黃冬維，儲明星

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽生物育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031）

大多數(shù)動(dòng)物表現(xiàn)季節(jié)性繁殖現(xiàn)象，而這一過程主要受下丘腦- 垂體- 卵巢繁殖軸的調(diào)控［1］。褪黑激素（Melatonin）最初由Lerner 等［2］從牛松果體中分離出來。它的分泌受光照周期的影響而具有晝夜和季節(jié)規(guī)律性，進(jìn)而調(diào)節(jié)人的體溫、睡眠、免疫、抗氧化和血糖的周期節(jié)律變化［3］以及溫帶地區(qū)動(dòng)物的季節(jié)性繁殖活動(dòng)［4］。哺乳動(dòng)物褪黑激素信號主要由褪黑激素受體1A（MTNR1A，又名MT1）來傳導(dǎo)［5-7］，而MTNR1A 通過高度親和cAMP抑制此第二信使通路來發(fā)揮作用［8］，進(jìn)而可能涉及季節(jié)性繁殖活動(dòng)［9］。

目前，從核酸序列多態(tài)性分析MTNR1A基因與動(dòng)物繁殖季節(jié)性的關(guān)聯(lián)研究較多。地中海意大利水牛的MTNR1A基因外顯子2 的HpaI 酶切位點(diǎn)TT 基因型個(gè)體主要在5—7 月配種繁殖，長日照并不影響非繁殖季節(jié)TT 基因型個(gè)體的繁殖活動(dòng)［10-11］。豬MTNR1A基因外顯子2 的同義突變T162C 多態(tài)群體在夏季與秋冬不同季節(jié)對總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)加性效應(yīng)差異明顯［12］。國內(nèi)外對綿羊MTNR1A基因多態(tài)性的研究較為深入。研究顯示，意大利Sarda 綿羊MTNR1A基因外顯子2 的MnII 和RsaI酶切多態(tài)位點(diǎn)影響其產(chǎn)羔季節(jié)分布［13］，g.17355452C＞T 與g.17355358C＞T 兩位點(diǎn)完全連鎖并與從引入公羊到產(chǎn)羔時(shí)間長短顯著相關(guān)［14］。MTNR1A基因多態(tài)位點(diǎn)與Bovska和Istrian Pramenka 綿羊季節(jié)性乏情后繁殖活動(dòng)恢復(fù)有關(guān)［15］。陶賽特母羊MnII 酶切多態(tài)位點(diǎn)MM 和Mm 基因型個(gè)體更能在非繁殖季節(jié)妊娠和繁殖［16］。西班牙Rasa Aragonesa 綿羊和希臘本地綿羊MTNR1A基因多態(tài)性也與其繁殖季節(jié)性相關(guān)［17］。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，MTNR1A多態(tài)性在常年發(fā)情綿羊和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中分布差異極顯著，提示該基因可能與品種間繁殖季節(jié)性差異有關(guān)［18-20］。對多個(gè)山羊品種的研究表明，MTNR1A基因多態(tài)性與品種間繁殖季節(jié)性關(guān)系并不明確［21-22］，可能僅對部分山羊品種起作用［23］。

MTNR1A基因表達(dá)是否與動(dòng)物繁殖季節(jié)性有關(guān)系呢？高原鼢鼠下丘腦和垂體中均有MTNR1A基因表達(dá)，且5 月份（繁殖期）的表達(dá)量高于9 月份（非繁殖期），而睪丸中的MTNR1A表達(dá)量非繁殖期高于繁殖期［24］。小鼠置于24 h 長光照條件并注射褪黑激素促進(jìn)了睪丸功能恢復(fù)和MTNR1A基因的表達(dá)［25］。印度水牛冬季時(shí)卵泡顆粒細(xì)胞中MTNR1A基因的表達(dá)量隨卵泡直徑和卵泡褪黑激素濃度的增加而降低，夏季大卵泡中MTNR1A基因的表達(dá)量顯著高于冬季［26］。蒙古綿羊下丘腦、垂體中MTNR1A基因分別在秋分和夏至?xí)r表達(dá)量最高，冬至和春分時(shí)的表達(dá)居中［27］。發(fā)情周期各階段阿勒泰羊下丘腦中的MTNR1A基因表達(dá)水平顯著高于乏情期［28］。常年發(fā)情小尾寒羊下丘腦、垂體中的MTNR1A基因表達(dá)量顯著高于季節(jié)性發(fā)情蘇尼特羊，但在卵巢中的表達(dá)水平品種間無明顯差異，且蘇尼特羊下丘腦中該基因在短光照轉(zhuǎn)長光照后的第7 天和第21 天顯著下調(diào)［20，29］。

關(guān)于山羊MTNR1A基因表達(dá)情況的研究較少，更未見與繁殖季節(jié)性相關(guān)的研究［30-32］?；谝陨显?，本研究選擇季節(jié)性發(fā)情的遼寧絨山羊［33］和常年發(fā)情的濟(jì)寧青山羊［34］作為試驗(yàn)動(dòng)物，用普通PCR 和定量PCR 分別檢測分析山羊組織表達(dá)譜和繁殖調(diào)控軸MTNR1A基因表達(dá)的品種差異，旨在探明山羊MTNR1A基因的表達(dá)組織，同時(shí)初步研究MTNR1A基因與季節(jié)性繁殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與樣品

從濟(jì)寧青山羊保種場（山東嘉祥縣）和遼寧絨山羊育種中心（遼寧省遼陽市）分別選擇3 只成年母羊作為試驗(yàn)動(dòng)物。屠宰后，快速采集24 個(gè)組織（下丘腦、垂體、松果體、大腦皮層、小腦、丘腦、海馬、腦橋、延髓、卵巢、子宮體、子宮角、輸卵管、腎上腺、肝臟、心臟、脊髓、腎臟、肺臟、胰臟、脾臟、骨骼肌、皮下脂肪和甲狀腺）樣品，并立即剪碎置于RNAfixer（BioTeKe，北京），然后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。使用總RNA 提取試劑盒（BioTeKe，北京）提取RNA，其中裂解液用Trizol 替代，增加DNase I（天根，北京）除去基因組，研磨樣品時(shí)通過液氮降溫。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（BioTeKe，北京）合成cDNA 第一鏈，制備反轉(zhuǎn)錄樣品。

1.2 引物與擴(kuò)增

以NCBI 網(wǎng)站山羊MTNR1A基因序列（GenBank No.AF419334）為模板，用Primer 5.0 和Oligo 6.0 設(shè)計(jì)mRNA序列擴(kuò)增的引物1 對（表1）。內(nèi)參基因選擇GAPDH，使用黃冬維等［1］報(bào)道的引物（表1）。以兩個(gè)山羊品種24 個(gè)組織的cDNA 為模板，采用PCR 方法擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測分析MTNR1A基因組織表達(dá)情況。同時(shí)利用熒光定量PCR（qPCR）方法檢測兩品種山羊的松果體、下丘腦- 垂體- 卵巢、子宮等繁殖調(diào)控軸組織中MTNR1A基因的表達(dá)差異。qPCR 體系總體積20 μL：10 μL UltraSYBR Mixture（with ROX）（CWBIO，北京），上下游引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，無RNA 酶H2O 7.2 μL。qPCR 程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)；PCR 結(jié)束后做熔解曲線。qPCR 反應(yīng)機(jī)器為LC480 PCR（Roche），每個(gè)樣品每個(gè)基因3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表1 MTNR1A 和GAPDH 基因引物

1.3 數(shù)據(jù)處理

目的基因MTNR1A表達(dá)量用內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過2-ΔΔCT方法［35-36］計(jì)算基因相對表達(dá)量。采用單因素方差分析檢測不同品種和組織間的基因表達(dá)量差異，多重比較應(yīng)用Duncan 分析，統(tǒng)計(jì)分析軟件為SAS8.1（ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTNR1A 組織表達(dá)譜

MTNR1A基因在24 個(gè)組織中的表達(dá)譜如圖1。從瓊脂糖凝膠電泳圖可見兩個(gè)品種的GAPDH基因條帶亮度基本一致，提示其基因表達(dá)量基本相似。對于濟(jì)寧青山羊，MTNR1A基因主要表達(dá)于下丘腦、大腦皮層、海馬體和卵巢等組織；而對于遼寧絨山羊，MTNR1A基因主要表達(dá)于下丘腦、大腦皮層、海馬體和卵巢等組織，在垂體也有微量表達(dá)信號。

圖1 山羊MTNR1A 和GAPDH 基因組織表達(dá)譜

2.2 兩品種山羊MTNR1A 基因表達(dá)差異

本研究對繁殖軸相關(guān)的5 個(gè)組織中的MTNR1A基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測，并分析了品種和組織間的差異（圖2）。從組織間來比較，兩個(gè)品種山羊MTNR1A基因mRNA 在下丘腦中的表達(dá)量較高（P＜0.05），在卵巢中有一定的表達(dá)，在松果體和垂體中幾乎無表達(dá)；而在遼寧絨山羊垂體中的表達(dá)量較低，在濟(jì)寧青山羊垂體中幾乎無表達(dá)，在子宮中的表達(dá)很弱?？梢?，MTNR1A基因表達(dá)具有明顯的組織特異性。從品種間來比較，遼寧絨山羊下丘腦和卵巢組織中MTNR1A基因的表達(dá)量稍高于濟(jì)寧青山羊相應(yīng)組織，但差異并不顯著（P＞0.05）。

圖2 兩山羊品種繁殖軸相關(guān)組織的MTNR1A 基因mRNA 表達(dá)

3 討論

3.1 MTNR1A 基因的組織表達(dá)譜

山羊MTNR1A基因表達(dá)研究的報(bào)道很少。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)者采用RT-PCR 和組織原位雜交技術(shù)檢測分析發(fā)現(xiàn)，MTNR1A基因在內(nèi)蒙古絨山羊下丘腦、垂體中廣泛表達(dá)，在卵巢中僅僅表達(dá)于膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞［30-32］。Zhang 等［37］運(yùn)用q-PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，3 月齡燕山絨山羊公羊皮膚存在MTNR1A基因。本研究采用普通PCR方法檢測了濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊24 個(gè)組織中的MTNR1A基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTNR1A基因主要表達(dá)于卵巢和下丘腦、大腦皮層和海馬體等腦組織，濟(jì)寧青山羊垂體中未見該基因表達(dá)信號，在遼寧絨山羊垂體中有輕微表達(dá)，這與鄭再明等［31］的研究結(jié)果稍有不同。王世銀等［28］用RT-PCR 法研究了阿勒泰羊10 個(gè)組織中MTNR1A基因的表達(dá)譜，同樣在下丘腦、卵巢中檢測到表達(dá)信號，在垂體、脾臟中也有表達(dá)，與本研究結(jié)果相似的是在心、肺、骨骼肌、肝、腎和甲狀腺等組織中均無表達(dá)或表達(dá)信號低。本研究發(fā)現(xiàn)MTNR1A基因在垂體中的表達(dá)量較低，可能與不同品種的不同發(fā)情階段有關(guān)［28，38］。另有研究表明，公牦牛［39］和雄性高原鼢鼠［40］睪丸中均存在MTNR1A基因和蛋白的表達(dá)。本研究只檢測了母山羊組織中的表達(dá)情況，后期可以針對公山羊組織進(jìn)行檢測，并與母山羊組織表達(dá)譜進(jìn)行對比。

3.2 MTNR1A 基因表達(dá)與繁殖季節(jié)性的關(guān)系

本研究結(jié)果表明，與常年繁殖的濟(jì)寧青山羊相比，季節(jié)性繁殖的遼寧絨山羊下丘腦、卵巢和垂體中MTNR1A基因的表達(dá)量稍高于濟(jì)寧青山羊相應(yīng)組織（P＞0.05），提示MTNR1A基因可能與季節(jié)性繁殖有關(guān)，因?yàn)? 月下旬（春季）兩品種山羊處于不同的繁殖狀態(tài)。郭婷婷等［27］采用半定量PCR 研究表明，季節(jié)性繁殖的蒙古綿羊下丘腦中MTNR1A基因在秋分時(shí)的表達(dá)量最高，夏至?xí)r最低，冬至和春分時(shí)表達(dá)量居中，同時(shí)垂體中MTNR1A基因的表達(dá)量四季也有差異，春季表達(dá)量居中。綿羊除不同季節(jié)各組織中的表達(dá)量有差異外，不同發(fā)情周期狀態(tài)的甘加藏羊下丘腦、垂體和卵巢等繁殖相關(guān)組織中的MTNR1A表達(dá)量亦有明顯變化［38］，光照時(shí)長的轉(zhuǎn)換也會影響MTNR1A基因的表達(dá)［29］，因而對山羊MTNR1A基因的表達(dá)研究應(yīng)更為細(xì)致。He 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性繁殖的蘇尼特羊下丘腦和垂體組織中MTNR1A基因的表達(dá)量顯著低于常年繁殖的小尾寒羊，這與本研究結(jié)果并不一致，是否由于季節(jié)不一樣或者發(fā)情周期相異，值得探索；而兩品種綿羊卵巢中該基因表達(dá)量無明顯差異卻類似于本研究。另外，要弄清下丘腦- 垂體- 卵巢組織中的MTNR1A基因表達(dá)確切區(qū)域還需要進(jìn)一步的深入研究。與山羊同屬牛科的綿羊下丘腦不同核區(qū)MTNR1A基因表達(dá)水平差異明顯［5，40］。本研究在濟(jì)寧青山羊垂體中未發(fā)現(xiàn)MTNR1A基因表達(dá)，與表達(dá)譜研究結(jié)果相一致，而該基因在子宮中的表達(dá)很弱，普通PCR 未檢測到在意料之中，可能原因也不再贅述，后來者可進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究不僅檢測了濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊的MTNR1A基因組織表達(dá)譜，而且針對繁殖軸相關(guān)組織對該基因表達(dá)差異進(jìn)行了分析。MTNR1A基因主要表達(dá)于下丘腦、大腦皮層、海馬和卵巢，表達(dá)具有組織特異性，不過除垂體外，各組織中的表達(dá)量并無明顯差異。本研究結(jié)果有利于了解山羊MTNR1A基因功能，但是要明確其作用，還需進(jìn)一步的深入研究。