于神經(jīng)再生軸突從近端向遠(yuǎn)端的高密度遷移生長。電鏡觀察神經(jīng)支架橫截面的50倍、200倍、400倍圖像以及縱截面的20倍圖像，如圖4（b）所示。從橫截面的圖像來看，支架在不同尺度下均都有清晰可見的孔隙結(jié)構(gòu)，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的滲透。縱截面顯示出微管的連通性，有利于對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行定向引導(dǎo)。

3.1 微管直徑

不同GelMA 濃度條件下，對神經(jīng)支架內(nèi)部微管直徑進(jìn)行對比，如圖5所示。

圖5 微管直徑的對比情況Fig.5 Comparison of Micro-Tube Diameter

從整體上看，當(dāng)GelMA 濃度為5%時(shí)，微管直徑大于設(shè)計(jì)尺寸，當(dāng)濃度為7%和9%時(shí)，微管呈現(xiàn)出小于設(shè)計(jì)尺寸的趨勢，這可能是由于濃度較低時(shí)支架本體中GelMA 結(jié)合強(qiáng)度較弱，微管內(nèi)壁處的GelMA 材料隨明膠材料的溶解而脫落，導(dǎo)致成型后的微管直徑偏大。從支架內(nèi)微管直徑和設(shè)計(jì)尺寸的對比上分析，當(dāng)濃度為5%時(shí)兩者的誤差最大，此時(shí)誤差在10%以下，說明在擠出式打印中明膠材料對維持微管形狀的完整性起到了良好的作用。隨著GelMA 濃度的增加，微管直徑和設(shè)計(jì)尺寸之間的誤差減小，說明提高GelMA 濃度可以改善支架內(nèi)微管的成型質(zhì)量。當(dāng)濃度為7%和9%時(shí)，兩者的微管直徑均值基本一致，濃度為9%時(shí)誤差最小為2.4%，這說明當(dāng)GelMA濃度較高時(shí)，制備的支架已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了高質(zhì)量微管加工，此時(shí)增加濃度對微管直徑的影響較小。

3.2 微管間距

不同GelMA 濃度條件下，對神經(jīng)支架內(nèi)部微管間距進(jìn)行對比，如圖6所示。

圖6 微管間距的對比情況Fig.6 Comparison of Micro-Tube Spacing

從整體上看，微管之間的距離均小于設(shè)計(jì)尺寸，這說明使用PBS溶液進(jìn)行溶芯時(shí)，不同濃度條件下的支架都出現(xiàn)了失水后尺寸收縮的情況，不同濃度GelMA材料制備的支架，微管間距呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別。當(dāng)濃度為5%時(shí)微管間距最小，也驗(yàn)證了GelMA濃度較低時(shí)，固化后的GelMA 出現(xiàn)的孔壁材料脫落情況。當(dāng)濃度為5%時(shí)，微管間距和設(shè)計(jì)尺寸之間的誤差最大，此時(shí)兩者的誤差為8.2%。當(dāng)濃度為7%時(shí)微管間距基本和理論值相同，兩者之間誤差在0.3%以下，說明濃度為7%時(shí)GelMA 紫外固化的效果最好，并且溶芯成型時(shí)受到PBS溶液的影響最小。

3.3 孔隙率

支架結(jié)構(gòu)內(nèi)部的孔隙對神經(jīng)的修復(fù)起到重要的影響，隨著孔隙率的升高支架結(jié)構(gòu)的通透性也會(huì)增強(qiáng)，有助于導(dǎo)管外部營養(yǎng)物質(zhì)的滲透以及神經(jīng)之間信號的相互傳遞，促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞在導(dǎo)管內(nèi)的生長［10］。

由神經(jīng)支架截面積的幾何特征進(jìn)行分析，其中支架截面積V為：

式中：R—神經(jīng)支架外徑；

n—微管數(shù)量；

E（r）—微管直徑的期望；

L—神經(jīng)支架長度。

對于神經(jīng)支架的孔隙率P可以表示為：

式中：m—冷凍干燥后神經(jīng)支架的質(zhì)量；

ρ—冷凍干燥后GelMA材料的密度。

對不同濃度的GelMA 材料打印后支架內(nèi)孔隙率進(jìn)行對比，如圖7所示。

圖7 支架孔隙的對比情況Fig.7 Comparison of Scaffold Pore

隨著GelMA濃度的增加，支架內(nèi)孔隙率呈逐漸下降的趨勢，這是由于支架內(nèi)部大部分由PBS溶液構(gòu)成，當(dāng)支架冷凍干燥后其形狀基本保持不變，溶液通過升華形成支架孔隙。通過對比可以看出，當(dāng)GelMA濃度為5%和7%時(shí)，支架孔隙率在90%以上，說明制備的神經(jīng)支架具有良好的通透性，適宜營養(yǎng)物質(zhì)的傳送和新陳代謝的排出。

3.4 力學(xué)性能

使用質(zhì)構(gòu)儀（CT3 Texture Analyzer Brookfield）在室溫下對不同濃度的GelMA支架進(jìn)行力學(xué)性能測試。觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載為0.008N，測試速度為0.1mm/s。軸向壓縮測試時(shí)將支架截成1.8mm 長的圓柱，取應(yīng)變（0～0.2）范圍內(nèi)的曲線進(jìn)行線性擬合，計(jì)算壓縮模量。測量不同濃度的GelMA 神經(jīng)支架的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線，如圖8 所示。為支架拉伸和壓縮模量的對比情況，GelMA神經(jīng)支架的拉伸和壓縮模量都隨著濃度的增加而增大，如圖9所示。但是其機(jī)械強(qiáng)度均小于人的自體神經(jīng)組織［11］。在后續(xù)的研究中，可以通過增加外皮或者混入增強(qiáng)材料來提高整體的機(jī)械性能。

圖8 支架壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig.8 The Stress-Strain Curve of Scaffold Compression

圖9 支架拉伸及壓縮模量Fig.9 Tensile and Compression Modulus of Nerve Scaffold

4 結(jié)語

這里首先通過3D 打印技術(shù)對GelMA 材料和明膠材料進(jìn)行擠出成型，然后通過紫外光對支架整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，最后基于明膠材料的升溫溶芯工藝對微管陣列結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建，主要得出以下幾點(diǎn)結(jié)論：

（1）微管直徑和設(shè)計(jì)尺寸之間的誤差最小為2.4%，當(dāng)濃度為7%時(shí)微管間距和設(shè)計(jì)尺寸之間的誤差在0.3%以下；（2）支架內(nèi)孔隙率隨GelMA 濃度的增加呈逐漸降低的趨勢，當(dāng)GelMA 濃度為5%和7%時(shí)，支架孔隙率在90%以上；（3）當(dāng)GelMA濃度增加時(shí)，支架孔隙率降低，機(jī)械性能增強(qiáng)?？紫堵逝c力學(xué)性能之間存在矛盾，需要進(jìn)一步的研究來平衡支架的綜合性能。（4）從整體上看，當(dāng)GelMA濃度為7%時(shí)制備的微管陣列神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)，在微管直徑、微管間距、孔隙率以及力學(xué)性能方面都較為優(yōu)異。