陸燕 韓敏 孟立平

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高，化療藥物以及新型靶向藥物的問世，惡性腫瘤患者長(zhǎng)期存活率不斷提升。但是，抗腫瘤藥物是一把雙刃劍，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)損傷自身的組織細(xì)胞，特別是心臟細(xì)胞。心血管疾病現(xiàn)在已經(jīng)成為長(zhǎng)期生存的癌癥患者的第二大死亡原因。如何減輕腫瘤藥物的心臟毒性，是腫瘤科醫(yī)師和心血管醫(yī)師當(dāng)下共同面對(duì)的挑戰(zhàn)。阿霉素（doxorubicin，Dox）是目前廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也是公認(rèn)可以引起心臟毒性的藥物。心臟纖維化導(dǎo)致的心臟重構(gòu)是Dox 心臟毒性作用發(fā)生過程中的關(guān)鍵一步，而心臟成纖維細(xì)胞是誘導(dǎo)纖維化的主要原因。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)可有效抑制Dox 心臟毒性的藥物。黃酒多酚（yellow wine polyphenolic compounds，YWPC）不僅能抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）的表達(dá)，減緩高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[1-2]。此外，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)YWPC 可以降低Dox 的大鼠心臟毒性作用[3]。本研究旨在探索YWPC 對(duì)Dox 心臟毒性的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar大鼠32只，180～220 g，購自浙江省動(dòng)物研究中心。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：YWPC 從黃酒中提取（由上海中藥制藥技術(shù)有限公司，國(guó)家中藥制藥工程技術(shù)研究中心提供），具體操作步驟參照文獻(xiàn)[4]，YWPC 為白色粉末狀，溶解于無菌水（YWPC 1 g溶解于1 000 mL 無菌水）后按照30 mg/kg 給大鼠灌胃（200 g 體重大鼠灌胃6 mL）；Dox 粉劑購自美國(guó)Sigma公司，溶解于無菌水（1 g Dox 溶解于1 000 mL 無菌水）后按照3 mg/kg 腹腔注射（200 g 體重大鼠腹腔注射0.6 mL）；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）拮抗劑GW9662 購自美國(guó)Sigma 公司，溶解于無菌水（1 g GW9662 溶解于1 000 mL 無菌水）后按照1 mg/kg 腹腔注射（200 g 體重大鼠腹腔注射0.2 mL）。兔抗鼠肌動(dòng)蛋白α（smooth muscle actin α，SMα）（ab128857）、轉(zhuǎn)錄因子21（transcription factor 21，Tcf21）（ab182134）、MMP-2（ab256748）、PPAR-γ（ab310323）單克隆抗體購自美國(guó)ABCOM 公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔或者羊抗鼠二抗以及蛋白免疫印跡相關(guān)試劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。本研究經(jīng)浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：11883）。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預(yù) 將32 只Wistar 大鼠飼養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、Dox 組、Dox+YWPC 組、Dox+YWPC+GW9662 組，每組各8 只。對(duì)照組大鼠不做處理，僅給予正常飲食；Dox 組大鼠在正常飲食基礎(chǔ)上每2 d 腹腔注射1 次Dox 3 mg/kg；Dox+YWPC 組大鼠在正常飲食和腹腔注射Dox 的基礎(chǔ)上，同時(shí)每天灌胃YWPC 30 mg/kg[4]；Dox+YWPC+GW9662 組大鼠在正常飲食、腹腔注射Dox、YWPC 灌胃的基礎(chǔ)上，在Dox 治療前30 min 腹腔注射GW9662 1 mg/kg。所有大鼠干預(yù)4周，均飼養(yǎng)在黑暗的房間里，12 h 光照和12 h 黑暗循環(huán)，嚴(yán)密監(jiān)測(cè)各組大鼠的健康狀況和活動(dòng)情況，以及液體攝入量和食物攝入量，每周監(jiān)測(cè)體重。

1.2.2 心功能檢測(cè) 干預(yù)4 周后，將各組大鼠腹腔注射氯胺酮75 mg/kg 麻醉后使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心電圖機(jī)記錄心電圖檢查結(jié)果，并根據(jù)心電圖示蹤計(jì)算心率。使用Philips iE33 系統(tǒng)（荷蘭Philips Medical 公司）行心臟超聲檢查評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能，測(cè)定左心室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）評(píng)價(jià)左心室收縮功能，檢測(cè)舒張?jiān)缙诙獍攴逯盗魉伲‥）和心房收縮（A），計(jì)算E/A 比值。測(cè)量連續(xù)3 個(gè)心臟周期后取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 心臟纖維化程度檢測(cè) 干預(yù)4 周后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取出完整心臟，部分心臟組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm 薄片，進(jìn)行HE 染色和Masson 染色檢測(cè)大鼠心臟纖維化程度，使用Image-Pro Plus 6（美國(guó)Media Cybernetics 公司）軟件計(jì)算心臟纖維化程度，結(jié)果以百分比表示。

1.2.4 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢測(cè) 上述1.2.3 方法取出的部分心臟組織用PBS 清洗。用眼剪低溫切左心室心肌成直徑1 mm×1 mm 的組織，固定、浸泡、逐步乙醇脫水、置換、包埋、聚合、切片、染色后記錄圖像，采用電鏡（日本日立公司，型號(hào)：JEM-2000EX）觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 心臟成纖維細(xì)胞中PPAR-γ 表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組化法。上述1.2.3方法獲取的薄片使用抗PPARγ 抗體（1∶100）進(jìn)行免疫組化染色。薄片用蘇木精反染色，顯微鏡（德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：DM3000）下成像，用Image pro-Plus 6 軟件分析PPAR-γ 在各組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中的表達(dá)和分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 心臟成纖維細(xì)胞中SMα、Tcf21、MMP-2 和PPAR-γ 表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法。將1.2.3取出的部分心臟組織勻漿后，4 ℃、13 000 r/min 離心5 min。 然后用BCA 法檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)的濃度。將上清液與5×SDS 樣品緩沖液混合，在沸水浴中加熱5 min，使蛋白變性。之后將變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，與SMα、Tcf21、MMP-2 和PPAR-γ 一抗（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。用TBS-T 沖洗膜3 次，10 min/次，室溫下在辣根過氧化物酶標(biāo)志的二抗（1∶5 000）中孵育1 h。信號(hào)由Immobilon Western chemiluminescent HRP Substrate（Millipore）測(cè)定，以βactin 做參照。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白。暗室柯達(dá)膠片顯影，Quantity one 軟件定量分析各組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中SMα、Tcf21、MMP-2和PPAR-γ的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠心功能指標(biāo)的比較 干預(yù)4 周后，與對(duì)照組比較，Dox 組大鼠心率增加，而LVEF、LVFS、E/A下降（均P＜0.05）。與Dox 組比較，Dox+YWPC 組大鼠心率降低，LVEF、LVFS、E/A 增加（均P＜0.05）。此外，與Dox+YWPC 組比較，Dox+YWPC+GW9662 組大鼠心率增加，而LVEF、LVFS、E/A 均下降（均P＜0.05），見表1；4 組大鼠心超檢查結(jié)果見圖1。

圖1 4 組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果

表1 4 組大鼠心功能指標(biāo)的比較

2.2 4 組大鼠心臟纖維化程度的比較 HE 染色顯示，對(duì)照組大鼠心臟成纖維細(xì)胞排列規(guī)則，Dox 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞排列出現(xiàn)不規(guī)則，Dox+YWPC 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞排列恢復(fù)規(guī)則，而GW9662 則減弱了YWPC 的作用，見圖2A（插頁）。Masson 染色顯示，與對(duì)照組比較，Dox 組大鼠心臟纖維化明顯，加入YWPC減弱了Dox 引起心臟纖維化的作用，同時(shí)，GW9662 可以逆轉(zhuǎn)YWPC 的作用，見圖2B（插頁）。電鏡檢查顯示，與對(duì)照組比較，Dox 組心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量增加，肌絲排列紊亂；YWPC 可緩解Dox 引起的線粒體和肌絲變化，加入GW9662 后，YWPC 的作用被消除，見圖2C（插頁）。4 組大鼠心臟成纖維化程度比較見圖2D（插頁）。

圖2 4 組大鼠心臟組織HE 染色、Masson 染色、電鏡檢查結(jié)果（A：HE 染色結(jié)果，×20；B：Masson 染色結(jié)果，×20；C：電鏡檢查結(jié)果，×30 000；D：4 組大鼠心臟纖維化程度比較）

2.3 4 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中PPAR-γ 表達(dá)情況的比較 與對(duì)照組比較，Dox 組PPAR-γ 表達(dá)量減少（P＜0.05）；與Dox 組比較，Dox+YWPC 組PPAR-γ 表達(dá)量增加（P＜0.05）；與Dox+YWPC 組比較，Dox+YWPC+GW9662 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中PPAR-γ 表達(dá)量降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中PPAR-γ 的表達(dá)及分布（A：4 組大鼠中PPAR-γ 表達(dá)的電泳圖；B：4 組大鼠中蛋白電泳檢測(cè)PPAR-γ 相對(duì)表達(dá)量比較；C：4 組大鼠中免疫組化檢測(cè)PPAR-γ 相對(duì)表達(dá)量比較；D：4 組大鼠中PPAR-γ 檢測(cè)的免疫組化染色結(jié)果，×20）

2.4 4 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中SMα、Tcf21 和MMP-2表達(dá)情況的比較 與對(duì)照組比較，Dox 組大鼠心臟組織中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表達(dá)量增加（均P＜0.05）；與Dox 組比較，Dox+YWPC 組中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表達(dá)量減少（均P＜0.05）；與Dox+YWPC 組比較，Dox+YWPC+GW9662 組中SMα、Tcf21 和MMP-2的表達(dá)量增加（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 4 組大鼠心臟成纖維細(xì)胞中SMα、Tcf21 和MMP-2 的表達(dá)情況（A：4 組大鼠中SMα、Tcf21 和MMP-2 表達(dá)的電泳圖；B：4 組大鼠中SMα 相對(duì)表達(dá)量比較；C：4 組大鼠中Tcf21 相對(duì)表達(dá)量比較；D：4 組大鼠中MMP-2 相對(duì)表達(dá)量比較）

3 討論

與以往關(guān)注Dox 對(duì)心肌細(xì)胞損傷的研究不同，最近的一些研究表明Dox 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的影響也是其產(chǎn)生心臟毒性的關(guān)鍵步驟[5]。Mancilla 等[6]研究結(jié)果顯示Dox 通過誘導(dǎo)線粒體損傷，引起心臟成纖維細(xì)胞的線粒體自噬，最終產(chǎn)生心臟毒性。此外，Doroshow等[7]發(fā)現(xiàn)Dox 誘導(dǎo)的活性氧可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞凋亡。此外，Narikawa 等[8]發(fā)現(xiàn)Dox 可以增加人心臟成纖維細(xì)胞中MMP-1、IL-6、TGF-β 和膠原蛋白的表達(dá)。這些研究從心臟成纖維細(xì)胞的纖維化改變的角度提出了Dox 心臟毒性的潛在新機(jī)制。

在正常的心肌組織中，大多數(shù)構(gòu)成心臟網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)成纖維細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。靜止的心臟成纖維細(xì)胞呈梭形，增殖和遷移能力較弱。在各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、物理張力和其他病理因素刺激的作用下，靜止的心臟成纖維細(xì)胞被激活并轉(zhuǎn)化為活化的心臟成纖維細(xì)胞?；罨?xì)胞具有以下特征：（1）表達(dá)促炎和促纖維化因子水平升高，直接促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增殖；（2）分泌高水平MMPs 促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移；（3）促進(jìn)膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，導(dǎo)致瘢痕形成；（4）表達(dá)SMα、Tcf21 和其他特異性標(biāo)記蛋白。在病理因素刺激下，活化的心臟成纖維細(xì)胞大量增殖和遷移，并分泌MMP-2 等促進(jìn)心臟重構(gòu)的蛋白酶，改變心臟的間質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)。本研究結(jié)果表明，Dox 可以促進(jìn)激活型心臟成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，包括SMα、Tcf21 和MMP-2。這些結(jié)果表明，除了引起心肌細(xì)胞凋亡或焦亡外，心臟成纖維細(xì)胞的激活可能是Dox 心臟毒性的另一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。

流行病學(xué)研究表明，適量飲酒，尤其是紅酒，與某些心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)成反比。在前人對(duì)紅酒研究的基礎(chǔ)上，筆者團(tuán)隊(duì)過去研究一直專注黃酒對(duì)心臟疾病的潛在保護(hù)作用。最早筆者團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)黃酒可顯著降低同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)[9]。后續(xù)還證明了黃酒通過抑制低密度脂蛋白受體敲除小鼠中MMP-2 的表達(dá)和激活來改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[10]。黃酒是一種復(fù)雜的混合物，含有多種成分，包括多肽、低聚糖和YWPC 等多種對(duì)人體有益物質(zhì)，筆者團(tuán)隊(duì)在前期研究中從黃酒中提取了上述成分，發(fā)現(xiàn)YWPC 和多肽在動(dòng)物和細(xì)胞層面對(duì)冠心病都有保護(hù)作用[1,11]。之后的研究進(jìn)一步證實(shí)YWPC 可以通過靶向雷帕霉素/P70S6K 通路的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化[11]。在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究證明了YWPC 還具有預(yù)防Dox 心臟纖維化的作用，同時(shí)YWPC 可以降低Dox 誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞激活。這可能是YWPC 防止Dox 產(chǎn)生心臟毒性的機(jī)制。

引起心臟成纖維細(xì)胞激活的機(jī)制過去已有不少報(bào)道。Tian 等[12]發(fā)現(xiàn)Anoctamin-1 通過atir 介導(dǎo)的MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞增殖。Miao 等[13]報(bào)道了Toll 樣受體/MyD88 信號(hào)通路參與心臟成纖維細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)。最近，Chen 等[14]也發(fā)現(xiàn)PPAR-γ 通過抑制瘦素下游信號(hào)STAT3 磷酸化在心肌纖維化和心肌重塑活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PPAR 是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，分為3 個(gè)亞型，即α、β/δ 和γ。其中，PPAR-γ 在心肌重塑中具有多種藥理活性。例如，PPAR-γ 具有抗心臟纖維化作用，抑制局部血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的瘦素自分泌活性，抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，Dox 處理的大鼠心臟成纖維細(xì)胞中PPAR-γ 被抑制，而YWPC 可以增加PPAR-γ 的表達(dá)。這些結(jié)果表明YWPC 可能是通過增加PPAR-γ的表達(dá)來抑制Dox 的心臟毒性。此外，在加入PPAR-γ拮抗劑GW9662 后，YWPC 對(duì)Dox 誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞活化和心臟纖維化的保護(hù)作用消失，從另一個(gè)層面證明YWPC 可能是通過增加PPAR-γ 的表達(dá)來抑制Dox 的心臟毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)，YWPC 可以抑制Dox 誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞的激活和心臟纖維化，從而減緩Dox 的心臟毒性。YWPC 的心臟保護(hù)作用可能與其增加PPAR-γ 表達(dá)的能力有關(guān)。因此，筆者推測(cè)少量飲用黃酒可能可以減少Dox 的心臟毒性。本研究沒有進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞來驗(yàn)證YWPC 作用，是一大遺憾，有待今后再作努力。