孟丹陽(yáng),杜艷,2*,陳復(fù)生*

1(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南 鄭州,450001)2(河南工業(yè)大學(xué) 小麥和玉米深加工國(guó)家工程研究中心,河南 鄭州,450001)

微藻是一類(lèi)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形態(tài)微小的水生生物,含有葉綠體,能夠進(jìn)行光合作用吸收CO2,生產(chǎn)有機(jī)物。微藻的生物固碳能力較強(qiáng),光合效率是陸地植物的10～50倍[1],可緩解由大氣中CO2濃度升高引起的溫室效應(yīng)等環(huán)境問(wèn)題,是實(shí)現(xiàn)“碳中和”的有效途徑。此外,微藻往往通過(guò)二分裂式繁殖,細(xì)胞生長(zhǎng)周期短,在惡劣環(huán)境中的生存能力強(qiáng)。與傳統(tǒng)農(nóng)作物相比,微藻的養(yǎng)殖方式靈活且不占用耕地資源,是極具經(jīng)濟(jì)和環(huán)保價(jià)值的新食品原料之一,受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。

微藻種類(lèi)繁多,目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)15.7×104種[2],其中用于大規(guī)模養(yǎng)殖或生產(chǎn)的微藻主要分為4個(gè)藻門(mén):藍(lán)藻門(mén)、綠藻門(mén)、紅藻門(mén)和金藻門(mén)。我國(guó)已批準(zhǔn)可作為新食品原料的微藻及其主要成分分布如表1所示。作為一種良好的新型蛋白質(zhì)來(lái)源,微藻蛋白不僅含量豐富,且氨基酸組成全面均衡,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,可添加于食品或用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑和保健食品的開(kāi)發(fā)。此外,微藻蛋白能夠調(diào)節(jié)機(jī)體健康和預(yù)防疾病,具有抗疲勞、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗血栓等功效[3-6],因此可被用于制作護(hù)膚品、化妝品、藥物、疫苗等。LIU等[7]研究了螺旋藻蛋白對(duì)小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的潛在機(jī)制,證明了螺旋藻蛋白具有促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用。此外,藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白等還具有良好的熒光特性和光敏特性,在分子探針、熒光染料等的研制方面應(yīng)用廣泛[8-10]。

表1 我國(guó)已批準(zhǔn)可作為新食品原料的微藻及其主要成分分布Table 1 Microalgae that have been approved as new food raw materials in China and their main components

微藻蛋白質(zhì)的提取一般包括培養(yǎng)采收、濕藻干燥、破壁提取和分離純化。由于微藻種類(lèi)繁多,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成差異較大,且大都堅(jiān)韌難以破壞,使得高效打破微藻細(xì)胞壁,釋放胞內(nèi)活性物質(zhì)成為微藻蛋白質(zhì)提取的關(guān)鍵。因此本文主要從破壁的角度,綜述了提取微藻蛋白質(zhì)的方法,闡明現(xiàn)有常規(guī)方法的研究進(jìn)展以及各方法的優(yōu)勢(shì)與不足,旨在為高效提取微藻中的蛋白質(zhì)提供指導(dǎo),促進(jìn)微藻及其蛋白產(chǎn)品的高值化利用。

1 傳統(tǒng)微藻蛋白提取方法

微藻蛋白的提取方法可分為機(jī)械法和非機(jī)械法。機(jī)械方法主要是通過(guò)物理手段,打破細(xì)胞屏障,破壞植物細(xì)胞壁,使微藻蛋白從細(xì)胞中釋放出來(lái),常用的有超聲波、球磨、高壓均質(zhì)和脈沖電場(chǎng)等。非機(jī)械法有反復(fù)凍融法、水酶法和離子液體提取等[11]。

1.1 機(jī)械方法

1.1.1 球磨法

球磨法是一種機(jī)械細(xì)胞破碎方法,所用設(shè)備為球磨機(jī),小球直徑通常小于1 mm;經(jīng)過(guò)攪拌器使得微藻細(xì)胞懸液與珠子之間充分混合,通過(guò)珠子與細(xì)胞之間的互相碰撞、剪切,造成細(xì)胞壁破裂促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)溶出[12](圖1-a)。球磨法由于細(xì)胞破碎率高、通量高以及良好的溫度控制而備受關(guān)注,且勞動(dòng)力強(qiáng)度低、細(xì)胞破碎連續(xù)化程度高,易于工業(yè)化實(shí)施。迄今為止,使用球磨機(jī)破碎微藻細(xì)胞壁釋放微藻蛋白等活性成分的研究多有報(bào)道。

a-球磨法;b-超聲輔助法;c-高壓均質(zhì)法;d-脈沖電場(chǎng)法;e-離子液體法圖1 微藻蛋白質(zhì)提取作用機(jī)理圖Fig.1 Mechanism of protein extraction from microalgae

ALAVIJEH等[13]為了提取小球藻蛋白質(zhì),采用球磨機(jī)對(duì)小球藻的細(xì)胞壁進(jìn)行破碎處理,結(jié)果表明,僅0.5 min后,大約10%的可溶性蛋白質(zhì)被釋放出來(lái)。隨著接觸時(shí)間的增加,微珠與微藻細(xì)胞的接觸面增加,導(dǎo)致更多的細(xì)胞破碎,8 min后可溶性蛋白的釋放率達(dá)到40%。對(duì)球磨后得到的微藻蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白質(zhì)組成并未發(fā)生變化,保留了蛋白質(zhì)原有功能活性。該結(jié)果證實(shí)了球磨處理破壞微藻細(xì)胞壁的有效性,同時(shí),球磨過(guò)程可以通過(guò)控制操作條件,保證微藻蛋白的結(jié)構(gòu)不被破壞,保留其功能活性。SAFI等[14]在微擬球藻細(xì)胞破碎能耗及水溶性蛋白溶出的研究表明,球磨法在20 min內(nèi)細(xì)胞破碎率達(dá)到95%以上,蛋白質(zhì)提取率為53%,能量消耗小于0.5 kWh/kg微藻生物量。類(lèi)似的效果在SUAREZ GARCIA等[15]的研究中也有體現(xiàn),在0.433 kWh/kg微藻生物量的中低等能耗條件下,球磨8 min可在可溶性相中釋放近95%的蛋白質(zhì)。

球磨過(guò)程所用能耗較大,如何降低能耗,提高蛋白回收率是球磨過(guò)程的一大難題,往往需要大量的優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳的提取條件,珠料和尺寸、腔填充率、懸浮液濃度、攪拌速度、停留時(shí)間和喂料率都是重要的影響因素。LIU等[16]對(duì)球磨、離心和微過(guò)濾回收小球藻蛋白質(zhì)的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得出球磨過(guò)程懸浮液濃度為60 g/L,溫度10 ℃,離心裂解稀釋液濃度為30 g/L,pH為7,溫度20 ℃,微濾體積減小率為3時(shí),蛋白回收率為12%,回收每克蛋白質(zhì)的能量消耗為10 kWh。在球磨懸浮液濃度為90 g/L,pH為7,稀釋液濃度為30 g/L,添加0.1 mol/L NaCl,溫度20 ℃,微濾體積減小率為20時(shí),蛋白回收率可達(dá)25%。POSTMA等[17]研究了珠子尺寸與蛋白質(zhì)提取率的關(guān)系,顆粒越小,動(dòng)力學(xué)速率越高,比能耗最小。此外,球磨過(guò)程的比能耗還與微藻的種類(lèi)、干細(xì)胞質(zhì)量濃度和微藻的培養(yǎng)條件有關(guān)[11]。珠磨處理具有溫和高效的特點(diǎn),但需冷卻裝置控制珠磨的溫度,溫度對(duì)微藻蛋白的功能活性有顯著的影響[18]。

1.1.2 超聲輔助提取

超聲波處理技術(shù)由于在處理低劑量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便、損失較少,在實(shí)驗(yàn)室已普遍應(yīng)用于細(xì)胞破碎處理。超聲波能用于破碎細(xì)胞壁歸功于超聲波產(chǎn)生的微尺度渦流和高效傳質(zhì),以及氣泡的生成、變大到最后的破碎形成的空化效應(yīng)。超聲波通過(guò)將微藻暴露于高強(qiáng)度的超聲波而引起細(xì)胞破裂,致使液體介質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生微小的不穩(wěn)定的空化氣泡,由于空化效應(yīng),氣泡爆炸產(chǎn)生沖擊波和能量,形成的高剪切力最終破壞剛性細(xì)胞壁并釋放胞內(nèi)物質(zhì)(圖1-b)[19]。

MITTAL等[20]首次報(bào)道了利用超聲波法對(duì)大型海洋藻類(lèi)中的藻紅蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)和藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanin,R-PC)進(jìn)行初步提取。對(duì)超聲處理進(jìn)行優(yōu)化后,其單獨(dú)使用的蛋白提取率并不理想,因此考慮與其他方法聯(lián)合使用。結(jié)果表明,當(dāng)超聲與其他常規(guī)一次提取方法聯(lián)合使用時(shí),觀察到協(xié)同效應(yīng)。與超聲聯(lián)合均質(zhì)比單獨(dú)均質(zhì)可提高9.3%的效率。同樣,浸軟結(jié)合超聲波處理比單獨(dú)浸軟處理的效率提高了31%。在所有提取方法中,浸軟結(jié)合超聲的提取效率最高,R-PE和R-PC的提取率分別為77%和93%,其次是超聲均質(zhì)(R-PE和R-PC的提取率分別為69.6%和74.1%)。采用高效液相色譜法分析,以確保提取物中存在R-PE,并在處理后仍保持完整。顯微研究表明,在給定的初步提取方法中,藻膽蛋白的提取效率與細(xì)胞破壞程度之間存在明顯的關(guān)系。這些組合方法可有效地從大藻中提取藻膽蛋白,類(lèi)似的規(guī)律在微藻蛋白的提取中也同樣適用。張會(huì)香等[21]比較了反復(fù)凍融法、超聲波破碎法和超聲結(jié)合反復(fù)凍融提取地木耳藻藍(lán)蛋白的效果,當(dāng)超聲波輔助反復(fù)凍融法時(shí),藻藍(lán)蛋白的提取率是反復(fù)凍融法的3.8倍,超聲波法的1.1倍。表明了超聲波輔助的有效性。余佳等[22]通過(guò)比較直接水提法和超聲波輔助水提法,證實(shí)了超聲波輔助有助于葛仙米藻膽蛋白的提取。HILDEBRAND等[23]在超聲輔助下,用0.4 mol/L NaOH溶液和4 mol/L HCl溶液連續(xù)溶劑萃取小球藻蛋白,蛋白回收率為(79.1±5.3)%,比未超聲處理的對(duì)照組提高了1.32倍。同樣,YOSHIDA 等[24]也證實(shí)了超聲處理能夠提高鹽溶液對(duì)紅藻中藻藍(lán)蛋白的提取效率。劉習(xí)軍[25]以超聲輔助球磨機(jī)對(duì)微擬球藻進(jìn)行破壁,超聲波輔助使得球磨細(xì)胞破碎率達(dá)到95%的時(shí)間從35 min減少到了20 min,并降低了破壁過(guò)程的能耗。TAVAKOLI等[26]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)超聲輔助溶劑提取藻藍(lán)蛋白,相比于未經(jīng)超聲處理的對(duì)照組具有顯著優(yōu)勢(shì)。并且,增加超聲時(shí)間會(huì)提高藻藍(lán)蛋白的濃度,但超聲時(shí)間超過(guò)20 min,可能會(huì)造成藻藍(lán)蛋白的降解,使產(chǎn)物含量下降。SOMMER等[27]在相同能耗下比較了反復(fù)凍融、脈沖電場(chǎng)、超聲處理和火花放電提取微藻蛋白的效率,結(jié)果表明超聲處理后的藻蛋白粗提液中濃度最高,達(dá)到53 mg/g。

超聲處理的高效性已被廣泛證實(shí),然而超聲過(guò)程會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng),對(duì)微藻蛋白的穩(wěn)定性有一定影響,同時(shí),超聲處理所需能耗高,常用于實(shí)驗(yàn)室少量樣品的處理,實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還需解決能量消耗的問(wèn)題。

1.1.3 高壓均質(zhì)

高壓均質(zhì)是工業(yè)上常用的細(xì)胞破壁技術(shù)之一,其破壁主要是依靠細(xì)胞受到高速撞擊力和高壓剪切力,在突變壓差及產(chǎn)生的氣泡空化效應(yīng)作用下最終使得細(xì)胞破裂[28](圖1-c)。目前,高壓均質(zhì)技術(shù)具有較為成熟的工業(yè)設(shè)備,得到廣泛應(yīng)用。

ZHANG等[29]研究超聲及高壓均質(zhì)對(duì)凱氏擬小球藻的破壁效率,超聲處理后的微藻細(xì)胞體中出現(xiàn)了空隙、孔洞和微小裂縫,但該變化在掃描電鏡圖像中并不明顯,而超聲后再對(duì)微藻進(jìn)行高壓均質(zhì),可從掃描電鏡圖像中明顯看出大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生破裂,細(xì)胞壁喪失完整性,表明了高壓均質(zhì)破壁的高效性。此外,ZHANG等[30]比較了高壓放電與高壓均質(zhì)對(duì)釋放凱氏擬小球藻胞內(nèi)化合物的影響,高壓放電技術(shù)能有效提取微藻離子細(xì)胞組分及碳水化合物,但對(duì)蛋白的提取率不超過(guò)15%,而高壓均質(zhì)有利于所有組分的釋放,其蛋白提取率是高壓放電處理的4.9倍。該結(jié)論在證實(shí)高壓均質(zhì)的高效性同時(shí),也顯示出了高壓均質(zhì)技術(shù)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物不具備選擇性,因此可能會(huì)造成蛋白產(chǎn)品純度不足,需要進(jìn)一步純化操作。

在CANELLI等[31]研究中,微藻細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)(high pressure homogenization,HPH)處理后,平均直徑由(5.1±0.1) μm減少到(2.0±0.1) μm,表明了該處理使微藻細(xì)胞發(fā)生解體,進(jìn)一步支持了HPH是最有效的破壁方法之一,而且與酶處理相比,高壓均質(zhì)能獲得更高的蛋白回收率以及脂質(zhì)回收率。但是,高壓均質(zhì)獲得的產(chǎn)品其氧化穩(wěn)定性較差,因此如何獲得穩(wěn)定性更高的產(chǎn)品是高壓均質(zhì)需解決的問(wèn)題。

高壓均質(zhì)的蛋白提取率與壓力的選擇有很大關(guān)系,在RUIZ-DOMNGUEZ等[32]研究中發(fā)現(xiàn),隨著壓力增加,極大螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的提取率升高,但壓力從1 400 bar增加到1 600 bar過(guò)程中藻藍(lán)蛋白含量下降,在壓力1 400 bar時(shí)獲得藻藍(lán)蛋白含量最高(291.9 mg/g)的粗提液。

高壓均質(zhì)法與多數(shù)傳統(tǒng)方法相比具有易于擴(kuò)大的顯著優(yōu)勢(shì),利于工業(yè)化大規(guī)模樣品的處理。但是該法也存在對(duì)產(chǎn)物不具有選擇性、只適用于低濃度藻液、高能耗以及對(duì)細(xì)胞壁堅(jiān)固的微藻破壁效果差等問(wèn)題。與其他方法聯(lián)合使用可改善當(dāng)前的不足,如ZHANG等[29]使用超聲處理和高壓均質(zhì)聯(lián)合可以提高提取效率并降低能耗。

1.1.4 脈沖電場(chǎng)

脈沖電場(chǎng)處理是依靠外部電場(chǎng),使細(xì)胞壁達(dá)到臨界電勢(shì),誘導(dǎo)細(xì)胞壁形成電穿孔,增加了細(xì)胞通透性,從而促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出[33](圖1-d)。脈沖電場(chǎng)并不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。其作用效果與溫度、介質(zhì)電導(dǎo)率、電場(chǎng)強(qiáng)度等有關(guān)。CARULLO等[34]研究了處理強(qiáng)度、脈沖極性和入口溫度對(duì)鈍頂螺旋藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)和藻藍(lán)蛋白等水溶性化合物的損傷和萃取效率的影響。當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)為20 kV/cm,能量輸入從60 kJ/kg微藻懸浮液增加到100 kJ/kg微藻懸浮液時(shí),上清液中蛋白質(zhì)的含量增加了2.7倍。當(dāng)能量輸入為100 kJ/kg微藻懸浮液時(shí),電場(chǎng)強(qiáng)度從10 kV/cm增加到20 kV/cm,蛋白質(zhì)含量也會(huì)顯著增加。這表明了蛋白質(zhì)的釋放與電場(chǎng)強(qiáng)度和能量輸入強(qiáng)相關(guān)。這與張若兵等[35]的結(jié)論一致。

脈沖電場(chǎng)處理是一種溫和的提取方式,只增加了細(xì)胞通透性,并未對(duì)細(xì)胞造成破壞,因此蛋白質(zhì)提取率往往不高,但蛋白純度較高。脈沖電場(chǎng)處理的提取效率與微藻種類(lèi)有關(guān)。在CHITTAPUN等[36]的研究中,脈沖電場(chǎng)處理僅對(duì)念珠藻提取蛋白有效,而對(duì)顫藻無(wú)效。這與微藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān),顫藻的細(xì)胞壁強(qiáng)度更大,因此脈沖處理的溫和條件不能使蛋白質(zhì)釋放。LEONHARDT等[37]也證實(shí)了這一點(diǎn),脈沖電場(chǎng)對(duì)具有剛性細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的微藻,提取作用微乎其微。

為了提高產(chǎn)率,將脈沖電場(chǎng)與其他方法結(jié)合是一種有效的途徑。CARULLO等[38]證實(shí)了高剪切均質(zhì)與脈沖電場(chǎng)聯(lián)合處理提取鈍頂螺旋藻的蛋白質(zhì),其水溶性蛋白和藻藍(lán)蛋白的提取率均比單獨(dú)使用脈沖電場(chǎng)時(shí)要高。在CARULLO等[34]此前的研究中發(fā)現(xiàn)溫和加熱也有助于提高脈沖電場(chǎng)處理的提取率。KFERB?CK等[39]報(bào)告了凍融和脈沖電場(chǎng)的協(xié)同作用,藻藍(lán)蛋白的釋放量是未脈沖電場(chǎng)處理3倍,藻藍(lán)蛋白的回收率為90%,純度達(dá)2.45,為高效提取提供了一種有效的選擇。也有研究在脈沖電場(chǎng)處理前加入酶降解細(xì)胞壁,去除細(xì)胞壁后的蛋白質(zhì)產(chǎn)量與僅脈沖電場(chǎng)處理相比增加了2倍以上[40]。

目前關(guān)于脈沖電場(chǎng)在微藻蛋白質(zhì)提取方面的應(yīng)用尚處于初步階段,主要優(yōu)勢(shì)是處理?xiàng)l件溫和,可選擇性釋放水溶性蛋白質(zhì),獲得蛋白質(zhì)的純度高,節(jié)省了純化步驟。然而該法存在提取率低,不適合大量樣品的提取等問(wèn)題,需要進(jìn)一步研究脈沖電場(chǎng)處理的條件,以及考慮與其他方法的結(jié)合。

1.2 非機(jī)械法

1.2.1 反復(fù)凍融法

反復(fù)凍融法會(huì)使細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,剩余細(xì)胞液鹽濃度增高,使細(xì)胞破裂,損壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),釋放細(xì)胞內(nèi)目的產(chǎn)物。GHOSH等[41]在磷酸鹽緩沖液中對(duì)螺旋藻分別進(jìn)行反復(fù)凍融、超聲波和人工破碎處理,其中凍融法獲得的藻紅蛋白回收率和純度均最高,總蛋白回收率也最高。采用反復(fù)凍融法提取微藻蛋白時(shí),不同浸泡時(shí)間、料液比、凍融時(shí)間以及不同凍融次數(shù)都會(huì)對(duì)微藻蛋白提取率產(chǎn)生影響。俞建峰等[42]在研究中發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融次數(shù)為4次時(shí),藻藍(lán)蛋白得率最高達(dá)到8.26%。羅愛(ài)國(guó)等[43]以鈍頂螺旋藻藻粉為試驗(yàn)材料,采用反復(fù)凍融法提取藻藍(lán)蛋白。結(jié)果表明4個(gè)因素影響效果為:凍融時(shí)間最大,其次是凍融次數(shù)、浸泡時(shí)間,最后是料液比,最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶20(g∶mL)、浸泡時(shí)間22 h、凍融時(shí)間6 h、凍融次數(shù)6次。最優(yōu)條件下藻藍(lán)蛋白提取率可達(dá)近30%。CHITTAPUN等[36]用反復(fù)凍融法對(duì)2種不同的藍(lán)藻進(jìn)行處理,結(jié)果表明緩沖液濃度和凍融循環(huán)次數(shù)均對(duì)蛋白質(zhì)提取率有顯著影響,細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的藍(lán)藻僅需3次循環(huán)釋放蛋白質(zhì)的濃度和純度即達(dá)最高值,而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的種類(lèi)則需18個(gè)循環(huán)周期才可達(dá)最高濃度和純度。凍融循環(huán)次數(shù)過(guò)高還會(huì)造成蛋白質(zhì)的降解。因此對(duì)不同物種的微藻,凍融條件要具體考慮。類(lèi)似的,GHOSH等[41]對(duì)反復(fù)凍融法提取螺旋藻藻紅蛋白進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),證實(shí)了低摩爾濃度的緩沖液有利于藻紅蛋白的提取,并且在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH為8,凍融循環(huán)7次時(shí)得到藻紅蛋白回收率最高。朱孝晨[3]在螺旋藻藻粉中加入磷酸鹽緩沖溶液浸提,經(jīng)反復(fù)凍融后得到純度為0.56的藻藍(lán)蛋白粗提液,經(jīng)純化后,藻藍(lán)蛋白回收率為83.81%,純度1.08。

然而凍融法提取胞內(nèi)蛋白耗時(shí)長(zhǎng),且不適用于大規(guī)模生產(chǎn),只適合實(shí)驗(yàn)室小部分產(chǎn)品的處理。因?yàn)榇罅康脑孱?lèi)樣品無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)凍融。在邱月[44]的研究中凍融法提取雨生紅球藻蛋白時(shí),耗時(shí)約36 h,提取率為30%,提取時(shí)間顯著高于研磨法和高速勻漿法達(dá)到同等提取率的時(shí)長(zhǎng)。使用凍融法提取蛋白時(shí),為了提高得率,通常需要消耗大量溶劑。張文怡[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),采用凍融法提取紅毛菜藻紅蛋白,達(dá)到與雙酶法相同提取率時(shí),凍融法需要消耗酶法10倍的溶劑量。此外,在SOMMER等[27]的研究中發(fā)現(xiàn),凍融細(xì)胞密度較低時(shí)凍融法更為有效,而在實(shí)際生產(chǎn)中,低細(xì)胞密度往往不現(xiàn)實(shí),高能耗也是阻礙實(shí)際應(yīng)用的原因之一。

1.2.2 水酶法提取

水酶法最初應(yīng)用于植物細(xì)胞油脂的提取,由于該法提取油脂后廢水中存在大量蛋白質(zhì)會(huì)造成環(huán)境污染,之后越來(lái)越多研究者們開(kāi)始應(yīng)用水酶法提取蛋白質(zhì)。水酶法可以直接從濕藻中提取蛋白質(zhì),省去了干燥微藻的過(guò)程,減少了大量的能耗。此外,與傳統(tǒng)的堿提法相比,酶法反應(yīng)條件溫和,而且不易引入雜質(zhì),且能更好地維持蛋白質(zhì)的構(gòu)型、構(gòu)象和光學(xué)特性,具有專(zhuān)一性。例如,趙麗[45]用纖維素酶提取藻紅蛋白,處理時(shí)長(zhǎng)15 h,純度可達(dá)0.37。

酶制劑的成本高是水酶法應(yīng)用的一個(gè)主要問(wèn)題,除了依靠固定化酶技術(shù)的發(fā)展,還可以與其他方法聯(lián)合,減少酶的用量,從而降低酶制劑成本。TAVANANDI等[46]比較了酶法和表面活性劑提取藻藍(lán)蛋白的效率,并分別結(jié)合超聲處理,結(jié)果顯示采用超聲輔助溶菌酶提取藻藍(lán)蛋白得率最高,為92.73 mg/g干物質(zhì),提取率為77.92%,純度為1.09。FERREIRA-SANTOS等[47]采用歐姆加熱和酶法聯(lián)合提取可高效打破螺旋藻細(xì)胞壁,選擇性地回收藻膽蛋白,與常規(guī)熱提法相比,其產(chǎn)率提高了100%以上。

由于不同植物細(xì)胞壁組成不同,因此選用不同的酶提取微藻植物蛋白質(zhì)時(shí),效果也不相同。SIERRA等[48]比較了自溶酶、胰蛋白酶、溶菌酶和膠原蛋白酶4種酶對(duì)萊茵衣藻的破壁效果,通過(guò)顯微分析得出自溶酶對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞壁的破壞效果最好。溶菌酶也有一定的活性,但不如對(duì)富含糖蛋白的細(xì)胞壁有專(zhuān)一性的自溶酶效果顯著。此外,研究還證實(shí)了自溶酶聯(lián)合超聲處理可以使蛋白質(zhì)完全溶解。且自溶酶是由萊茵衣藻原位產(chǎn)生,極大降低了酶的成本。為了更高效地提取萊茵衣藻胞內(nèi)蛋白質(zhì),SOTO-SIERRA等[49]做了進(jìn)一步試驗(yàn),選用原位產(chǎn)生的自溶酶打破萊茵衣藻細(xì)胞壁提取胞內(nèi)蛋白質(zhì),經(jīng)自溶酶處理后可釋放50%的蛋白質(zhì),再經(jīng)二級(jí)胰蛋白酶處理,蛋白質(zhì)釋放率達(dá)64%。該方法酶的專(zhuān)一性更高,降低了酶的成本,省去了能量消耗大的機(jī)械處理過(guò)程。

復(fù)合酶比單一酶在藻體組織細(xì)胞壁降解效果上更有優(yōu)勢(shì)[50],為微藻蛋白的規(guī)?；a(chǎn)提供了新思路。施瑛等[51]比較了纖維素酶、果膠酶對(duì)紫菜藻紅蛋白的提取效果,研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶和果膠酶的最佳酶配比為7∶3的復(fù)合酶液提取效果更好,得率可達(dá)2.26%,純度可達(dá)1.66。COELHO等[52]篩選了大量碳水化合物酶和硫酸鹽酶,評(píng)估它們單獨(dú)和聯(lián)合使用時(shí)對(duì)鈍頂螺旋藻的破壁能力,結(jié)果證實(shí)了溶菌酶和α-淀粉酶的混合酶處理破壁效果最顯著,能夠提高蛋白質(zhì)的釋放。CANELLI等[31]選用幾丁質(zhì)酶、鼠李糖水解酶和半乳糖酶組合對(duì)小球藻進(jìn)行酶解,酶促處理釋放的蛋白質(zhì)由對(duì)照組的(49.2±3.9)%增加到(58.7±3.5)%。說(shuō)明了復(fù)合酶解能夠高效釋放胞內(nèi)蛋白,并且酶法能夠保持細(xì)胞完整性,從而保證胞內(nèi)化合物的穩(wěn)定性。

水酶法在應(yīng)用時(shí),酶解效率受諸多因素的影響,如酶解時(shí)間、溫度、pH等。溫度和pH通過(guò)影響酶的活性進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的回收率。孫媛媛等[53]通過(guò)單因素試驗(yàn),確定了蛋白酶酶解螺旋藻的最佳工藝條件:酶解pH為8,酶解時(shí)間24 h,溫度100 ℃,此時(shí)蛋白回收率最高,為51.78%。

1.2.3 離子液體提取

離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子構(gòu)成的在室溫下呈液態(tài)的有機(jī)鹽,離子液體作為萃取溶劑相比于傳統(tǒng)有機(jī)揮發(fā)性溶劑的主要優(yōu)點(diǎn)是揮發(fā)性低,可重復(fù)使用,化學(xué)穩(wěn)定性好。

離子液體有良好的溶解性能,會(huì)與蛋白質(zhì)形成多種強(qiáng)相互作用,特別是氫鍵,使蛋白質(zhì)在離子液體中的溶解度升高,從而增加蛋白質(zhì)提取率(圖1-e)。然而該方法離子液體成本高,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),因此有必要同其他預(yù)處理方式結(jié)合如球磨、超聲波輔助提取、高壓均質(zhì)等,來(lái)降低提取時(shí)間和成本。MOTLAGH等[54]評(píng)估了6種離子液體對(duì)微擬球藻蛋白質(zhì)提取的影響,與蒸餾水處理的對(duì)照組相比,添加離子液體能顯著提高蛋白質(zhì)的提取率。其中[Ch][Ac]效果最佳。為了解決離子液體成本高的問(wèn)題,該研究在水介質(zhì)中使用離子液體,同時(shí)增加了微波輔助提取,在最優(yōu)條件下獲得的蛋白質(zhì)提取率為65.06%。RODRIGUES等[55]在試驗(yàn)中采用合成的質(zhì)子離子液體對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行提取,其提取率比采用磷酸鈉緩沖液和非質(zhì)子離子液體更高,加以超聲波輔助提取,在2-HEAA+2-HEAF為溶劑,萃取頻率為25 kHz,pH為6.5,溶劑與生物量比為7.93 mg/L,提取時(shí)間為30 min時(shí),得率最佳。LEE等[56]采用超聲輔助離子液體提取小球藻蛋白質(zhì),并探索了離子液體濃度、超聲時(shí)間、超聲功率和藻漿濃度對(duì)得率的影響,在最優(yōu)條件下蛋白質(zhì)提取率為25.3%,釋放率達(dá)到95%。

離子液體的回收再利用也是降低成本的方法之一。并且在FUJITA等[57]的研究中已證實(shí)回收再利用的離子液體對(duì)細(xì)胞的破碎能力不會(huì)下降。然而在RODRIGUES等[55]的研究中,采用(NH4)2SO4沉淀回收離子液體,回收后的離子液體再用于藻膽蛋白提取時(shí),藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的得率受到了很大的影響,而對(duì)藻紅蛋白幾乎無(wú)影響,原因是由于回收溶劑中殘留的(NH4)2SO4會(huì)使藻藍(lán)蛋白沉淀,而只有在(NH4)2SO4飽和度高于80%時(shí)藻紅蛋白才會(huì)受到影響[55]。因此,如何回收離子液體溶劑是亟待解決的問(wèn)題。

2 新型微藻蛋白提取方法

除傳統(tǒng)方法之外,超臨界流體法、微射流處理法和陽(yáng)離子聚合物涂膜法等新型細(xì)胞破碎方法具有環(huán)保、高效等優(yōu)點(diǎn),已被用于微藻油脂、葉黃素、β-胡蘿卜素及其他生物活性成分的提取,在微藻蛋白提取方面也具有很大潛力。

2.1 超臨界流體法

超臨界流體是指流體處于超臨界狀態(tài),此時(shí)流體具有類(lèi)似于氣體的黏度和擴(kuò)散率,以及類(lèi)似于液體的密度和溶解性[58]。CO2是一種惰性、無(wú)毒、環(huán)保、價(jià)廉的流體,其臨界溫度(31.3 ℃)和臨界壓力(72.9 bar)都較低,被廣泛用作超臨界流體[59]。超臨界流體法破碎細(xì)胞是利用CO2等通過(guò)高壓將其滲透入細(xì)胞內(nèi),再瞬時(shí)降壓,利用細(xì)胞內(nèi)外的突變壓差使細(xì)胞發(fā)生破裂[18]。由于在降壓過(guò)程中,流體體積增大,溫度降低,因此避免了類(lèi)似于超聲、球磨等傳統(tǒng)細(xì)胞破碎技術(shù)的局部過(guò)熱現(xiàn)象,有效保護(hù)了胞內(nèi)化合物的穩(wěn)定。

在微藻生物分子的提取中,超臨界流體法由于其萃取時(shí)間短、萃取效率高、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于多不飽和脂肪酸[60]、維生素[61]等的回收。但對(duì)于極性化合物的提取,由于CO2的極性較低,提取率往往不理想,可以使用少量的CO2極性添加劑,例如,乙醇、正己烷等。在CHRONOPOULOU等[61]的研究中,用檸檬烯和甲醇作為超臨界流體CO2共溶劑,從斜生柵藻中提取類(lèi)胡蘿卜素,可以提取到16.14%角黃素和1.25%葉黃素,而在僅使用CO2的條件下無(wú)法獲得如此高的提取率。

在超臨界流體法提取胞內(nèi)活性物質(zhì)過(guò)程中,溫度、壓力、處理時(shí)間、流體與生物量的比值以及共溶劑的增加等,均會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的提取率。LORENZEN等[62]研究發(fā)現(xiàn),在壓力12 MPa、20 ℃和CO2與生物量的比值為100時(shí),可從柵藻中獲得高達(dá)92%油脂回收率。MORADI-KHEIBARI等[63]研究了不同萃取時(shí)間、壓力、增加乙醇對(duì)小球藻脂質(zhì)提取率的影響,結(jié)果表明,隨著萃取壓力的增加、萃取時(shí)間的延長(zhǎng)和乙醇的增加,總脂質(zhì)得率增加。然而,乙醇和溫度的升高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性并轉(zhuǎn)化為二級(jí)結(jié)構(gòu),這對(duì)于蛋白質(zhì)的提取不利。因此利用超臨界流體法提取微藻蛋白時(shí),溫和的萃取條件或有利于蛋白質(zhì)的提取。

研究已證實(shí)了超臨界流體法從微藻中回收活性物質(zhì)的有效性,但較低的提取率需要進(jìn)一步考慮操作條件的優(yōu)化以及與其他方法的聯(lián)合使用。此外,該法應(yīng)用于微藻蛋白質(zhì)的提取還需進(jìn)一步探究。由于高成本和規(guī)?；瘑?wèn)題,超臨界流體法的商業(yè)化應(yīng)用仍有待發(fā)展。

2.2 微射流處理法

微射流處理是一種新型的均質(zhì)技術(shù),與傳統(tǒng)高壓均質(zhì)不同,該技術(shù)綜合了水射流技術(shù)、沖擊流技術(shù)和傳統(tǒng)高壓均質(zhì)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),在微射流處理過(guò)程中,生物質(zhì)受到強(qiáng)剪切、湍流、高速?zèng)_擊、高頻振動(dòng)、瞬時(shí)降壓和流體動(dòng)力空化力的綜合作用從而發(fā)生變化[64]。微射流處理方法采用微射流器,利用高壓和細(xì)胞懸浮液在幾何形狀的相互作用腔內(nèi)碰撞實(shí)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破裂。在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)時(shí),常常選用相互作用腔為Z型結(jié)構(gòu)的微射流器[65]。

微射流處理技術(shù)通過(guò)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、減小顆粒尺寸、增加比表面積、提高液體物質(zhì)的擴(kuò)散速率等途徑增加了多糖、多酚和黃酮類(lèi)等化合物的釋放,提高了提取效率,被認(rèn)為是一種有效的提取胞內(nèi)活性物質(zhì)的方法[66-67]。CHA等[68]在模擬消化模型中,采用微射流處理法增加小球藻中類(lèi)胡蘿卜素的生物可及性,在20 000 psi的高壓下進(jìn)行微射流處理后,小球藻的平均粒徑從2 463 nm顯著降低至361 nm,可釋放32.60%玉米黃素和18.19%β-胡蘿卜素,與未處理組相比,類(lèi)胡蘿卜素的生物可及性增加了10倍以上。該結(jié)果證實(shí)了微射流處理技術(shù)能夠有效地破壞小球藻細(xì)胞,有利于胞內(nèi)化合物的釋放。XIA等[69]利用微射流技術(shù)從碎米中提取蛋白質(zhì),加以酶輔助提取,可獲得81.87%的蛋白回收率,且純度高達(dá)87.89%,同時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明酶輔助微射流處理技術(shù)是一種溫和有效的蛋白質(zhì)提取方法,但目前尚未在微藻蛋白質(zhì)的提取中應(yīng)用,為后續(xù)提取微藻蛋白工藝研究提供了新的方向。

微射流的處理效率受相互作用腔流道設(shè)計(jì)、處理壓力、循環(huán)次數(shù)、溫度等的影響,可通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)有效地破裂細(xì)胞。STUPAK等[70]優(yōu)化了微射流處理提取反硝化奈瑟氏菌胞內(nèi)產(chǎn)物的工藝,對(duì)預(yù)處理時(shí)間、pH、細(xì)胞濃度等進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在最佳條件下,細(xì)胞破壞率提高了2倍,胞內(nèi)化合物產(chǎn)量提高了26%,1 g細(xì)胞可產(chǎn)生(113.2±8.2) mg蛋白質(zhì)、(12.1±0.7) mg核酸以及(21.0±1.2) mg多糖等其他化合物。結(jié)果表明,將已知的預(yù)處理方法與破碎方法進(jìn)行優(yōu)化組合,可顯著提高細(xì)胞破碎效率。

微射流處理技術(shù)耗時(shí)短,提取效率高,條件溫和,不會(huì)造成生物活性物質(zhì)的降解,同時(shí)不引入外源化學(xué)物質(zhì),可連續(xù)操作,安全環(huán)保,在細(xì)胞破碎方面有良好的前景。但該法設(shè)備成本高,處理量小,耗能高,目前較難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。此外,微射流處理技術(shù)在微藻蛋白提取方面的應(yīng)用仍需探究,與酶法、預(yù)處理等其他方法聯(lián)合使用或是一種有效提高產(chǎn)率、降低成本與能耗的途徑。

2.3 陽(yáng)離子聚合物涂膜法

陽(yáng)離子聚合物涂膜法是一種新型細(xì)胞破碎技術(shù),通過(guò)擾亂細(xì)胞的局部靜電平衡使細(xì)胞發(fā)生破裂,該法溫和高效,且聚合物可重復(fù)利用降低成本,在破裂微藻復(fù)雜的細(xì)胞壁方面已有應(yīng)用。YOO等[71]使用涂有陽(yáng)離子聚合物的功能膜,直接從濕微藻中提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)。使用一種涂有帶正電荷的含叔胺聚合物的膜,擾亂微藻磷脂雙分子層的靜電平衡,誘導(dǎo)帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層發(fā)生局部重排,引起細(xì)胞破裂,細(xì)胞破碎率達(dá)(25.6±2.2)%。陽(yáng)離子聚合物涂膜法與其他方法聯(lián)合使用,也是一種提高細(xì)胞破壁率的有效途徑。在ZHENG等[72]的研究中,使用熱聚合物協(xié)助酶裂解小球藻細(xì)胞壁,細(xì)胞破碎率高達(dá)68%。

GEJJI等[73]采用羧基功能化纖維素顆粒和雞蛋清蛋白模擬藻細(xì)胞和藻蛋白,在不同pH條件下利用聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly diallyl dimethyl ammonium chloride,polyDADMAC)在水-有機(jī)溶劑兩相體系中,從藻細(xì)胞模型中選擇性分離蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在水-己烷兩相體系中,當(dāng)pH值為4.5(接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn))時(shí),約75%的蛋白質(zhì)被分離到水相中。此外,GEJJI等[74]還成功地利用polyDADMAC從小球藻濕藻中分理出蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和色素。研究發(fā)現(xiàn),懸浮粒子的等電點(diǎn)是決定各組分分離效率的關(guān)鍵,當(dāng)水-正己烷體系的pH調(diào)整到接近大多數(shù)微藻蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)4時(shí),可使80%的蛋白質(zhì)保留在水相中。隨著pH值接近堿度,微藻細(xì)胞碎片上的負(fù)電荷增加,使得95%的小球藻細(xì)胞碎片遷移到己烷相,同時(shí)脂質(zhì)也被提取到正己烷相。該過(guò)程證實(shí)了polyDADMAC通過(guò)水-有機(jī)相從微藻中分離化合物的能力,說(shuō)明了陽(yáng)離子聚合物從微藻細(xì)胞碎片中選擇性分離微藻蛋白質(zhì)是一種有前景的技術(shù),但目前相關(guān)研究不足,仍需進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論與展望

微藻蛋白質(zhì)是一種新型蛋白質(zhì)資源,且它們具有營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)機(jī)體健康等特性,在食品、化妝品、醫(yī)療保健方面有諸多應(yīng)用。此外,微藻養(yǎng)殖周期短,不占用土地資源,同時(shí)微藻光合作用吸收CO2,對(duì)環(huán)境十分友好。因此,微藻的開(kāi)發(fā)利用越來(lái)越深入。獲取微藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法就是要打破細(xì)胞屏障,破壞微藻細(xì)胞壁。在破壁方法選擇時(shí),要綜合考慮到蛋白質(zhì)回收率、產(chǎn)品純度、能量消耗以及活性物質(zhì)在提取過(guò)程中不遭到破壞等問(wèn)題。本文介紹的微藻蛋白提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)(表2),但物理方法、化學(xué)方法、生物法之間的聯(lián)合使用可能會(huì)提高破壁效率、產(chǎn)品得率和蛋白質(zhì)純度,降低能耗,減少成本,如超聲輔助有機(jī)溶劑萃取,珠磨聯(lián)合酶解等。隨著微藻生物的開(kāi)發(fā)利用,微藻蛋白質(zhì)的提取有望取得更大突破。