賈薈瑾,楊秀娟,鄧 斌,劉藝端,許文坤,王如飛,戚 敏*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650201;3.云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心,云南昆明 650021;4.云南省畜牧總站,云南昆明 650224)

菲牛蛭是一種水蛭,俗名金邊螞蟥,是一種特色的藥用動(dòng)物資源[1]。菲牛蛭灰分為1.33%、粗脂肪為1.35%、水分為80.55%,粗蛋白含量較高,粗脂肪含量低[2]。菲牛蛭含16種脂肪酸,占脂肪酸總量的97.39%,其中飽和脂肪酸占63.34%,不飽和脂肪酸占34.05%,含量最高的脂肪酸是十六烷酸(棕櫚酸)(達(dá)23.78%),其次是9-十八碳烯酸(油酸)占12.53%[2]。菲牛蛭體含有Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Cu、V、Cr共8種元素,其常量元素中Ca的含量較高,為14.11 mg/g,微量元素中Fe與Zn的含量較高,分別為1.33和1.37 mg/g,且菲牛蛭體內(nèi)的Fe、Mg、Zn微量元素符合抗癌藥物微量元素范圍[3]。菲牛蛭含有多種活性成分,其中菲牛蛭素是蛋白質(zhì)和天然抗凝血物質(zhì),與胰島素、青蒿素并稱為“世界三素”[4],通常用抗凝活性來表示菲牛蛭素的含量,抗凝活性越高,菲牛蛭素含量越高,抗凝效果也越好?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明,菲牛蛭素可治心腦血管疾病,在動(dòng)脈粥樣硬化、敗血性休克、高血壓和缺乏抗凝血酶因素方面也具有巨大的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景[5]。裴強(qiáng)等[6]采用菲牛蛭凍干粉成功治療2例急性白血病合并肺栓塞患者,目前相關(guān)研究已經(jīng)通過云南省第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)鑒定。

目前,隨著野生菲牛蛭資源的逐漸稀缺,菲牛蛭素變得愈發(fā)珍貴,高質(zhì)量地提取菲牛蛭素勢(shì)在必行。近年來,國內(nèi)已有許多關(guān)于品種[7]、體重[8]、飼料[9]、凍存時(shí)間[10]、部位[11]、菲牛蛭素檢測(cè)方法[12]等因素是否會(huì)對(duì)菲牛蛭體成分和抗凝活性造成影響的研究,但針對(duì)不同體表顏色是否會(huì)影響其體成分及抗凝活性未見相關(guān)報(bào)道。已知有2種體表顏色的菲牛蛭,其背部分別呈黃褐色和橄欖綠色,均有5條細(xì)密的綠黑色斑點(diǎn)組成的縱線,腹面淺黃色、平坦,散布不規(guī)則暗綠色斑點(diǎn)。該研究以菲牛蛭的2種體色作為切入點(diǎn)展開相關(guān)研究和討論,為菲牛蛭的進(jìn)一步開發(fā)利用提供更科學(xué)完善的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物活體體重為4.0 g左右的黃褐色和橄欖綠色菲牛蛭(各30條,健康狀況良好),由云南海瑞迪生物制藥有限公司提供。試驗(yàn)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院云南省營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑液氮、無水硫酸銅、無水硫酸鈉、濃硫酸、6 mol/L鹽酸水解溶液、檸檬酸鈉緩沖溶液、0.9%氯化鈉、0.5%牛纖維蛋白原緩沖液,均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院云南省營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要儀器冷凍干燥機(jī)(型號(hào)FD-1C-50),購自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;全自動(dòng)凱氏定氮儀(型號(hào)SKD-1000),購自上海沛歐有限公司;pH計(jì)(型號(hào)pHS-3D),購自上海精密科學(xué)儀器有限公司;氨基酸全自動(dòng)分析儀(型號(hào)A300),購自德國曼默博爾公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組將試驗(yàn)所用菲牛蛭按體表顏色平均分為2組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10條。

2.2 試驗(yàn)前處理將菲牛蛭稱重后,放入液氮處死,然后用不銹鋼粉碎機(jī)粉碎,于FD-1C-50冷凍干燥機(jī)冷凍干燥后稱重[13],備用。

2.3 水分的測(cè)定水分含量采用冷凍干燥法測(cè)定。

式中:X為水分含量(%);Ma為稱量皿的重量(g);Mb為樣品+稱量皿的重量(g);Mc為凍干后樣品+稱量皿的總重(g)。

2.4 蛋白質(zhì)的測(cè)定使用全量凱氏定氮法。稱0.2 g樣品(準(zhǔn)確至0.000 1 g)于消化管中,加入無水硫酸鈉、硫酸銅和濃硫酸消化,用SKD-1000上海沛歐全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定,當(dāng)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)闇\紅色時(shí)即為滴定終點(diǎn),記下此時(shí)硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積用量。

式中:V0為滴定空白樣時(shí)的硫酸用量,mL;V1為滴定樣品時(shí)的硫酸用量,mL;0.014為1 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(c=1.000 mol/L)相當(dāng)?shù)?、以克表示的氮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)硫酸的濃度;c為標(biāo)準(zhǔn)硫酸的濃度,mol/L;6.25為氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù);m為樣品質(zhì)量,g。對(duì)樣品和空白對(duì)照作2次平行測(cè)定,結(jié)果為算術(shù)平均值。

2.5 水解氨基酸的測(cè)定采用氨基酸全自動(dòng)分析儀柱后衍生法測(cè)定。樣品預(yù)處理為酸水解:稱取100 mg樣品于20 mL安瓿瓶中,加10 mL 6 mol/L鹽酸水解溶液封管,(110±2)℃恒溫干燥箱水解24 h。冷卻、混勻、過濾,用移液管取適量濾液于濃縮器中60 ℃抽真空蒸發(fā)。加3～5 mL檸檬酸鈉緩沖溶液,搖勻,4 000 r/min離心,取上清液上機(jī)測(cè)定。

定量測(cè)定及結(jié)果計(jì)算公式:

式中:n為樣品水解溶液稀釋倍數(shù);Ai為樣品溶液對(duì)應(yīng)氨基酸峰面積;V為樣品水解溶液體積,mL;c為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)氨基酸濃度,nmol/mL;M為氨基酸摩爾質(zhì)量,g/mol;Vst為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積,μL;Ast為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)氨基酸峰面積;m為樣品質(zhì)量,mg;Vi為樣品溶液進(jìn)樣體積,μL。

2.6 抗凝活性的測(cè)定通過凝血酶滴定法測(cè)定。稱量(0.10±0.000 1)g菲牛蛭素凍干粉并加入3 mL 0.9%NaCl,混合并浸提30 min,4 000 r/min離心20 min,上清液收集100 μL。加入0.5% 200 μL牛纖維蛋白原緩沖液,混合,并在37 ℃水浴中以5 μL/min滴加凝血酶并輕輕搖動(dòng)直至形成絮狀沉淀或凝固,記錄滴定度。1個(gè)ATU等于中和1個(gè)NIH凝血酶所用菲牛蛭素質(zhì)量。

抗凝血酶活性(U/g)=

2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用Spss19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用F檢驗(yàn)對(duì)菲牛蛭中的水分、粗蛋白質(zhì)、水解氨基酸及抗凝活性的結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同體表顏色菲牛蛭水分及粗蛋白質(zhì)含量分析按照“2.3水分的測(cè)定”及“2.4白質(zhì)的測(cè)定”方法測(cè)定菲牛蛭水分和粗蛋白質(zhì),其含量見圖1。圖1表明,不同體表顏色菲牛蛭水分及粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P>0.05)。

注:小寫字母相同代表差異不顯著(P>0.05)。Note:The same lowercase indicates the difference is insignificant(P>0.05).圖1 不同體表顏色菲牛蛭水分及粗蛋白質(zhì)含量Fig.1 Moisture and crude protein content of Hirudinaria manillensis with different body colors

3.2 不同體表顏色菲牛蛭氨基酸含量分析按“2.5”處理方法對(duì)不同體表顏色菲牛蛭的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品圖譜、氨基酸樣品圖譜、氨基酸含量比較見圖2、3及表1。

圖2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.2 Atlas of amino acid standards

圖3 氨基酸樣品圖譜Fig.3 Atlas of amino acid samples

結(jié)果表明:黃褐色菲牛蛭的精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、藥用氨基酸、呈味氨基酸、藥用氨基酸與總氨基酸比值、呈味氨基酸與總氨基酸比值均較橄欖綠色菲牛蛭顯著升高(P<0.05);黃褐色菲牛蛭的丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸較橄欖綠色菲牛蛭顯著降低(P<0.05)。

表1 不同體表顏色菲牛蛭氨基酸含量比較Table 1 Comparison of amino acid content of Hirudinaria manillensis with different body colors 單位:mg/g

3.3 不同體表顏色菲牛蛭抗凝活性分析圖4表明,不同體表顏色菲牛蛭抗凝活性差異顯著(P<0.05),其中黃褐色菲牛蛭抗凝活性比橄欖綠色菲牛蛭高37.00%。

注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicate significant difference(P<0.05).圖4 不同體表顏色菲牛蛭抗凝活性Fig.4 Anticoagulant activity of Hirudinaria manillensis with different body colors

4 結(jié)論與討論

4.1 菲牛蛭中氨基酸影響因素分析天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、精氨酸這9種氨基酸人體自身不能合成,但人體需要它們維持氮平衡,因此被稱為藥用氨基酸。谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸具有鮮味,通常被稱為呈味氨基酸。

苗艷麗等[3]采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)廣西科康生物有限公司生產(chǎn)的菲牛蛭干品氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其含有16種氨基酸,包括8種必需氨基酸,但由于產(chǎn)生峰重疊,未檢出纈氨酸和蛋氨酸。陳琛等[4]發(fā)現(xiàn),菲牛蛭氨基酸組成比例中必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)為36.87%,必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為58.41%,符合FAO/WHO推薦值,具有良好的氨基酸組成比。劉麗芳等[14]采用HPLC-柱后衍生法研究寬體金線蛭氨基酸組成的差異,發(fā)現(xiàn)炮制前氨基酸總量為73.94%,含量最高的是亮氨酸,其次是纈氨酸,谷氨酸含量最低。對(duì)比發(fā)現(xiàn),兩種體表顏色菲牛蛭總氨基酸含量均高于寬體金線蛭。楊秀娟等[8]對(duì)不同體重菲牛蛭氨基酸含量進(jìn)行差異顯著性研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同體重菲牛蛭的天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸6種氨基酸和水解氨基酸總量有顯著差異(P<0.05),而藥用氨基酸含量差異不顯著(P>0.05)。該研究關(guān)于兩種體表顏色菲牛蛭的水解氨基酸研究結(jié)果表明,黃褐色菲牛蛭藥用氨基酸含量、呈味氨基酸含量均高于橄欖綠色菲牛蛭。以上研究表明,品種、體重、顏色均對(duì)水蛭氨基酸含量及比例有一定影響。該研究創(chuàng)新之處在于首次將顏色作為影響菲牛蛭氨基酸含量的因素納入考慮范圍,具有一定的新穎性和獨(dú)特性,可為菲牛蛭的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

4.2 菲牛蛭中抗凝活性影響因素分析針對(duì)使用不同的水蛭素提取工藝和檢測(cè)方法得到的水蛭素含量不同這一問題,近年來有相關(guān)的研究和討論。張彬等[15]分別采用3種不同的提取方法(即鹽浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法)和凝血酶滴定法對(duì)3種地方的野生菲牛蛭(廣東菲牛蛭、廣西菲牛蛭和海南菲牛蛭)和2種飼料飼養(yǎng)的菲牛蛭(野生和養(yǎng)殖菲牛蛭)的抗凝活性進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)不同飼料飼養(yǎng)的菲牛蛭抗凝活性無顯著差異(P>0.05),說明人工養(yǎng)殖不會(huì)影響菲牛蛭的抗凝活性。何夢(mèng)雪等[16]用凝血酶滴定法比較不同提取方法對(duì)菲牛蛭抗凝活性成分的分離作用,發(fā)現(xiàn)鹽浸提法比水提法、水提醇沉法、丙酮法更好。因此該試驗(yàn)采用鹽浸提法和凝血酶滴定法提取菲牛蛭樣品中的菲牛蛭素以及比較不同體表顏色菲牛蛭中抗凝活性的差異有一定的科學(xué)依據(jù),但提取和滴定方法不同,得出的結(jié)果可能會(huì)有差異。兩種體表顏色菲牛蛭的水解氨基酸、抗凝活性存在差異。黃褐色菲牛蛭藥用氨基酸含量、呈味氨基酸含量和抗凝活性比橄欖綠色菲牛蛭高(P<0.05)。