駱葉姣,胡苗苗,李夢(mèng)麗,張濤

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇 無錫,214122)

人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)由于對(duì)嬰幼兒具有獨(dú)特營養(yǎng)功能而被廣泛研究,是人乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固形物含量物質(zhì)[1],成熟乳中人乳寡糖含量約為10～15 g/L,人初乳中人乳寡糖含量約為20～24 g/L[2]。目前2′-巖藻糖基乳糖以及乳酰-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)等多種人乳寡糖作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑被應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)的嬰幼兒配方奶粉中[3]。

LNnT是人乳寡糖中含量相對(duì)較高的成分之一[4],屬于非巖藻糖基化的中性母乳寡糖,具有免疫調(diào)節(jié)[5]、腸細(xì)胞反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[6]和促進(jìn)細(xì)胞成熟[7-9]等生理功能。

目前,LNnT的生產(chǎn)主要包括化學(xué)合成[10-11]、酶法合成和微生物發(fā)酵法[12]3種方法,酶法合成往往需要添加昂貴的前體物質(zhì),但生物合成法可利用廉價(jià)可再生底物,具有清潔、綠色、高效等特征,因此具有更為廣闊的應(yīng)用前景[13]。

通過綠色生物過程利用廉價(jià)生物質(zhì)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品是實(shí)現(xiàn)碳中和及環(huán)境友好經(jīng)濟(jì)的重要途徑。隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展,綠色、高效、安全型底盤微生物的開發(fā)成為解決HMOs規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵。當(dāng)前,乳酰-N-新四糖生產(chǎn)菌株常見于大腸桿菌[14],報(bào)道較少且產(chǎn)量偏低。

本研究旨在利用合成生物學(xué)手段,在通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)[15]敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ[16]和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向異構(gòu)酶基因wecB消除競(jìng)爭(zhēng)抑制途徑,減少底物乳糖和相關(guān)前體尿苷二磷酸-N-乙?；咸烟前返膿p失,弱化分支途徑,使更多的碳流向乳酰-N-新四糖合成通路,有利于乳酰-N-新四糖的高效生物合成的基礎(chǔ)之上,通過模塊化LNnT通路關(guān)鍵基因的構(gòu)建與組合[17],過表達(dá)關(guān)鍵基因尿苷二磷酸葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶基因galE、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因glmS、β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因NmlgtB以及β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因lgtA,上調(diào)從頭合成途徑的關(guān)鍵酶等策略實(shí)現(xiàn)產(chǎn)乳酰-N-新四糖的工程菌的構(gòu)建和乳酰-N-新四糖的高效合成(如圖1所示)。

圖1 LNnT從頭合成途徑圖Fig.1 Route diagram of LNnT de novo synthesis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所需基因lgtA和NmlgtB來源于大腸桿菌K12,glmS和galE來源于腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriaceaemeningitidis),宿主BL21(DE3)ΔlacZΔwecB為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

DNA產(chǎn)物、質(zhì)粒的測(cè)序工作交予金唯智生物技術(shù)(蘇州)有限公司完成。pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1,購自上海百風(fēng)生物科技有限公司;載體pCas9、pTargetF,Addgene。

1.1.2 主要試劑及儀器

PrimeSTAR Max DNA Polymerase、QuickCut Enzyme,TaKaRa(大連)生物有限公司;一步克隆酶,南京諾唯贊生物科技有限公司;酵母提取物、Rapid Bacterial Genomic DNA Isolation Kit、Ultra-Competent Cell Preps Kit、瓊脂粉、胰蛋白胨,生工生物工程(上海)股份有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品LNnT,Carbosynth (Berkshire, UK);葡萄糖、檸檬酸及其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

Waters e2695高效液相色譜,美國Waters公司;高速落地離心機(jī)、電轉(zhuǎn)儀,德國Eppendorf有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10(固體培養(yǎng)基額外添加瓊脂粉15～20 g/L)。

DM發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油20 g/L,KH2PO413.5 g/L,酵母提取物10 g/L,檸檬酸1.7 g/L,(NH4)2HPO44.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.4 g/L,微量金屬溶液10 mL/L(檸檬酸三鐵10 g/L,MgSO4·7H2O 2.25 g/L,CuSO4·5H2O 1.0 g/L, MnSO4·H2O 0.35 g/L,硼砂0.23 g/L,鉬酸銨0.11 g/L,CaCl2.2H2O 2.0 g/L),pH 6.8。

根據(jù)菌株抗性在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)抗生素,后文無特殊說明均為以下質(zhì)量濃度:氨芐青霉素(100 mg/L)、硫酸鏈霉素(50 mg/L)、鏈霉素(50 mg/L)、氯霉素(50 mg/L)、壯觀霉素(50 mg/L)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

游離表達(dá)lgtA、glmS、galE、NmlgtB。利用引物galE-F/galER和glmS-F/glmS-R(引物序列見表1,下同),獲得galE和glmS基因片段,通過一步克隆酶連接到載體pACYDuet-1的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間(BamH I/SaiI和BgiII/xho,下同),最終獲得質(zhì)粒pACY-glmS-galE。質(zhì)粒pET-lgtA-NmlgtB構(gòu)建方法同上。

將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,搖瓶發(fā)酵并定時(shí)取樣,利用HPLC定量測(cè)定LNnT含量。

1.2.2 組合優(yōu)化

以質(zhì)粒pACY-glmS-galE為模板,利用引物glmS-galE-F/glmS-galE-R(引物序列見表2,下同)擴(kuò)增出glmS-galE基因片段,構(gòu)建方法參照1.2.1節(jié),獲得質(zhì)粒pET-glmS-galE、pCDF-glmS-galE和pRSF-glmS-gal(相應(yīng)酶切位點(diǎn)為BgiII/xhoI)。

以質(zhì)粒pET-lgtA-NmlgtB為模板,利用引物lgtA-NmlgtB-F/lgtA-NmlgtB-R(引物序列見表2)擴(kuò)增出lgtA-NmlgtB基因片段,構(gòu)建方法同上,獲得質(zhì)粒pAC-lgtA-NmlgtB、pCDF-lgtA-NmlgtB和pRSF-lgtA-NmlgtB(相應(yīng)酶切位點(diǎn)為BgiII/xhoI)。

將上述獲得的質(zhì)粒表達(dá)glmS-galE基因片段的質(zhì)粒(pCDF-glmS-galE、pACY-glmS-galE、pRSF-glmS-galE、pET-glmS-galE)和表達(dá)lgtA-NmlgtB基因片段的質(zhì)粒(pAC-lgtA-NmlgtB、pCDF-lgtA-NmlgtB、pRSF-lgtA-NmlgtB、pET-glmS-galE)進(jìn)行組合,并轉(zhuǎn)入構(gòu)建的EL0大腸桿菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB,得到了12個(gè)不同的菌株,分別表示為SA1～SA12(表2)。搖瓶發(fā)酵并定時(shí)取樣,利用HPLC定量測(cè)定LNnT含量。

1.2.3 搖瓶?jī)?yōu)化

1.2.3.1 培養(yǎng)基種類對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響[18-20]

M9培養(yǎng)基(原始對(duì)照組):20 g/L甘油,12.8 g/L NaHPO4·7H2O,3 g/L KH2PO4,2 g/L NH4Cl,0.5 g/L NaCl,0.25 g/L MgSO4·7H2O,14.7 g/L CaCl2·2H2O,10 g/L Triton X-100(0.1%,體積分?jǐn)?shù)),1 mL/L·微量金屬溶液(25 g/L FeCl3·6H2O,2 g/L CaCl2·2H2O,2 g/L ZnCl2,2 g/L Na2MoO4·2H2O,1.9 g/L CuSO4·5H2O,0.5 g/L Н3BO3),pH 6.8。

M9CA培養(yǎng)基:20 g/L 甘油,13.3 g/L M9CA鹽(上海生工生物工程股份有限公司,具體組分為:2.0 g/L Casamino Acid;6.8 g/L Na2HPO4;3.0 g/L KH2PO4;1.0 g/L NH4Cl;0.5 g/L NaCl),1.4 g/L MgSO4,10 mg/L鹽酸硫胺素。

MOPS培養(yǎng)基:10×MOPS母液(/L):1 mol/L MOPS溶液400 mL,pH 7.4;1 mol/L Tricine 40 mL,pH 7.4;0.01 mol/L FeSO410 mL;1.90 mol/L NH4Cl 50 mL;0.276 mol/L K2SO410 mL;5.0×10-4mol/L CaCl2l0 mL;0.528 mol/L MgCl210 mL;5.0 mol/L NaCl 100 mL;微量元素:3×10-6mol/L (NH4)6(MO)24,4×10-4mol/L H3BO2,3×10-5mol/L CoCl2,10-5mol/L CuSO4,8×10-5mol/L MnCl2,10-5mol/L ZnSO410 mL,無菌蒸餾水360 mL。

MOPS培養(yǎng)基:10×MOPS母液100 mL,0.132 mol K2HPO410 mL,NH4Cl 4 g,甘油20 g,去離子水890 mL。

分別選用M9培養(yǎng)基、M9CA培養(yǎng)基、MOPS培養(yǎng)基和DM培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基,通過搖瓶發(fā)酵探究不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響。

1.2.3.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

選用不同的誘導(dǎo)溫度(20、25、28、30、37 ℃),通過搖瓶發(fā)酵探究不同誘導(dǎo)溫度下LNnT的產(chǎn)量變化情況。

1.2.3.3 誘導(dǎo)濃度對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

選用不同的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加量(0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L),使用DM培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),通過搖瓶發(fā)酵探究不同誘導(dǎo)劑IPTG添加量對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響。

1.2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

選用不同的誘導(dǎo)時(shí)間(2、4、6、7、8、9 h),通過搖瓶發(fā)酵探究不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)

挑取LB平板上劃線分離的單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min,過夜培養(yǎng);種子液接種量為2%(體積分?jǐn)?shù)),加入相應(yīng)抗生素,37 ℃,200 r/min,OD600=0.6時(shí)誘導(dǎo),IPTG濃度為0.4 mmol/L,將溫度改為25 ℃,誘導(dǎo)48 h后取樣。

1.2.5 分批補(bǔ)料發(fā)酵

發(fā)酵條件:種子液接種量為5%,初始乳糖質(zhì)量濃度為10 g/L,發(fā)酵罐培養(yǎng)基初始甘油質(zhì)量濃度為20 g/L,通氣量2 vvm,轉(zhuǎn)速800 r/min,培養(yǎng)溫度37 ℃,發(fā)酵過程利用體積分?jǐn)?shù)14%的NH4OH調(diào)節(jié)發(fā)酵罐pH為6.80。發(fā)酵過程中控制甘油濃度在較低水平以提高產(chǎn)物積累量,控制底物乳糖質(zhì)量濃度在(10±0.5) g/L左右,發(fā)酵罐溶氧為(30±5)%。

1.2.6 檢測(cè)方法

通過HPLC測(cè)定乳酰-N-新四糖的生成量。1 mL發(fā)酵液煮沸5 min,12 000 r/min高速離心5 min,通過0.22 μm 的膜過濾處理。

使用HPLC測(cè)定LNnT生成量所用檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器,色譜柱為Rezex ROA-organic acid (Phenomenex,USA),柱溫50 ℃;流動(dòng)相0.005 mol/L的H2SO4水溶液,流速0.6 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5軟件繪制本文圖像,使用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 模塊組合優(yōu)化

為了優(yōu)化LNnT的合成途徑,引入模塊組合優(yōu)化,通過不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒改變模塊的代謝通量,將LNnT合成途徑分為模塊I(基因glmS和galE)與模塊Ⅱ(lgtA和NmlgtB)。將攜帶基因glmS-galE和lgtA-NmlgtB的不同載體組合導(dǎo)入宿主BL21(DE3)ΔlacZΔwecB中,獲得如表2所示的菌株SA1～SA12。對(duì)12個(gè)不同的菌株搖瓶發(fā)酵后的乳酰-N-新四糖的產(chǎn)量分別為1.168、0.423、0.693、0.187、0.645、0.452、0.365、0.420、0.463、0.105、0.243、0.105 g/L。其中含有重組質(zhì)粒pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB的工程菌SA1獲得了1.168 g/L的最高產(chǎn)量(見圖2)。

模塊的表達(dá)量值由質(zhì)?？截悢?shù)決定,質(zhì)粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1的質(zhì)?？截悢?shù)分別約為>100,～40,20～40,10～20[21]。

搖瓶培養(yǎng)后,全部菌株均具有產(chǎn)LNnT的能力,但產(chǎn)量差異較大。大多數(shù)菌株產(chǎn)生的LNnT低于0.5 g/L,但SA1、SA3和SA5在內(nèi)的3個(gè)菌株分別產(chǎn)生了1.168、0.693、0.645 g/L的LNnT,所得菌株SA1含有pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB,作為L(zhǎng)NnT生物合成的最佳菌株,產(chǎn)量為1.168 g/L。因此,lgtA、NmlgtB、glmS和galE基因相對(duì)高水平的表達(dá)有助于LNnT在細(xì)胞中的高效代謝合成。

結(jié)果表明,結(jié)合的高拷貝數(shù)質(zhì)粒,菌株SA1顯示出各種模塊表達(dá)對(duì)提高LNnT產(chǎn)量的協(xié)同效應(yīng)(1.168 g/L),可能是因?yàn)檫^表達(dá)關(guān)鍵酶基因減輕了中間產(chǎn)物的積累,并促進(jìn)了中間產(chǎn)物向目標(biāo)產(chǎn)物的有效轉(zhuǎn)化。

工程菌SA6與SA1相比,菌體生物量(OD600)從9.60上升到了12.56,增加了30.8%,這可能是由于產(chǎn)物合成途徑的碳通量部分流向了細(xì)胞生長(zhǎng)的方向。

2.2 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基種類對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

對(duì)于LNnT的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)來說,培養(yǎng)條件是較為重要的外部條件,因此對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化是有必要的。選取M9培養(yǎng)基(原始對(duì)照組)、M9CA培養(yǎng)基、MOPS培養(yǎng)基和DM培養(yǎng)基4種培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基,研究選擇最優(yōu)菌株SA1的最適培養(yǎng)基組成。

結(jié)果如圖3所示,DM培養(yǎng)基中LNnT產(chǎn)量更高,OD600相較于其他培養(yǎng)基更高,表明菌體生長(zhǎng)可能更有助于LNnT的積累,可能是M9(原始對(duì)照組)、M9CA以及MOPS培養(yǎng)基中含有無機(jī)氮源NH4Cl,且濃度相對(duì)較高,有文獻(xiàn)表示NH4Cl濃度過高可能會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)從而降低產(chǎn)物積累[22],與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此選用DM培養(yǎng)基作為工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖3 不同培養(yǎng)基種類對(duì)LNnT生產(chǎn)的影響Fig.3 Effects of different kinds of culture media on LNnT production

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

由圖4可知,隨著誘導(dǎo)溫度的增加,LNnT的產(chǎn)量也隨之增加,表示在一定溫度范圍內(nèi),LNnT的產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加,但當(dāng)誘導(dǎo)溫度>25 ℃時(shí),隨著溫度的升高,工程菌株產(chǎn)LNnT的能力隨著溫度的升高反而降低,最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃。酶促反應(yīng)及細(xì)胞生長(zhǎng)與溫度變化有關(guān),隨著溫度的上升,反應(yīng)速度加快,呼吸強(qiáng)度增加,細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖加快。但隨著溫度的持續(xù)上升,酶的正確折疊受到影響,不利于LNnT的發(fā)酵生產(chǎn)[22]。

圖4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)LNnT生產(chǎn)的影響Fig.4 Effect of different induction temperatures on LNnT production

2.2.3 誘導(dǎo)濃度對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

由圖5可知,LNnT產(chǎn)物積累隨著誘導(dǎo)劑IPTG的濃度出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),最佳誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L。有研究表明lgtA基因在異源表達(dá)時(shí)易形成包涵體[23],可能中等濃度的誘導(dǎo)劑有利于關(guān)鍵基因的可溶性過表達(dá),從而促進(jìn)LNnT的生產(chǎn)。

圖5 不同誘導(dǎo)濃度對(duì)LNnT生產(chǎn)的影響Fig.5 Effects of different inducing concentrations on LNnT production

2.2.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LNnT產(chǎn)量的影響

由圖6可知,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,LNnT產(chǎn)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加,當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為8 h時(shí),LNnT產(chǎn)量達(dá)到最大值(2.50 g/L),之后產(chǎn)量降低?？赡苁且?yàn)楫?dāng)誘導(dǎo)時(shí)間過短時(shí),細(xì)胞菌體量及酶的表達(dá)量較少,導(dǎo)致產(chǎn)物積累量減少,而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過8 h時(shí),細(xì)胞菌體量過多,大量碳源被生長(zhǎng)代謝消耗,從而減少LNnT產(chǎn)物的積累,故最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)LNnT生產(chǎn)的影響Fig.6 Effect of different induction time on LNnT production

2.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵

由表3可知,DONG等[24]在枯草芽孢桿菌168中過表達(dá)lacY、lgtA和lgtB,通過引入模塊化工程策略,平衡關(guān)鍵前體物質(zhì),在搖瓶發(fā)酵條件下,LNnT產(chǎn)量為1.95 g/L,補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為4.52 g/L。此外,通過下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)水平可以提高LNnT的產(chǎn)量,在搖瓶發(fā)酵條件下,LNnT產(chǎn)量為2.3 g/L,通過補(bǔ)料分批發(fā)酵,LNnT產(chǎn)量提高到5.41 g/L[25]。

表3 國內(nèi)外產(chǎn)LNnT方法及產(chǎn)量相關(guān)報(bào)道詳細(xì)信息Table 3 Reports on LNnT production methods and output at home and abroad

ZHANG等[26]通過在大腸桿菌K12中過表達(dá)lgtA、lgtB構(gòu)建從頭合成途徑,通過過表達(dá)lacY提高LNnT產(chǎn)量,在搖瓶發(fā)酵條件下,LNnT產(chǎn)量為1.2 g/L。

ZHANG等[14]通過在大腸桿菌中過表達(dá)lgtA、galE、galT,并利用不同拷貝數(shù)質(zhì)粒進(jìn)行組合優(yōu)化,對(duì)培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化后,在搖瓶發(fā)酵條件下,LNnT產(chǎn)量為1.25 g/L,補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為12.1 g/L。

分批補(bǔ)料發(fā)酵過程如圖7所示,培養(yǎng)11 h后菌體OD600達(dá)到20時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo),加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)溫度為30 ℃,初始乳糖的質(zhì)量濃度為10 g/L。為了維持菌體生長(zhǎng)以及LNnT的合成,待初始甘油消耗完后流加800 g/L的甘油(含20 g/L的MgSO4·7H2O,0.2 g/L硫胺素)以補(bǔ)充碳源,通過pH反饋調(diào)節(jié)(設(shè)置流速為20 mL/h)使甘油在發(fā)酵體系中的濃度維持在較低濃度水平(甘油用于菌體生長(zhǎng)和代謝,質(zhì)量濃度約為0 g/L)至發(fā)酵結(jié)束。

圖7 工程菌SA1補(bǔ)料分批發(fā)酵生物合成LNnTFig.7 Biosynthesis of LNnT by fed-batch fermentation of engineering strain SA1

待初始乳糖消耗完后手動(dòng)補(bǔ)加300 g/L的乳糖并使其在發(fā)酵體系中的終質(zhì)量濃度維持在(10±0.5) g/L左右,發(fā)酵過程中若乳糖消耗至<5 g/L時(shí)繼續(xù)補(bǔ)加乳糖至發(fā)酵結(jié)束。18 h后逐漸產(chǎn)生LNnT。發(fā)酵65 h后LNnT收率達(dá)到最大值(14.25 g/L)是搖瓶發(fā)酵的5.7倍。

本研究通過在E.coliBL21(DE3)ΔlacZΔwecB中過表達(dá)lgtA、lgtB、galE、glmS,構(gòu)建LNnT從頭合成途徑,通過調(diào)控代謝通路關(guān)鍵酶基因的拷貝數(shù)以及優(yōu)化搖瓶發(fā)酵條件,以提高LNnT產(chǎn)量,在搖瓶發(fā)酵條件下,LNnT產(chǎn)量為2.5 g/L,通過補(bǔ)料分批發(fā)酵,LNnT產(chǎn)量提高到14.25 g/L(如圖7所示),優(yōu)于目前文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)量(如表3所示)。

3 結(jié)論

本文以大腸桿菌BL21(DE3)ΔlacZΔwecB為出發(fā)菌株,通過調(diào)控中心碳代謝并弱化副產(chǎn)物途徑、重構(gòu)乳酰-N-新四糖合成途徑、上調(diào)從頭合成途徑的關(guān)鍵酶、調(diào)控代謝通路基因的拷貝數(shù)以及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化等策略實(shí)現(xiàn)工程菌的構(gòu)建和乳酰-N-新四糖的高效合成。本文得到的重組大腸桿菌可以利用乳糖高效合成乳酰-N-新四糖,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)乳酰-N-新四糖胞外產(chǎn)量達(dá)2.50 g/L,補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量為14.25 g/L,是目前報(bào)道的最高LNnT產(chǎn)量。本研究為利用微生物工業(yè)化生產(chǎn)LNnT提供方法學(xué)研究思路,然而,發(fā)酵過程仍需添加抗生素,可能導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加以及生物安全問題,后續(xù)可考慮將關(guān)鍵酶基因整合至染色體,降低生產(chǎn)成本。