段淑娟 趙玲娟 李傳友 李凌 王偉

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的傳染性疾病,世界上約1/3的人口為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI),其中5%～10%的LTBI在生命中的某個時段有進展為活動性結(jié)核病的高風(fēng)險[1-2]。然而,并非所有具有MTB暴露史的個體會被感染或發(fā)展為活動性結(jié)核病,這可能是由于宿主中某些未知的關(guān)鍵遺傳因素參與了結(jié)核病的發(fā)病進程[3-5]。

從全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWAS)[6-10]、候選基因研究[11-14]和薈萃分析研究[15-20]獲得的諸多證據(jù)證實了人體中許多基因及突變與結(jié)核病易感性相關(guān)。例如,rs557011位點多態(tài)性的產(chǎn)生是由于HLA Ⅱ 類DQ亞基Alpha鏈旁系同源物(HLA-DQA1)和HLA Ⅱ 類DR亞基Beta鏈旁系同源物(HLA-DRB1)基因間區(qū)域內(nèi)的非編碼突變,已被證實與MTB感染及結(jié)核病進展相關(guān),而另一種突變rs9271378與MTB感染風(fēng)險無關(guān),與結(jié)核病發(fā)病呈負相關(guān),可能參與保護MTB感染者進展為活動性結(jié)核病[21]。此外,許多研究也已經(jīng)證實了結(jié)核病易感性與宿主基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián),包括編碼維生素D受體,γ-干擾素(interferon gamma,IFN-γ)和IFNG受體-1(interferon gamma receptor 1,IFNGR-1)等基因[11-16]。

雌激素相關(guān)受體β(estrogen-related receptor beta,ESRRB)是雌激素相關(guān)受體家族的成員,屬于核受體的NR3B亞組[22]。ESRRB主要參與控制能量穩(wěn)態(tài),以及通過參與染色質(zhì)重編程過程參與細胞的發(fā)育和分化[23]。在2018年的一項GWAS研究中,鑒定出單核苷酸多態(tài)性(SNP) rs12437118(14q24.3)與結(jié)核病易感性相關(guān),該SNP 定位于編碼ESRRB基因下游約16 kb的基因間區(qū)域。在該項研究中,主要招募中國南方城市的志愿者群體,發(fā)現(xiàn)rs12437118等位基因A頻率范圍為0.261～0.288[7],而該數(shù)據(jù)略低于中國北方人群的相應(yīng)頻率(0.31)[24]。迄今為止,很少有研究闡明ESRRB基因多態(tài)性與結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系。因此,筆者以?？漆t(yī)院的結(jié)核病患者和工作人員為研究對象,分析了rs12437118位點不同基因型、血清ESRRB 蛋白水平、不同遺傳模型中基因頻率的差異,旨在探討中國華北地區(qū)的漢族人群中rs12437118多態(tài)性與結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險之間的相關(guān)性。

對象和方法

一、研究對象

收集2018年3月至2019年12月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院的結(jié)核病患者607例,作為病例組,并收集同時期在此醫(yī)院的660名工作人員為健康對照組。病例組患者中,男性310例、女性297例,平均年齡為(37.74±10.14)歲;健康對照組中,男性309名、女性351名,平均年齡為(39.56±10.20)歲。收集乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的血液標(biāo)本提取基因組DNA。后續(xù)另納入141例結(jié)核病患者和147名健康對照者,收集血清檢測ESRRB水平。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

病例組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)18歲以上,60歲以下的活動性肺結(jié)核患者(符合Xpert?MTB/RIF結(jié)果陽性,或分枝桿菌痰培養(yǎng)陽性、痰涂片抗酸染色鏡檢結(jié)果陽性、影像學(xué)體征符合肺結(jié)核病灶表現(xiàn),并伴有提示結(jié)核病的臨床癥狀);(2)籍貫為中國華北城市(包括北京市、天津市、河北省、山西省、內(nèi)蒙古自治區(qū))的漢族人群。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有糖尿病者;(2)感染HIV者;(3)接受免疫抑制治療者。

健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)在結(jié)核病?？漆t(yī)院工作2年以上;(2)18歲以上,60歲以下;(3)體檢健康者;(4)籍貫為中國華北城市(包括北京市、天津市、河北省、山西省、內(nèi)蒙古自治區(qū))的漢族人群;(5)γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay,IGRA)陰性。

本項研究是在遵守《赫爾辛基宣言》的原則下進行的。該方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理批號:2018-41-01),并獲得研究對象知情同意。

三、儀器與試劑

全血DNA提取試劑盒購自中國無錫百泰克生物技術(shù)有限公司,競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)KASP試劑盒購自英國生物搜索技術(shù)公司,ESRRB 蛋白ELISA檢測試劑盒購自北京飛默生物科技有限公司,Applied BiosystemsTM7500 實時熒光定量 PCR購自美國賽默飛世爾科技公司。

四、研究方法

1.基因組DNA提取:收集所有研究對象的血液樣本(2 ml),然后根據(jù)全血DNA提取試劑盒使用說明從樣品中提取基因組DNA。將提取到的基因組DNA樣本稀釋至50 ng/μl的工作濃度,用于隨后的基因分型分析。

2.基因分型:競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)KASP是一種基于熒光的基因分型方法[17],本研究采用此方法進行基因分型檢測。使用Primer Premier 5.0設(shè)計等位基因特異性的兩種上游引物和常規(guī)的下游引物。引物序列如下: 上游引物-FAM(5′→3′): AAAGACTGTGTTTGCAGTGGGAAGT;上游引物-HEX(5′→3′):GACTGTGTTTGCAGTGGGAAGC;下游引物(5′→3′):CAAAATGTGGCTCAAGCCCCTGAT。KASP反應(yīng)混合物包括:50 ng基因組DNA,5 μl預(yù)混液和0.14 μl引物。PCR擴增使用ABI 7500系統(tǒng)進行,擴增步驟為:94 ℃ 15 min, 94 ℃ 20 s循環(huán)10次,55～61 ℃ 1 min, 94 ℃ 20 s循環(huán)26次,55 ℃ 1 min。通過Sanger測序?qū)倶颖玖?%的基因分型結(jié)果進行驗證。復(fù)核基因分型結(jié)果的一致性達到100%,從而驗證了基因分型結(jié)果的可靠性。

3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清 ESRRB 水平:通過離心將血清從血液標(biāo)本中分離出來,儲存在-80 ℃ 冰箱。嚴格按照制造商的試劑盒使用說明書進行樣品/標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣、樣品孵育、洗板、抗體孵育、洗板、顯色、終止、讀板操作。以系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算各樣品中的ESRRB水平。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

使用 IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計算結(jié)核病患者的哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)ESRRB多態(tài)性分布值,采用卡方檢驗評估對照組,以判斷實際結(jié)果與預(yù)期HWE結(jié)果的等效性[25]。病例組和對照組之間的rs12437118 多態(tài)性的等位基因和基因型頻率的差異比較采用卡方檢驗。采用Mann-WhitneyU檢驗分析病例組和對照組之間的ESRRB水平。采用單因素方差分析遺傳因素與血清ESRRB水平之間的關(guān)聯(lián),計算3種替代模型(加性、顯性、隱性)下的優(yōu)勢比(odds ratios,OR)、95%CI和相應(yīng)的P值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ESRRB rs12437118 等位基因和基因型頻率

ESRRBrs12437118多態(tài)性在病例組和對照組中的基因型和等位基因頻率見表1。GG、GA 和 AA 三種基因型頻率在病例組中分別為 50.2%、38.1% 和 11.7%,在對照組中分別為 44.9%、45.6% 和 9.5%,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.619,P=0.022);以野生型GG基因型為對照,分別與GA基因型和AA基因型比較,發(fā)現(xiàn)與GA基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.079,P=0.014),與AA基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.219,P=0.640)。病例組和對照組之間兩種等位基因頻率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.772,P=0.380)。rs12437118 SNP獲得的病例組期望頻次分別為GG基因型291、GA基因型259、AA基因型57,對照組基因型頻率符合哈迪-溫伯格遺傳平衡規(guī)律(χ2=1.278,P=0.528),所選擇人群具有群體代表性,可進行下一步研究。

二、ESRRB基因多態(tài)性與結(jié)核病易感風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)

使用不同的遺傳模型(包括顯性和隱性模型)評估ESRRBrs12437118多態(tài)性與結(jié)核病易感的相關(guān)性(表2),結(jié)果顯示,rs12437118多態(tài)性在顯性(P=0.214)和隱性(P=0.055)遺傳模型中均未顯示與結(jié)核病明顯關(guān)聯(lián)。

表2 不同遺傳模型下rs12437118單核苷酸多態(tài)性與結(jié)核病易感風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性分析

三、血清 ESRRB 水平與結(jié)核病易感性的關(guān)系

病例組血清ESRRB水平為243.1(174.3,367.3) pg/μl,低于對照組血清ESRRB水平[360.3(240.0,604.1) pg/μl],二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=5.623,P<0.001);而在此分析的不同rs12437118基因型中,病例組AA、GA、GG基因型的ESRRB水平分別為328.9(226.3,553.0) pg/μl、232.6(164.7,379.7) pg/μl、196.8(150.1,328.4) pg/μl,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.790,P=0.171);對照組AA、GA、GG基因型的ESRRB水平分別為427.5(253.9,619.4) pg/μl、353.7(247.8,666.4) pg/μl、303.3(219.8,519.1) pg/μl,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.751,P=0.177)。

討 論

ESRRB是孤兒核受體成員之一,在胚胎干細胞多能性網(wǎng)絡(luò)功能中起重要作用[23],目前已知其可參與細胞早期發(fā)育和染色質(zhì)重塑[23-27]。有研究發(fā)現(xiàn),ESRRB基因突變與疾病發(fā)生有關(guān),例如肩袖損傷[28],聽力損失[29]和齲齒[30]。然而,很少有研究調(diào)查ESRRB突變與結(jié)核病易感性之間的關(guān)聯(lián),因其是Wnt/β-Catenin信號通路的關(guān)鍵靶標(biāo),因此,針對此SNP的研究是十分必要的[31]。Wnt通路在結(jié)核病進展的不同階段起關(guān)鍵作用,包括巨噬細胞中的MTB存活、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、肉芽腫的形成,及適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[32-33]。最近的一項轉(zhuǎn)錄組分析表明,ESRRB是參與調(diào)節(jié)單核細胞與淋巴細胞比值(monocyte-to-lymphocyte ratio,MLR)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,而外周MLR升高已被證實與成人、嬰兒和孕婦患結(jié)核病風(fēng)險增加及抗結(jié)核免疫應(yīng)答的有效性有關(guān)[34]。在一項中國漢族人群(2949例肺結(jié)核患者和5090名健康對照者)中進行的三階段GWAS研究發(fā)現(xiàn)兩個結(jié)核病易感風(fēng)險相關(guān)位點,其中包括rs12437118,這是染色體14q24.3ESRRB位點內(nèi)的基因間區(qū)域(OR=1.28,95%CI:1.19～1.37),但在人群外周血單個核細胞中,rs12437118 SNP等位基因狀態(tài)與ESRRBmRNA水平之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

本研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核病患者的血清ESRRB水平明顯低于健康對照組,但rs12437118基因型與血清ESRRB水平之間沒有相關(guān)性?？梢?rs12437118 SNP在結(jié)核病患病過程中似乎沒有太大影響ESRRB 表達。本項研究結(jié)果表明,rs12437118 GA基因型可能是結(jié)核病發(fā)病的保護性因素,同時也表明A等位基因不會增加該隊列中結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險。Zheng等[7]研究表明,rs12437118的A等位基因增加了居住在中國南方的漢族隊列的結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險;而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)A等位基因并未提示可提高結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險,根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(https://useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Variation/Population?r=14:76516887-76517887;v=rs12437118;vdb=variation;vf=182186764)中列出的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù),中國南方地區(qū)等位基因A的頻率(0.27)略低于北方的頻率(0.31)[24],因此,推測南北方遺傳信息差異可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不同的主要原因。其次,健康對照組的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的差異也可能在一定程度上影響研究結(jié)果,一般認為有病原接觸史的個體,2年是其發(fā)病的高峰期,之后的發(fā)病概率會大大降低。基于此,本研究健康對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)考慮了病原暴露因素,即結(jié)核病?？漆t(yī)院從事相關(guān)工作2年以上,并排除了IGRA陽性即潛伏感染人群。而之前的多數(shù)研究并未關(guān)注對照組的MTB的感染狀態(tài),或者排除了有結(jié)核病接觸史的人群,此類研究更傾向于發(fā)現(xiàn)MTB感染的易感風(fēng)險因素[6,12,16]。本研究通過血清學(xué)檢測,發(fā)現(xiàn)ESRRB在結(jié)核病患者血清中表達量明顯低于對照組,說明該基因在蛋白水平與結(jié)核病有一定的相關(guān)性,但并未發(fā)現(xiàn)不同的基因型與血清ESRRB表達水平之間的相關(guān)性,有可能是由于按基因型分組后樣本量較小導(dǎo)致,或者其表達水平的調(diào)控機制是受到rs12437118位點之外的調(diào)控元件的影響。

綜上所述,中國華北地區(qū)的漢族人群中ESRRB rs12437118 GA基因型與結(jié)核病易感性之間存在明顯關(guān)聯(lián)性,ESRRB在結(jié)核病患者血清中的低表達與rs12437118基因多態(tài)性無關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻段淑娟:實驗研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章;趙玲娟:實驗研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù);李傳友:對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、行政/技術(shù)/材料支持;李凌:醞釀和設(shè)計實驗、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、行政/技術(shù)/材料支持;王偉:醞釀和設(shè)計實驗、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、行政/技術(shù)/材料支持、指導(dǎo)、支持性貢獻