鄒方鵬 孟昭慧 黃雯靜 吳俊榮

(1濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎病風(fēng)濕科,山東 濟(jì)南 271100;2濟(jì)南市萊蕪醫(yī)院藥劑科)

糖尿病腎病是由腎小球硬化引起的糖尿病微血管病變的常見并發(fā)癥,通常導(dǎo)致終末期腎病,這是糖尿病患者的常見死亡原因〔1,2〕。眾所周知,腎小管細(xì)胞損傷是糖尿病腎病的主要特征之一,且證據(jù)表明在腎小管細(xì)胞損傷過程中涉及炎癥和細(xì)胞凋亡〔3〕。異常炎癥會(huì)直接破壞腎臟結(jié)構(gòu),并增加炎癥細(xì)胞因子的水平,如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8和腫瘤壞死因子(TNF)-α等〔4〕。因此,迫切需要抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥的治療策略。羅漢果皂苷是羅漢果的主要活性成分,羅漢果是我國(guó)首批批準(zhǔn)的藥食兩用的材料,其具有多種藥理學(xué)功能,如潤(rùn)肺止咳、降血糖、抗炎等〔5〕。近期研究顯示,羅漢果皂苷提取物能夠有效降血糖,在抗糖尿病中起一定的作用〔6〕。但是,尚不清楚羅漢果皂苷提取物是否對(duì)糖尿病腎病中腎臟具有保護(hù)作用。本研究建立了高葡萄糖引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型,探討羅漢果皂苷提取物在預(yù)防高糖引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(中國(guó)細(xì)胞資源庫(kù));羅漢果皂苷提取物,總皂苷含量≥80%(桂林萊茵生物科技);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS,美國(guó)Gibco);miR-199a-3p inhibitors和inhibitors control、miR-199a-3p mimics和mimics control(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogeng);CCK-8檢測(cè)試劑(日本同仁化學(xué)研究所);RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛世爾);TNF-α、IL-6和IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技);膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(日本TaKaRa);B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國(guó)Abcam);辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物);RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL,美國(guó)Sigma)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 HK-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,并在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞呈單層融合時(shí),使用胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的HK-2細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為:正常對(duì)照(NG)組:DMEM培養(yǎng)基+5 mmol/L葡萄糖;高糖干預(yù)(HG)組:DMEM培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖;低、中、高劑量組:DMEM培養(yǎng)基+30 mmol/L葡萄糖+10、20、40 μg/ml羅漢果皂苷提取物。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對(duì)數(shù)期的HK-2細(xì)胞種植于6孔板中,待細(xì)胞達(dá)60%融合時(shí)行轉(zhuǎn)染,按照說(shuō)明書采用無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體和miR-199a-3p inhibitors和inhibitors control、miR-199a-3p mimics、mimics control,將稀釋的脂質(zhì)體和質(zhì)粒等體積混合,孵育20 min后滴加至6孔板HK-2細(xì)胞中,孵育6 h更換成完全培養(yǎng)液,48 h后收集細(xì)胞。HK-2細(xì)胞按上述方法轉(zhuǎn)染mimics control和miR-199a-3p mimics后用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),記為HG+miR-NC組和HG+miR-199a-3p組;HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitors control和miR-199a-3p inhibitors后用含30 mmol/L葡萄糖和20 μg/ml羅漢果皂苷提取物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),記為anti-miR-NC+中劑量組和anti-miR-199a-3p+中劑量組。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)技術(shù) 使用RNA提取試劑盒從HK-2細(xì)胞中提取總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。使用SYBR Green試劑盒在CFX96 Manager系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR。通過2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá),并以U6將其標(biāo)準(zhǔn)化。引物:miR-199a-3p上游5′-GCCCAGTGTTCAGACTACCTG-3′,下游5′-GTGCAGGGT-CCGAGGTATTC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5CCK-8檢測(cè) 將HK-2細(xì)胞(1×104細(xì)胞/孔)接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h,然后將100 μl CCK-8添加到每個(gè)孔中,并在37 ℃下孵育2 h,最后使用酶標(biāo)儀在570 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.6ELISA檢測(cè) 分別收集各組處理后HK-2細(xì)胞上清液,按照TNF-α、IL-6和IL-8 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定含量,操作參照試劑盒使用說(shuō)明。

1.7流式細(xì)胞術(shù) 收集經(jīng)處理的各組HK-2細(xì)胞,并使用AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色,在黑暗中孵育30 min后,使用FACScan流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡率。

1.8Western印跡檢測(cè) 使用裂解緩沖液提取各組HK-2細(xì)胞中的蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定濃度后在沸水中變性,取等量蛋白通過12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,并用5%的脫脂牛奶在TBST緩沖液中封閉1 h。將膜與抗Bax和Bcl-2的一抗(稀釋度1∶500)在4 ℃孵育過夜。然后,將膜與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(稀釋度1∶2 000)在37 ℃孵育2 h。最后,使用ECL試劑顯影,凝膠系統(tǒng)采集圖像,采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,計(jì)算Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05),中劑量組與高劑量組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因而選用羅漢果皂苷提取物20 μg/ml進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

2.2羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05);Western印跡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞中Bax的表達(dá)明顯上升(P<0.05),而Bcl-2的表達(dá)明顯下降(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組中Bax的表達(dá)明顯下降(P<0.05),而Bcl-2的表達(dá)明顯上升(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

2.3羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8分泌的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)明顯增多(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組TNF-α、IL-6和IL-8的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組HK-2細(xì)胞活力、凋亡率、Bax、Bcl-2、miR-199a-3p及炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量表達(dá)比較

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HK-2細(xì)胞凋亡

圖2 Western印跡檢測(cè)各組Bax和Bcl-2的表達(dá)

2.4羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)的影響 qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與NG組比較,HG組HK-2細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05);與HG組相比,低、中、高劑量組miR-199a-3p的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見表1。

2.5過表達(dá)miR-199a-3p抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,與HG+miR-NC組比較,HG+miR-199a-3p組HK-2細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),凋亡率顯著降低(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-8的含量及Bax、Bcl-2表達(dá)顯著減少(P<0.05)。見圖3、圖4、表2。

1～4:HG+miR-NC組、HG+miR-199a-3p組、anti-miR-NC+中劑量組、anti-miR-199a-3p+中劑量組圖3 miR-199a-3p對(duì)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖4 miR-199a-3p對(duì)HK-2細(xì)胞凋亡的影響

表2 過表達(dá)miR-199a-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力、凋亡率、TNF-α、IL-6和IL-8的含量的影響

2.6下調(diào)miR-199a-3p逆轉(zhuǎn)羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用 與anti-miR-NC+中劑量組比較,anti-miR-199a-3p+中劑量組HK-2細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05),凋亡率顯著升高(P<0.05),TNF-α、IL-6和IL-8的含量及Bax、Bcl-2表達(dá)顯著增多(P<0.05)。見圖3、圖4、表3。

表3 抑制miR-199a-3p對(duì)羅漢果皂苷提取物干預(yù)的高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力、凋亡率、TNF-α、IL-6和IL-8的含量、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

3 討 論

葡萄糖水平升高是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一。高血糖可能導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物的形成,從而導(dǎo)致腎臟炎癥并促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展〔7〕。腎近端腎小管上皮細(xì)胞是慢性高血糖不良反應(yīng)的重要靶標(biāo)。腎小球?yàn)V過液中的葡萄糖過多會(huì)促使近端小管中的葡萄糖重吸收增加,并激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的一系列適應(yīng)不良的途徑,從而促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生〔8〕。因此,高濃度的葡萄糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞通常用于建立糖尿病腎病的體外模型〔9,10〕。先前的研究表明,高葡萄糖干預(yù)可顯著降低HK-2細(xì)胞的細(xì)胞活力并誘發(fā)腎小管上皮損傷〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn),高葡萄糖(30 mmol/L)抑制了HK-2細(xì)胞的活力。有研究顯示,羅漢果皂苷提取物能夠有效改善高糖高脂誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷,進(jìn)而發(fā)揮抗糖尿病的作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,羅漢果皂苷提取物能夠有效提高高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的活性。糖尿病腎病的發(fā)展與多種因素有關(guān),但是腎小管上皮細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子和凋亡可能在該疾病中起關(guān)鍵作用〔13〕。高血糖會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子增加,這些炎性細(xì)胞因子可以直接損害腎小管上皮細(xì)胞〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞構(gòu)建糖尿病腎病的體外模型成功,羅漢果皂苷提取物能夠減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡,并減少炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的分泌,提示羅漢果皂苷提取物能夠減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。

研究表明,微小RNA(miRNA)與腎小管細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)〔15～17〕。如miR-140-5p通過抑制Toll樣受體(TLR)4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)〔18〕。miR-125b通過阻止活性氧(ROS)的形成和凋亡改善了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷〔19〕。以往研究使用微陣列測(cè)定法分析了糖尿病腎病患者外周血中的miRNA表達(dá)譜,提示miR-199a-3p可能參與糖尿病腎病的發(fā)展,此外該研究顯示高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)顯著下調(diào)〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究一致,高糖刺激的HK-2細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)受到抑制。此外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示,羅漢果皂苷提取物可能通過調(diào)控miR-199a-3p的表達(dá)參與糖尿病腎病的進(jìn)展,過表達(dá)miR-199a-3p可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷,抑制miR-199a-3p可逆轉(zhuǎn)羅漢果皂苷提取物對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷保護(hù)作用。

綜上,羅漢果皂苷提取物能上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。