陳堯貴,張 熠,賈勝軍,程振濤
(1.六盤水市鐘山區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中心,貴州鐘山 553000;2.六盤水市動物疫病預防控制中心,貴州六盤水 553000;3.貴州大學,貴州貴陽 550025)
沙門氏菌(Salmonella)屬于腸桿菌科、沙門氏菌屬,為革蘭氏陰性菌,能引起沙門氏菌?。⊿almonellosis)。菌體呈卵圓形或者桿狀,無莢膜,無芽孢,單個散在或者成對排列。目前世界上已經(jīng)報道的沙門氏菌血清型有2610 種以上,我國已報道292 個不同的血清型[1-3]。導致雞群發(fā)病的主要是雞白痢沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌以及腸炎沙門氏菌[4,5]。目前,由于抗菌藥物的不合理使用,導致沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性越來越快,耐藥譜越來越廣,防控越來越難。
目前已發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌有將近1000 種(或菌株),菌體大小為(0.5~1)μm×(1~3)μm,大多有鞭毛,沙門氏菌在普通培養(yǎng)基中即可生長,其DNA 中的堿基G+C 含量為50%~53%。該屬細菌對高溫敏感,在60℃下15min 即可滅活,在水中能存活2~3 周,對日光、干燥、腐敗等不利因素有較強的抵抗力,但對消毒藥物比較敏感。按照沙門氏菌的抗原成分,可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組[6]。沙門氏菌抗原結構非常復雜,大致可分為菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原以及表面(Vi)抗原3 種類型[7]。
病雞與帶菌雞是本病的傳染源。雞沙門氏菌廣泛分布于環(huán)境中,對不利因素有一定抵抗力,在圈舍環(huán)境中、蛋殼上、干燥的糞便上分別可存活幾十日、3 個月以上、3 年以上。經(jīng)卵傳播導致禽感染的原因可能是排卵污染或排卵之前的卵泡中已經(jīng)存在沙門氏菌。帶菌種雞所產(chǎn)種蛋帶菌率達20%~30%,孵化率低,出殼后雛雞帶菌,育雛死亡率高,存活下來的也成為帶菌雞,如將帶菌雞作為種雞,則在雞場造成沙門氏菌感染的惡性循環(huán),很難根除[6]。沙門氏菌有大量的寄生宿主,如蠅、蛆、蟑螂等昆蟲和無脊椎動物,貯存宿主可通過污染環(huán)境等方式引起沙門氏菌在禽群中傳播。老鼠也是禽感染沙門氏菌的重要傳播媒介之一,感染沙門氏菌的野鳥排泄物也可引起傳播[8]。
沙門氏菌主要經(jīng)消化道感染,帶病或帶菌動物交配可形成傳染。沙門氏菌可潛藏在消化道、淋巴組織和膽囊內,帶菌動物可能不表現(xiàn)出臨床癥狀,當動物因不良因素引起抵抗力下降,則可引發(fā)內源性感染,內源性感染后病菌毒力可能更強,感染進一步擴大。雞沙門氏菌病發(fā)病不分季節(jié),水平傳播和垂直傳播是2 種主要的傳播方式。雞白痢和雞傷寒沙門氏菌在禽群中可通過污染的飼料、飲水、墊料、糞便以及啄肛、啄食帶菌蛋等途徑傳播[8,9]。雞傷寒沙門氏菌高毒力菌株不容易發(fā)生持續(xù)感染,主要傳播方式是水平傳播。禽副傷寒沙門氏菌可通過口腔、眼睛、氣管、臍部、泄殖腔、氣霧等途徑感染禽[10]。
在自然條件下,沙門氏菌也可感染火雞、珍珠雞、鴿子、野雞、鵪鶉、鸚鵡、孔雀、麻雀、斑鳩等,但流行主要限于雞和火雞,尤其雞對本病最易感[11,12]。沙門氏菌感染對年齡無選擇性,但抵抗力較弱的動物較易感。雞是沙門氏菌的天然宿主,不同品種的雞對雞沙門氏菌的易感性也存在著明顯差異[13],輕型雞比重型雞易感。
雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起的一種傳染病,由于雞白痢沙門氏菌廣泛存在于環(huán)境中,導致雞白痢在農村散養(yǎng)和中小規(guī)模養(yǎng)殖場中比較常見,嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
3.1.1 臨床癥狀
雞白痢病雛表現(xiàn)精神沉郁,反應遲鈍,厭食,怕冷,尖叫,翅下垂,拉灰白色或帶綠色的稀糞,沾染肛門周圍的絨毛,糞便干結后成石灰樣硬塊,常常會將肛門糊死,影響排糞,肺型白痢出現(xiàn)張口呼吸,最后呼吸困難,心力衰竭而亡,某些雞可出現(xiàn)眼盲或關節(jié)炎、跋行等癥狀。20 日齡以上的病雞極少死亡,耐過雞生長發(fā)育不良,成為慢性患者或帶菌者。青年雞發(fā)病多半受應激因素影響,突然出現(xiàn)零星死亡,雞群中有幾只雞精神沉郁、食欲下降、腹瀉,雞群整體上沒有異常。成年雞感染后表現(xiàn)為無癥狀或癥狀輕微,一般呈慢性經(jīng)過,臨床表現(xiàn)為精神萎頓,冠髯蒼白、垂腹,眼結膜蒼白,食欲減退,渴飲增加,腹瀉,逐漸衰弱甚至死亡[6-8,14,15]。
3.1.2 病理變化
雞白痢病雛雞臍環(huán)愈合不良,卵黃變性且吸收不良。肝、脾、腎臟腫大,表面上壞死灶呈“雪花”樣,腎臟充血或貧血,肺部壞死結節(jié)呈黃白色,心肌肉芽腫呈灰白色,腎小管和輸尿管充滿尿酸鹽呈花斑狀,盲腸膨大有干酪樣物阻塞,“糊肛”雞可見直腸雞糞。青年雞的病理變化與雛雞相似,其肝臟腫大至正常的數(shù)倍,顏色為土黃色,質地脆弱易碎,一觸即破,有散在或較密集的小紅點或小白點,脾臟腫大,心臟嚴重變形、變圓、壞死,心包增厚,心包擴張,心臟形成肉芽腫,腸道呈卡他性炎癥,盲腸、直腸形成粟粒大小的壞死結節(jié)。成雞剖檢病變主要為卵巢炎,卵子變形、變色,輸卵管炎,卵黃性腹膜炎,心包炎,成年公雞睪丸炎或睪丸極度萎縮,輸精管管腔增大,充滿稠密的均質滲出物等[6-8,14,15]。
雞傷寒是由雞傷寒沙門氏菌引起的一種急性或者慢性敗血性傳染病。
3.2.1 臨床癥狀
雞傷寒臨床上表現(xiàn)為黃綠色腹瀉、肝臟腫大呈青銅色。最急性型病雞死亡迅速,常無明顯癥狀。急性型病雞不合群,精神萎頓,臥地不動,嗜睡,雞冠呈暗紅色,食欲廢絕,渴欲增加,腹瀉、排出淡黃色稀糞。慢性型病雞不同程度下痢,消瘦、貧血、產(chǎn)蛋減少或停止,少數(shù)死亡,多數(shù)康復后成為帶菌雞[7,14,15]。
3.2.2 病理變化
病理解剖雞傷寒病雛雞或病死雛雞,其肝臟上有大量壞死病灶,有的病雛雞肝臟呈銅綠色,病青年雞和成雞剖檢可見肝臟充血、腫大,因染有膽汁呈青銅色或綠色,質地較脆,表面粟粒般大小的壞死病灶呈淺黃色或灰白色,膽囊腫大,膽汁充盈,脾臟與腎臟腫大,表面有細小的壞死病灶,心包炎、積液、有時發(fā)生粘連,卵巢和卵泡變形、變色、變性,卵泡破裂時引起嚴重的腹膜炎,肺臟和肌胃可見灰白色細小的壞死病灶,腸道可見卡他性腸炎,盲腸有泥土樣干酪栓塞物,大腸粘膜有出血斑,腸管間發(fā)生粘連,成雞的卵泡及腹腔病變與成雞雞白痢相似[6-8,14,15]。
雞副傷寒是一種敗血性傳染病,由其他有鞭毛能運動的沙門氏菌引起,雛雞一般在出殼后感染數(shù)天發(fā)病死亡。
3.3.1 臨床癥狀
雞副傷寒病雛精神沉郁、垂頭、閉目、垂翅、羽毛蓬松而凌亂、怕冷、食欲下降、飲水增加、水樣下痢、肛門粘結糞便,有時出現(xiàn)結膜炎、鼻竇炎。成雞一般不表現(xiàn)癥狀[7,14-16]。
3.3.2 病理變化
最急性感染的病死雛雞可能無明顯病理變化,病程稍長的雞副傷寒病雛可見消瘦、脫水、卵黃凝固,肝臟充血、腫大,呈古銅色,點狀或條紋狀出血,壞死病灶呈灰白色,脾臟腫大,表面有點狀壞死,膽囊內膽汁充盈,肺壞死,肌肉感染處可見肌肉變性、壞死。最急性的成雞表現(xiàn)為肝臟和脾臟腫大,出血,心包炎,氣囊炎,出血性或壞死性腸炎,盲腸內形成“栓子樣病理變化”。此外,成雞也有卵巢炎、腹膜炎病理變化[6-8,14-16]。
隨著人們對食品安全越來越重視,沙門氏菌檢測也越來越嚴格。傳統(tǒng)檢測沙門氏菌的方法有細菌分離培養(yǎng)和聚合酶鏈式反應(PCR)等,隨著科技進步,不斷出現(xiàn)新的沙門氏菌檢測方法,如可見/ 近紅外高光譜顯微鏡成像檢測方法、氧化石墨烯-二氧化鈦納米復合電化學適體傳感器法等。
傳統(tǒng)檢查方法是基于沙門氏菌特點,利用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基將樣品按照預增菌、增菌和選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)等步驟進行檢測。
免疫分析技術(ELISA)包括非標記免疫分析技術和標記的免疫分析技術,目前檢測沙門氏菌主要采用標記的免疫技術,包括熒光免疫技術、放射免疫技術、酶免疫技術。
實時聚合酶鏈式反應(PCR)是對體外樣品的DNA 進行特異性擴增,根據(jù)擴增的結果判斷是否是沙門氏菌的一種有效方法,包括實時定量熒光PCR 法、多重PCR 法、反轉錄PCR 法、免疫PCR 法等。
Eady 等[17]將肉雞身體洗凈后涂在沙門氏菌選擇性瓊脂上,從平板上挑選菌落,用RT-PCR作為確認試驗來驗證平板結果,同時從相同的菌落收集高光譜顯微鏡成像系統(tǒng)(HMI),從100x 物鏡采集的人機界面中提取450~800nm 范圍內的細胞光譜特征,用二次判別分析對沙門氏菌陽性或陰性細胞進行分類。
Muniand 等[18]通過靜電作用將一種無標記適配子固定在rGO-TiO2納米復合基質上,用電分析方法評價了電極表面電導率的變化,DNA 適配子吸附在rGO-TiO2表面,與電極界面的細菌細胞結合,形成物理屏障,抑制電子傳遞,這種相互作用降低了電極的DPV 信號,與細菌細胞濃度的降低成正比,優(yōu)化后的適配傳感器靈敏度高,檢測范圍寬(108~101·CFU/mL),檢測下限為101CFU/mL,對沙門氏菌有良好的選擇性,這種rGO-TiO2適配傳感器是一個很好的生物傳感平臺,為微量致病菌的檢測提供了可靠、快速和靈敏的替代方案。
由于雞白喉沙門氏菌與雞沙門氏菌引起的雞傷寒很難區(qū)分,Shen 等[19]提出了一種新的單核苷酸多態(tài)性檢測策略,稱為環(huán)引物探針引入的環(huán)介導等溫擴增(LP-LAMP),用于檢測白喉沙門氏菌,在原有引物的基礎上,作者針對rfbS 基因序列的第237 位核苷酸設計了一種新的帶有核苷酸插入的改進的環(huán)引物探針,其中只有當探針完全互補時,酶核糖核酸酶H2 的活性才會被激活,從而導致猝滅部分的水解釋放,從而產(chǎn)生放大的信號。
研究表明,抗生素的大量使用和濫用,一方面造成沙門氏菌對抗菌類藥物的耐藥性和交叉耐藥情況的產(chǎn)生,另一方面可能會引起感染動物的病情和病原菌的排毒時間延長[20]。
目前,沙門氏菌對氨節(jié)西林、四環(huán)素、喹諾酮類的耐藥性非常嚴重,其中,對四環(huán)素、磺胺類藥的耐藥性幾乎達到100%[21,22]。多項研究表明,禽源沙門氏菌對喹諾酮類藥物的耐藥性在逐漸增強,并且存在著多重和交叉耐藥性[22-24]。陳玲等[25]對2000—2008 年分離到的沙門氏菌進行耐藥表型檢測,發(fā)現(xiàn)分離株對萘啶酸耐藥率高達83.74%。丁孟建等[26]研究發(fā)現(xiàn),雞源腸炎沙門氏菌對阿莫西林、氧氣沙星等常用抗生素耐藥率高。趙玉林等[27]研究發(fā)現(xiàn),分離到的沙門氏菌菌株至少對10 種以上抗生素存在十分嚴重的多重耐藥性。杜雄偉等[28]研究發(fā)現(xiàn),沙門氏菌對硫酸慶大霉素等藥物的耐藥性很高,共產(chǎn)生10 種耐藥譜,其中對硫酸慶大霉素、鹽酸諾氟沙星、氟苯尼考的耐藥率依次為73.3%,60%、53.3%。張莒等[29]研究結果顯示,藏雞和彭縣黃雞中分離到的所有沙門氏菌菌株均表現(xiàn)出多重耐藥,分離菌株對青霉素、吉他霉素和林可霉素的耐藥率高達100%,對新霉素和鏈霉素的耐藥率均在70%以上。陸彥等[30]研究發(fā)現(xiàn),雞源沙門氏菌對磺胺甲惡唑和萘啶酸、氨芐西林、四環(huán)素耐藥率分別為100%、68.54%、66.85%。鄒明等[31]研究發(fā)現(xiàn),雞源沙門氏菌對多粘菌素E、磺胺異噁唑、氨芐西林、大觀霉素的耐藥性依次為41.82%、31.82%、29.09%、18.18%。相關檢測數(shù)據(jù)表明,沙門氏菌屬的多重耐藥率已從20 世紀90 年代的20%~30%增加到了本世紀的70%[32],高耐藥率和多重耐藥性阻礙了一些傳染性疾病的預防和治療,對人類的健康造成了潛在性的威脅,隨著時間的推移,其耐藥率仍將大幅度上升[22,33]。
細菌對抗生素產(chǎn)生的耐藥性分為先天性耐藥和后天性耐藥[14,34]。先天性耐藥也稱固有性耐藥,由基因決定并會遺傳。后天性耐藥也稱獲得性耐藥,因細菌受到藥物反復刺激后改變自身特性而產(chǎn)生的,會導致細菌對藥物的敏感性下降,耐受性增加,甚至完全耐藥[14,22,35]。沙門氏菌耐藥主要來自于基因突變、細菌主動外排作用、滅活酶及鈍化酶的產(chǎn)生、可移動基因元件介導和生物膜的形成,而耐藥水平是由這些機制相互作用來共同決定的[14,22,34]常用于革蘭氏陰性腸桿菌科的治療和抑制抗菌藥物主要有β-內酰胺類、磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類和氨基糖類等[36]。
5.2.1 β-內酰胺類藥物
β-內酰胺類藥物是一類分子結構中具有β-內酰胺環(huán)的抗菌藥物??咕鷻C理主要是通過抑制細胞壁粘肽合成酶造成細胞壁缺損,導致菌體膨脹破裂。細菌(尤其是革蘭氏陰性菌)對β-內酰胺類藥物耐藥機制,最常見的就是抗菌藥物β-內酰胺環(huán)被細菌產(chǎn)生的β-內酰胺酶通過水解或非水解方式破壞,從而使抗菌藥物失活,β-內酰胺酶主要是由染色體上的耐藥基因和質粒上的耐藥基因介導[37]。迄今為止,在沙門氏菌屬中發(fā)現(xiàn)的編碼β-內酰胺酶的基因主要包括TEM、PSE、SHV、OXA、CTX、CMY、DHA 等[38]。
5.2.2 磺胺類藥物
磺胺類藥物是指具有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱,其主要通過二氫葉酸合成酶被一種新型酶所代替而產(chǎn)生耐藥性,這種酶對磺胺類藥物親和力更低[39]。對磺胺類藥物具有抗性的二氫葉酸合成酶的基因有Sul1、Sul2 和Sul3,若能檢測到這3 個耐藥基因,就能夠從分子水平上反映出細菌對黃胺類藥物的耐藥情況。
5.2.3 四環(huán)素類藥物
四環(huán)素類藥物是一種廣譜抑菌藥物,作用機理是通過干擾tRNA 和核糖體的結合來抑制細菌蛋白質合成,從而抑制細菌的生長繁殖產(chǎn)生抑菌作用,其耐藥性的產(chǎn)生主要是由于tet 基因編碼形成跨膜束片段對抗菌藥物存在外輸作用[40]。不同的tet 基因在世界各地廣泛存在,不同血清型中tet 基因分布也不同,且存在地域差異,迄今為止已發(fā)現(xiàn)并測序了40 多種四環(huán)素的耐藥基因,包括20 多種主動外排基因、10 多種核糖體保護基因、3 種滅活酶基因、1 種未明機制的耐藥基因[41]。
5.2.4 喹諾酮類藥物
喹諾酮類藥物是一類人工合成抗菌藥物,細菌對其耐藥性主要通過細菌染色體的基因突變、細胞膜通透性改變以及質粒介導喹諾酮耐藥而產(chǎn)生[33]。喹諾酮類和氟喹諾酮類抗菌素通過對DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的結合和抑制作用,使細菌對喹諾酮的親和力降低,從而產(chǎn)生耐藥性。DNA 旋轉酶是由A 和B 亞基組成的四聚體蛋白,其編碼基因分別為gyrA、gyrB 和parC、parE,其中任何一個基因點的突變都會造成細菌耐藥的產(chǎn)生。
5.2.5 氨基糖苷類藥物
氨基糖苷類藥物分子結構由2 個或3 個氨基糖分子和非糖部分的苷元通過氧橋連接而成,抗菌機理是其作用于核糖體抑制蛋白合成,造成細胞膜缺損。耐藥性主要是通過細菌的主動外排、修飾酶的純化作用、細胞內外電位差的改變和靶位點的改變等機制來產(chǎn)生[42]。不同細菌和菌株對每種酶存在不同的耐受現(xiàn)象,修飾酶先修飾抗菌藥物的氨基或羥基,再緊密結合核糖體來發(fā)揮抗菌作用。
沙門氏菌廣泛存在于自然界中,絕大多數(shù)具有致病性,該細菌在普通培養(yǎng)基上即可生長,對高溫敏感。沙門氏菌感染對年齡無選擇性,主要通過消化道傳播,帶病與帶菌動物是主要傳染源,雞沙門氏菌病主要有雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒。沙門氏菌檢測有傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)分離鑒定,也有基于現(xiàn)代科技的免疫分析技術、聚合酶鏈反應(PCR)等方法,由于抗生素的大量使用,沙門氏菌的耐藥性非常嚴重,科學用藥成為沙門氏菌防治的關鍵。