石大偉 陳湘霖 董文竹 文舒安 張婷婷 王玉峰 黃海榮 許四宏

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染性疾病,我國目前仍是全球結(jié)核病高負擔國家之一,同時也是耐藥結(jié)核病負擔較高的國家[1-2]。結(jié)核病的實驗室檢測手段主要有細菌學檢查、免疫學檢查和分子生物學檢查[3]。其中細菌學檢查常用的兩種檢查方法為痰涂片檢查(即抗酸桿菌染色,簡稱“抗酸染色”)及分枝桿菌分離培養(yǎng)[4-6]。在抗酸染色檢查中,結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)均可被檢測為陽性結(jié)果,因此難以區(qū)分[7]。而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒別MTBC與NTM菌群的操作步驟繁瑣,耗時過長。分子生物學方法具有快速和敏感度高的特點。一般情況下,結(jié)核抗原檢測雖然敏感度低于分子生物學方法,但一般采用免疫層析法,較分子生物學方法具有操作簡便、成本更低和對環(huán)境和設(shè)備要求低的優(yōu)勢[8]。因此,結(jié)核抗原檢測是目前臨床上仍然使用的一種輔助診斷方法。

目前,我國國家藥品監(jiān)督管理部門批準上市的結(jié)核抗原檢測試劑基于的方法均為免疫層析法(膠體金法),被測物(靶抗原)均為結(jié)核MPT64抗原。MPT64蛋白是MTB培養(yǎng)早期即分泌至菌體外部占比最大的一種可溶性蛋白,而NTM 菌株中缺乏該基因,因此可以通過檢測MPT64蛋白來鑒別MTBC與NTM[9-10]。但是,由于不同包被抗體和生產(chǎn)工藝等因素會造成市場上的結(jié)核抗原檢測試劑性能的差異,因此,研制結(jié)核抗原檢測試劑國家參考品用于結(jié)核抗原診斷試劑的質(zhì)量控制及評價具有重要意義。

資料和方法

一、參考品原料

參考品原料(菌株)樣本均來自首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗參比實驗室(北京胸科醫(yī)院菌種資源庫),為經(jīng)過分離培養(yǎng)、菌種鑒定并保存于―80 ℃甘油的菌株,共計11份。

二、試劑

中性羅氏固體培養(yǎng)基(斜面)為珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。對硝基苯甲酸試劑為北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗參比實驗室自行配制。參考品的復(fù)核試劑為成都博奧晶芯生物科技有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)及廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌鑒定試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)。協(xié)作標定的試劑包括杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司的結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒,以及美艾利爾(中國)醫(yī)療器械有限公司的結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒。

三、研究方法

1.菌株復(fù)蘇和復(fù)核:將參考品原料菌株從―80 ℃進行復(fù)蘇和固體培養(yǎng),并使用對硝基苯甲酸生長試驗進行菌種鑒定。復(fù)核選擇兩種檢測試劑對復(fù)蘇培養(yǎng)后的原料(菌株)樣本進行檢測,檢測操作和結(jié)果判定均嚴格按照試劑盒說明書進行,確定出可用于制備國家參考品的候選樣本。

2.參考品的分裝和組裝:分裝和組裝前先將所有候選樣本使用中性羅氏固體培養(yǎng)基(斜面)進行增菌培養(yǎng),陰性和陽性參考品候選樣本接種8支,最低檢出限/精密度參考品候選樣本接種10支。將菌體磨菌超聲分散后進行稀釋,分裝至1.5～2 ml非螺口錐形底離心管中,并置于恒溫金屬浴加熱塊上,80 ℃ 加熱滅活1 h。再將每11支參考品候選樣本組裝成1套參考品(盤),共組裝80套。用于之后的協(xié)作標定和穩(wěn)定性評估。

3.參考品的協(xié)作標定研究和質(zhì)量標準的制定:參考品候選樣本送至杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司和美艾利爾(中國)醫(yī)療器械有限公司的實驗室,使用各自生產(chǎn)的結(jié)核抗原檢測試劑盒(膠體金法)進行協(xié)作標定并確定質(zhì)量標準。試劑盒的檢測操作和結(jié)果判定均嚴格按照試劑盒說明書進行。

4.標定菌落形成單位(CFU)計數(shù)和核酸拷貝數(shù):所有參考品候選樣本菌液在超聲分散后分裝前均進行了麥氏濁度檢測,同時進行CFU計數(shù)實驗。在CFU實驗中,菌液按3個稀釋度稀釋,每個稀釋度接種2個5 cm固體平板,對菌落為10～50個的平板進行菌落計數(shù)。參考品候選樣本菌液分裝并滅活后,委托廣州達安基因股份有限公司使用熒光定量PCR和數(shù)字PCR法對參考品的核酸拷貝數(shù)進行標定。由于目前對NTM的CFU計數(shù)及核酸標定缺乏公認的和穩(wěn)定的方法,因此僅對陽性參考品、最低檢出限/精密度參考品進行CFU計數(shù)和核酸標定。

5.均勻性研究:隨機抽取分裝后于―20 ℃保存的5套參考品,對每套參考品(盤)中的陽性參考品、最低檢出限參考品用同一批杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核抗原檢測試劑分別進行檢測。

6.穩(wěn)定性研究:結(jié)核抗原國家參考品分裝和組裝完成后存于―20 ℃冰箱中,分別取出1套于4 ℃放置7 d、于室溫(23～27 ℃)放置3 d、反復(fù)凍融5次后,與-20 ℃保存的參考品同時用同一批杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核抗原檢測試劑分別進行檢測。

結(jié) 果

一、菌株復(fù)蘇

參考品原料(菌株)包括5份陽性參考品原料(菌株)樣本,5份陰性參考品原料(菌株)樣本,1份最低檢出限/精密度參考品原料(菌株)樣本,共計11份。其中最低檢出限/精密度參考品候選樣本為國際通用的標準菌株H37Rv。陽性參考品候選樣本均為北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗參比實驗室分離自臨床痰液樣本的MTB菌株,并使用對硝基苯甲酸生長試驗進行菌種鑒定。其余樣本引進自美國菌種保藏中心(ATCC),由北京胸科醫(yī)院結(jié)核分枝桿菌檢驗參比實驗室復(fù)蘇培養(yǎng)和傳代保存。參考品原料(菌株)的具體信息見表1。

表1 候選樣本來源概況

二、菌株的復(fù)核

對菌株樣本采用基于核酸方法學的分枝桿菌鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法和熒光PCR熔解曲線法)進行復(fù)核,挑選出擬進入?yún)f(xié)作標定的候選樣本。復(fù)核結(jié)果顯示,博奧芯片對陰性參考品2號原料(菌株)樣本的檢測結(jié)果為堪薩斯分枝桿菌和MTB雙陽性(MTB信號非常弱,因此軟件自動判讀為單一堪薩斯分枝桿菌),而廈門致善試劑為單一堪薩斯分枝桿菌陽性,沒有檢出MTB污染。考慮到芯片法的檢測限一般劣于熒光PCR法,陰性參考品2號原料(菌株)樣本復(fù)核為單一堪薩斯分枝桿菌陽性。此外,對于陽性參考品35號原料(菌株)樣本,廈門致善試劑的檢測結(jié)果為MTB和“其他分枝桿菌”雙陽性,博奧芯片的檢測結(jié)果為MTB和胞內(nèi)分枝桿菌雙陽性。該樣本為臨床分離株,因此可以認定該樣本很大可能性為MTB和NTM混合感染?？紤]到陽性參考品的設(shè)置目的為考核結(jié)核抗原試劑的陽性檢出能力,因此保留其為陽性參考品候選樣本。綜上,復(fù)核結(jié)果表明原料菌株樣本經(jīng)復(fù)核均可用于制備參考品候選樣本。

三、參考品的分裝和組裝

所有候選樣本使用中性羅氏固體培養(yǎng)基(斜面)進行增菌培養(yǎng),經(jīng)稀釋后分裝陽性參考候選樣本5支,編號為P1～P5;陰性參考樣本5支,編號為N1～N5,以及最低檢出限/精密度參考品,編號為P0,各樣本含量均為1 ml/支,存于―20 ℃冰箱中。

四、協(xié)作標定(適用性驗證)和質(zhì)量標準的制定

標定結(jié)果顯示,參與協(xié)作標定(適用性驗證)的兩家公司的試劑對陽性參考品候選樣本和陰性參考品候選樣本均能正確檢出(表2)。在最低檢出限方面,對參考品Rv倍比稀釋后,杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司可檢出32倍陽性、64倍陰性;美艾利爾(中國)醫(yī)療器械有限公司可檢出16倍陽性、32倍弱陽性、64倍陰性。在精密度方面,對候選樣本Rv進行8倍稀釋后,各試劑的10次平行檢測結(jié)果均為陽性,且顯色均一。

表2 膠體金法試劑協(xié)作標定結(jié)果

根據(jù)協(xié)作標定結(jié)果,從協(xié)作標定樣本中選擇全部候選樣本作為國家參考品的最終組成,并重新編號。同時根據(jù)協(xié)作標定結(jié)果,國家參考品的組成和質(zhì)量標準確定為:(1)陰性參考品N1～N5:檢測結(jié)果應(yīng)均為陰性,陰性參考品符合率應(yīng)為5/5;(2)陽性參考品P1～P5:檢測結(jié)果應(yīng)均為陽性,陽性參考品符合率應(yīng)為5/5;(3)最低檢出限參考品P0:對參考品P0進行倍比稀釋至64倍,16倍稀釋的檢測結(jié)果應(yīng)為陽性;(4)精密度參考品P0:對參考品P0進行8倍稀釋后平行檢測10次,檢測結(jié)果應(yīng)均為陽性,且顯色條帶均一。

五、標定CFU計數(shù)和核酸拷貝數(shù)

對于CFU計數(shù)和核酸拷貝數(shù)的標定結(jié)果見表3,其中核酸標定為單獨2次上機結(jié)果的平均值,標定結(jié)果可供未來換批時參考。CFU計數(shù)結(jié)果為1次實驗結(jié)果,為2個5 cm固體平板上菌落數(shù)的平均值。

表3 參考品CFU計數(shù)和核酸拷貝數(shù)標定結(jié)果

六、穩(wěn)定性和均勻性研究

檢測以膠體金法試劑的檢測條帶為指標,本參考品在4 ℃放置7 d、室溫(23～27 ℃)放置3 d、反復(fù)凍融5次后,與對照參考品(―20 ℃保存)檢測結(jié)果均為陽性且顯色條帶均一,無肉眼可見差別;隨機抽取的5份參考品檢測結(jié)果均為陽性且顯色條帶均一,無肉眼可見差別。根據(jù)上述結(jié)果,本參考品的穩(wěn)定性和均勻性均符合規(guī)定要求。

討 論

目前,用于結(jié)核病檢測的金標準仍然是微生物培養(yǎng)和菌種鑒定,但該方法操作復(fù)雜、耗時長,并且對操作者的專業(yè)技術(shù)要求較高[11-13]。與上述方法相比,抗原檢測具有操作簡單、快速等優(yōu)點,并且可用于現(xiàn)場即時檢測[14-15]。為滿足疾病控制及臨床診斷的需要,很多研究機構(gòu)及企業(yè)相繼開發(fā)出多種結(jié)核抗原檢測試劑盒。為了對結(jié)核抗原檢測試劑的質(zhì)量進行標準化研究,本研究首次建立了一套針對膠體金免疫層析法結(jié)核抗原檢測試劑盒的國家參考品(盤)。本參考品(盤)的特點在于:(1)本參考品的最低檢出限參考品為國際公認的結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv,遺傳和生物學背景清楚,易于參考品批次更換時的質(zhì)量控制。(2)膠體金法試劑的樣本上樣體積較大,這就要求本參考品原料的初始培養(yǎng)和收獲菌量大。各參考品原料樣本均經(jīng)過兩種方法的分散,力圖保證在較高濃度(3～4個麥氏濃度)下制備的參考品盡量均勻,后期均勻性研究也顯示參考品達到較好的均勻性。(3)本參考品的最低檢出限參考品經(jīng)過CFU計數(shù)和核酸拷貝數(shù)的雙重標定,所提供的信息更充分。

本結(jié)核抗原國家參考品經(jīng)原料復(fù)核,并經(jīng)分散稀釋、分裝和組裝后,使用兩家不同企業(yè)的膠體金法結(jié)核抗原檢測試劑進行協(xié)作標定(適用性驗證),并使用結(jié)核核酸檢測試劑盒進行拷貝數(shù)標定。通過檢測相同的參考品樣本,兩種試劑在陽性和陰性參考品符合率、最低檢出限和精密度等性能指標方面沒有顯示出明顯差異。這與2021年完成的一項薈萃了46篇研究文獻的系統(tǒng)綜述的結(jié)論一致[8]。本研究也發(fā)現(xiàn),試劑間的最低檢出限也存在一定的差異。對最低檢出限參考品的檢測結(jié)果顯示,試劑間存在2倍稀釋度的差異(5×105～1×106CFU/ml),而張院良等[10]針對兩種商品化MPT64結(jié)核抗原檢測試劑的比較研究發(fā)現(xiàn),檢出限存在約3倍稀釋度的差異(3×103～1×104CFU/ml)。近年來,商品化MPT64結(jié)核抗原檢測試劑的實驗室分析性能評估的研究較少,2項國外研究結(jié)果顯示,膠體金法的MPT64結(jié)核抗原檢測試劑的最低檢出限在105CFU/ml 濃度水平[16-17],而本研究參考品適用性驗證所用試劑也表現(xiàn)出該濃度水平的最低檢出限,據(jù)此我們設(shè)定了參考品的最低檢出限標準。此外,有研究顯示,部分結(jié)核抗原檢測試劑在檢測NTM(如膿腫分枝桿菌)時會出現(xiàn)假陽性結(jié)果[10, 18],但在本研究中沒有發(fā)現(xiàn)適用性驗證所用試劑的交叉反應(yīng),提示所用試劑特異度高。因此,上述適用性驗證的結(jié)果顯示,本參考品(盤)能夠滿足膠體金法結(jié)核抗原檢測試劑盒的質(zhì)量評價和控制要求。參考品(盤)的組成和檢測結(jié)果要求(質(zhì)量標準)也考慮到結(jié)核抗原檢測在臨床上的應(yīng)用需求,兼顧了試劑對陰性和陽性樣本的檢出能力。穩(wěn)定性和均勻性研究顯示,本參考品的穩(wěn)定性和均勻性符合規(guī)定要求,可以持續(xù)供應(yīng),可為結(jié)核抗原檢測試劑的質(zhì)量穩(wěn)定提供基礎(chǔ)。

本參考品(盤)具有以下局限性:(1)樣本來源均為菌株培養(yǎng)稀釋、分裝制得,缺少臨床樣本。這主要是考慮到結(jié)核病的常見臨床樣本為痰液樣本,其成分比較復(fù)雜,不宜采用痰液等臨床樣本建立參考品。(2)受限于原料來源的限制,對陰性參考品并沒有選擇其他具有挑戰(zhàn)性的樣本進行干擾,例如其他呼吸道疾病患者的樣本。(3)本參考品使用兩種商品化結(jié)核抗原檢測試劑進行協(xié)作標定,其靶抗原均為MPT64蛋白且均基于膠體金法,這限制了本參考品的適用性。后續(xù)將持續(xù)關(guān)注結(jié)核抗原檢測方法的發(fā)展和新產(chǎn)品的推出,并研制適用的國家參考品。

志謝感謝林元奎博士在文字修改方面對本文做出的貢獻

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻石大偉:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、統(tǒng)計分析、獲取研究經(jīng)費;陳湘霖:修改文章;董文竹、文舒安、張婷婷和王玉峰:實施研究、統(tǒng)計分析;黃海榮:醞釀和設(shè)計實驗、技術(shù)指導(dǎo)、行政/技術(shù)/材料支持;許四宏:對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、行政/技術(shù)/材料支持