孫豐蘭，王汝都

（1. 淄博市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，淄博 255000；2. 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，鄭州 451450）

羊腸道病毒（Caprine enterovirus，CEV）為新發(fā)現(xiàn)的病毒性傳染病致病原，其最早于2012 年在匈牙利被首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［1］，國(guó)內(nèi)于2014 年在腹瀉羊群中首次分離到流行毒株并完成基因測(cè)序［2］。羊腸道病毒屬于微RNA 病毒科腸道病毒屬成員，其主要危害羊的消化系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)出發(fā)熱、嚴(yán)重腹瀉、流涎等癥狀，是當(dāng)前羊群病毒性腹瀉疫病的主要致病原之一［3-5］。多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一類畜禽、野生動(dòng)物、人類均易感的急性、接觸性傳染病致病原，為條件性致病菌，當(dāng)外界溫度降低、長(zhǎng)途運(yùn)輸、應(yīng)激及機(jī)體抵抗力下降時(shí)可以誘發(fā)動(dòng)物感染［6-8］。多殺性巴氏桿菌的發(fā)生沒有季節(jié)性，呈散發(fā)和地方性流行，不同年齡、性別的羊都可以感染，一般在養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生條件差、應(yīng)激等因素下容易發(fā)生羊多殺性巴氏桿菌感染，羊發(fā)病后表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、食欲下降和腹瀉，病羊極易發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良，衰竭而亡，且多殺性巴氏桿菌常常與其他的細(xì)菌病、病毒病發(fā)生混合感染，加大了疾病感染后的死亡率［9-10］。羊腸道病毒和多殺性巴氏桿菌均是當(dāng)前威脅我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要疫病，2022 年10 月，山東某存欄肉羊300只左右的羊場(chǎng)部分羊只突發(fā)疾病，零星出現(xiàn)發(fā)病死亡情況，發(fā)病羊臨床表現(xiàn)為呼吸困難、精神沉郁、嚴(yán)重腹瀉、不食、消瘦，發(fā)病率在40%左右。共有3 只羊發(fā)生脫水死亡，將病死羊剖檢可見肺部積液、脾臟、淋巴結(jié)及腸道組織出血。為了確定發(fā)病羊場(chǎng)的致病原，本研究開展了羊腸道病毒PCR 檢測(cè)與序列分析、多殺性巴氏桿菌分離與鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷，現(xiàn)將整個(gè)診斷過程匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源

選擇3 只病死羊中的1 只進(jìn)行解剖，無菌采集淋巴結(jié)、脾臟、腸道作為臨床病料用于病毒檢測(cè)，無菌采集病死羊的肺臟用于細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 試劑、試劑盒

病毒基因組提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、一步RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒PCR 檢測(cè)與序列分析

1.3.1 病料樣品處理及核酸提取

將無菌采集的淋巴結(jié)、脾臟、腸道各取一小塊，混合后，按1∶5 體積比加入滅菌生理鹽水，同時(shí)用研磨器研磨成組織勻漿，離心機(jī)12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，利用病毒基因組提取試劑盒提取核酸。

1.3.2 合成引物

參照董坤等［11］建立的羊腸道病毒RT-PCR 檢測(cè)方法設(shè)計(jì)合成羊腸道病毒特異性檢測(cè)引物（上游引物F：5'-CTTTGCACGCCTGTTTTCC-3'，下游引物R：5'-CACACGCTCGGAGGTTGGGAT-3'），其預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為497 bp。

1.3.3 RT-PCR 擴(kuò)增

利用合成的羊腸道病毒檢測(cè)引物對(duì)提取的病料核酸進(jìn)行一步法RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：2×Buffer 12.5 μL、酶0.5 μL、上游和下游引物各0.5 μL、核酸3.0 μL、H2O 8.0 μL。擴(kuò)增程序：50℃45 min；95℃5 min；94℃45 s，54℃45 s，72℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后經(jīng)核酸電泳觀察結(jié)果。

1.3.4 序列分析

涉及“圖”的高考試題當(dāng)下正盛行,主要表現(xiàn)為化學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置圖、電化學(xué)工作原理圖、坐標(biāo)圖像、圖表和化學(xué)工藝流程圖等形式,尤其是化學(xué)工藝流程圖以大題的形式連續(xù)出現(xiàn)在了最近兩年的高考試題中。訓(xùn)練并提高讀圖能力,方可確保解題思路暢通。

將PCR 陽性擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接至PMD18-T載體，送生工生物（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果利用NCBI 中的BLAST 進(jìn)行在線序列比對(duì)分析。同時(shí)利用DNAStar 軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中登錄的不同種群腸道病毒基因序列進(jìn)行比較，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.4 細(xì)菌分離與鑒定

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)特征觀察

將無菌采集的肺臟分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯、血清瓊脂培養(yǎng)基、血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂，觀察細(xì)菌培養(yǎng)情況。將分離菌株進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.4.2 生化鑒定

將分離菌株做常規(guī)生化試驗(yàn)，鑒定細(xì)菌的生化特性。

1.4.3 莢膜基因型PCR 鑒定

（1）核酸提取。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的核酸。

（2）合成引物。參照楊晶晶等［12］的羊多殺性巴氏桿菌莢膜基因型鑒定方法分別合成A 型（上游引物F：5'-TGCCAAAATCG-CAGTCAG-3'，下游引物R：5'-TTGCCATCATTGTCAG-TG-3'）、B 型（上游引物F：5'-CATTTATCCAAGCTCCA-CC-3'，下游引物R：5'-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3'）、D 型（上游引物F：5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3'，下游引物R：5'-CATCTACCCACTCAACCATATC-AG-3'）、E 型（上游引物F：5'-TCCGCAGAAAATTATTG-ACTC-3'，下游引物R：5'-GCTTGCTGCTTGATTTTGTC-3'）、F 型（上游引物F：5'-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG-3'，下游引物R：5'-TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3'）特異性鑒別引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別約為1 044、760、648、511和851 bp。

（3）PCR 擴(kuò)增。利用合成的莢膜基因型鑒定引物分別對(duì)提取的分離菌株核酸進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上游和下游引物各0.5 μL，核酸3.0 μL，H2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：95℃5 min；95℃45 s，52℃45 s，72℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后經(jīng)核酸電泳觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒PCR 檢測(cè)與序列分析

2.1.1 RT-PCR 擴(kuò)增

利用羊腸道病毒檢測(cè)引物對(duì)病料樣品核酸進(jìn)行一步法RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖1 所示。擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為497 bp 左右，與預(yù)期大小一致，顯示羊腸道病毒為陽性。

圖1 羊腸道病毒RT-PCR 擴(kuò)增

2.1.2 序列分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)為羊腸道病毒特異性核酸序列，與CEV-JL14 毒株同源性100%。利用DNAStar 軟件將測(cè)序結(jié)果（命名為N 序列）和不同種群腸道病毒基因序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2 所示。N 序列、CEV-JL14 毒株序列與G 種羊腸道病毒處于進(jìn)化樹的同一個(gè)小分支，而與E 種、F 種腸道病毒屬于另一個(gè)不同的小分支。這從分子水平上證實(shí)了N 序列為G 種羊腸道病毒。

圖2 序列N 與其他毒株的進(jìn)化樹分析

2.2 細(xì)菌分離與鑒定

2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)特征觀察

將采集的病料樣品接種營(yíng)養(yǎng)肉湯24 h 后可見肉湯渾濁，管底有沉淀；在血清瓊脂培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落，在光折射下可見藍(lán)綠色熒光；在血液瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出表面光滑濕潤(rùn)的圓形菌落，沒有發(fā)生溶血。將分離菌株革蘭染色鏡檢，顯微鏡下可見革蘭陰性小桿菌，菌體兩級(jí)著色，有莢膜。符合多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征。

2.2.2 生化鑒定

由表1 可看出，分離菌株符合多殺性巴氏桿菌的生化特征。

表1 分離菌生化鑒定

2.2.3 莢膜基因型PCR 鑒定

由圖3 可知，莢膜A 型引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1 044 bp 左右，與預(yù)期大小一致，而莢膜B 型、D型、E 型、F 型的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均無特異性擴(kuò)增條帶，表明分離菌株為莢膜A 型多殺性巴氏桿菌。

圖3 多殺性巴氏桿菌莢膜基因型PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 綜合診斷

綜合判斷可以認(rèn)為，發(fā)病羊死亡原因?yàn)镚 種羊腸道病毒和莢膜A 型多殺性巴氏桿菌混合感染所致。

3 討論

鑒于過去腸道病毒對(duì)畜禽和人類健康的危害，羊腸道病毒一經(jīng)流行就引起了我國(guó)研究者的密切關(guān)注。魯桂俠［13］采用RT-PCR 方法對(duì)河北省采集的266 份羊糞便樣品進(jìn)行羊腸道病毒感染的病原學(xué)檢測(cè)與分析，結(jié)果表明，羊腸道病毒平均陽性感染率達(dá)27.82%。魏艷華等［14］采用RT-PCR 方法對(duì)山東聊城東昌府區(qū)采集的292 份羊糞便樣品進(jìn)行羊腸道病毒核酸檢測(cè)和序列分析，共檢測(cè)出羊腸道病毒陽性樣品12 份，平均陽性率達(dá)4.11%，且12份陽性樣品均為G 種羊腸道病毒。劉漢勝［15］從甘肅省某羊場(chǎng)暴發(fā)的臨床表現(xiàn)出嚴(yán)重腹瀉、精神萎靡、逐漸消瘦為癥狀的發(fā)病羊群中分離到1 株病毒，序列分析鑒定表明，分離毒株為G 種羊腸道病毒。王汝都等［16］從河南省某腹瀉羊場(chǎng)的糞便樣品中分離出2 株病毒，序列分析鑒定表明，2 株分離毒株均為G 種羊腸道病毒。本研究采用RT-PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定方法對(duì)臨床病例進(jìn)行了分子水平上的檢測(cè)，結(jié)果表明，臨床病例也為G 種羊腸道病毒感染，結(jié)合前人的上述研究結(jié)果，說明當(dāng)前我國(guó)羊腸道病毒的感染較為嚴(yán)重，且G 種羊腸道病毒為國(guó)內(nèi)當(dāng)前流行的優(yōu)勢(shì)基因型，臨床中應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)羊腸道病毒的診斷及監(jiān)測(cè)，為疾病防控奠定基礎(chǔ)。由于羊腸道病毒為一種新發(fā)動(dòng)物傳染病，目前尚無有效的疫苗防控，也沒有有效的治療藥物，發(fā)生感染后應(yīng)立即采取隔離、凈化措施，以防止本病在羊場(chǎng)擴(kuò)散流行。

多殺性巴氏桿菌病是牛羊均易感的細(xì)菌性傳染病，感染的羊是主要傳播來源，病羊的分泌物、排泄物會(huì)不斷傳播病菌，羊感染多殺性巴氏桿菌根據(jù)臨床表現(xiàn)分為最急性型、急性型和慢性型［17］。根據(jù)多殺性巴氏桿菌莢膜抗原不同，可分為5 個(gè)莢膜基因型（A 型、B 型、D 型、E型、F 型），目前我國(guó)羊群主要流行A 型、B 型、D 型，不同莢膜基因型之間無交叉保護(hù)性或交叉保護(hù)率較低，導(dǎo)致不同莢膜基因型的疫苗之間免疫效果不理想［18-19］，不同地區(qū)應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械膬?yōu)勢(shì)莢膜基因型合理選擇疫苗。因此，準(zhǔn)確鑒定本地區(qū)甚至本場(chǎng)的流行菌株莢膜基因型對(duì)綜合防控措施的制定至關(guān)重要。在本病例中，根據(jù)臨床特征初步判定為急性型多殺性巴氏桿菌，為了進(jìn)一步確診，本研究進(jìn)行了細(xì)菌分離培養(yǎng)與莢膜基因型PCR 鑒定，結(jié)果表明分離菌株為莢膜A 型Pm，為該場(chǎng)發(fā)病羊群及時(shí)采取針對(duì)性治療措施提供了參考。

混合感染導(dǎo)致疫病臨床癥狀更加復(fù)雜，危害程度和經(jīng)濟(jì)損失更大，診斷和治療方法更加困難，且僅通過臨床特征很難確診致病原，導(dǎo)致治療措施不合理、不及時(shí)，進(jìn)而會(huì)加重疫病的危害程度，故借助實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行確診至關(guān)重要。本研究通過分子生物學(xué)方法在分子水平上確診致病原為G 種羊腸道病毒和莢膜A 型多殺性巴氏桿菌混合感染。至于是羊腸道病毒在羊群發(fā)病過程中起主導(dǎo)作用，還是多殺性巴氏桿菌在羊群發(fā)病過程中起主導(dǎo)作用，尚不明確。但無論是羊群先感染羊腸道病毒，還是先感染多殺性巴氏桿菌，都與羊場(chǎng)的生物安全防控措施密切相關(guān)，只有在日常飼養(yǎng)管理中加強(qiáng)生物安全防控措施，提高整體生物安全防護(hù)水平，才能有效避免疫病的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究通過病毒PCR 檢測(cè)與序列分析、細(xì)菌分離與鑒定，確診病羊死亡原因?yàn)镚 種羊腸道病毒和莢膜A 型多殺性巴氏桿菌混合感染所致。