文 潔,朱根福

輕微中樞神經(jīng)細胞損傷大多由于外傷,如車禍、體育運動等造成,表現(xiàn)為輕度腦、脊髓挫傷并伴隨不同程度的細胞變性和凋亡,影響病人的認知功能和運動協(xié)調能力[1-3]。神經(jīng)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本結構和功能單位之一,作為高度極化的終末分化細胞,神經(jīng)細胞再生能力較差,一旦受到損傷,很難得到修復和補充,因此,臨床上治療中樞神經(jīng)細胞損傷的手段非常有限[4]。歸根湯名源于《道德經(jīng)》“歸根曰靜”之意,藥方來源于《三因極一病證方論》中的人參養(yǎng)榮湯,是治療失眠抑郁、溫陽補腎的中藥方劑。本研究觀察歸根湯對輕微腦中樞神經(jīng)損傷大鼠的干預,檢測大鼠海馬組織細胞凋亡情況,研究其對抑制中樞神經(jīng)細胞模型大鼠海馬組織損傷及相關蛋白和基因表達水平的影響,以期為歸根湯在治療輕微中樞神經(jīng)細胞損傷方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物、試劑及儀器

歸根湯藥方組方:黃芪、肉桂、白芍、當歸、黨參、白術、干姜、遠志、川芎、炙甘草、生龍齒;微晶纖維素(廣州天盛化工有限公司,貨號2020-1);枸櫞酸三乙酯(阿拉丁生化科技股份有限公司,批號T106153);玉米淀粉(山東蘊涵精細化工有限公司,批號05612);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);EUDRAGIT L30D-55(上海昌為醫(yī)藥輔料技術有限公司);海藻酸鈉(阿拉丁生化科技股份有限公司,批號S100128);硬脂酸鎂(阿拉丁生化科技股份有限公司,批號M110510)。流式細胞術雙染色凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit,CA1020-20T,Solarbio)。流式分析儀器(BD Calibur,美國BD公司);甲醇(色譜純,北京化學試劑公司)。

1.2 動物造模與分組、給藥

健康無特定病原體(SPF)級Sprague Dawley(SD)大鼠30只,6周齡,體質量120～150 g,購自北京維通利華實驗動物有限公司,合格證號:SCXK(京)2012-0001;實驗設計和對動物的處置方法符合3R原則[5],并經(jīng)過廣州中醫(yī)藥大學實驗動物管理委員會批準。大鼠隨機分為空白對照組、損傷模型組和歸根湯組,每組10只。輕微腦損傷模型參考文獻[6]方法制備?？瞻讓φ战M大鼠則不做任何處理。造模結束后空白對照組和損傷模型組大鼠給予同等劑量生理鹽水,歸根湯組給予中藥湯劑歸根湯,按每千克體質量大鼠的給藥量為人的6.3倍計算,每天灌胃1次,共給藥2周。

1.3 標本與檢測指標

標本取樣及樣品處理:給藥結束后,麻醉并安樂死所有大鼠,手術取出大鼠大腦組織。每組隨機選取5只大鼠的腦組織進行裂解,獲得單細胞懸液。麻醉藥物采用1.2%的Avertin溶液,腹腔注射0.2 mL/10 g體質量。大鼠安樂死采用二氧化碳窒息法。流式分析:所得單細胞懸液通過Annexin V/PI雙染色法進行流式分析,獲得造模前后、給藥前后組織凋亡細胞的情況。逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析每組剩余5只大鼠,分離海馬組織并于-80 ℃冷凍保存用于通過qRT-PCR分析細胞自噬相關基因表達水平的變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 雙染色法檢測大鼠海馬組織細胞凋亡情況

細胞壞死與空白對照組比較,損傷模型組大鼠的大腦海馬組織細胞凋亡數(shù)量增加,由(0.418±0.019)%增加到(0.809±0.009)%,提示模型建立后大鼠的海馬組織受到了一定的損傷,初步判斷建模成功。歸根湯組給藥后,與損傷模型組比較,細胞壞死數(shù)量降低到(0.611±0.014)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。無論是早、晚期的細胞凋亡,還是活細胞總數(shù),經(jīng)過歸根湯治療后的動物模型都有恢復到正常水平的趨勢。詳見圖1、表1。

表1 雙染色法檢測大鼠海馬組織細胞凋亡情況 單位:%

圖1 流式Annexin V/PI雙染色法檢測大鼠海馬組織細胞凋亡情況

2.2 大鼠海馬組織自噬蛋白表達變化

與損傷模型組比較,歸根湯組大鼠的海馬組織相關蛋白表達水平變化,其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號蛋白降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而自噬標志物(LC3)和自噬相關蛋白(Beclin)蛋白表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。歸根湯給藥后細胞自噬能力得到提高,這對組織細胞修復具有重要意義。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織相關蛋白表達陽性指數(shù)比較

2.3 qRT-PCR檢測大鼠海馬組織自噬相關基因的mRNA表達水平

為了進一步評估大鼠海馬組織自噬水平變化,通過qRT-PCR檢測自噬相關基因的mRNA表達水平的變化,與損傷模型組比較,歸根湯組的LC3和Beclin基因相對表達水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),mTOR基因相對表達水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,神經(jīng)細胞之間的聯(lián)系被破壞,導致細胞變性和死亡,損傷的軸突周圍的外源性生長抑制因子阻止細胞再生[6-7]。軸突損傷是一種急性神經(jīng)元應激,可觸發(fā)軸突和細胞體的劇烈反應,包括鈣內流、軸突膜封閉、損傷信號轉導和轉錄改變[8]。中樞神經(jīng)的再生能力較低,受到損傷時,神經(jīng)功能較難恢復。現(xiàn)西醫(yī)治療多應用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,雖然可促進軸突的再生和神經(jīng)功能的恢復,但存在半衰期短、不能透過血腦屏障等問題[9]。

中醫(yī)學認為,腎主志,生髓通于腦。輕微神經(jīng)損傷,腎精不足,則不能生發(fā)氣血潤養(yǎng)肌肉而認知功能降低。歸根湯藥方組成為黃芪、肉桂、白芍、當歸、黨參、白術、干姜、遠志、川芎、炙甘草、生龍齒。方中黃芪大補元氣,肉桂引諸藥入心,遠志能通腎氣上達于心,全方補腎益精生髓,促進神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復。為了研究歸根湯對治療中樞神經(jīng)細胞損傷的潛在價值,評估其抑制神經(jīng)細胞損傷、凋亡的情況,本研究對輕微腦中樞神經(jīng)損傷模型的大鼠使用歸根湯干預,發(fā)現(xiàn)歸根湯可以有效抑制大鼠海馬組織細胞凋亡。

輕微大腦神經(jīng)損傷常伴隨著海馬組織細胞的壞死和凋亡,有研究報道機體的細胞自噬可以通過胞內成分的降解、病原體的清除阻止細胞進一步損傷[10],無論是阿爾茨海默病動物模型還是阿爾茨海默病病人,其腦組織自噬功能均存在障礙[11]。自噬是機體自身嚴格調控的過程,是細胞應激反應的核心組成部分[12]。它通過自噬體-溶酶體途徑降解功能失調的蛋白質、脂質和細胞器,在維持細胞內穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮保守作用[13]。近期報道顯示,自噬在損傷后軸突再生中發(fā)揮重要作用,LC3在急性脊髓損傷后表達上調[14],LC3是自噬小體形成的關鍵,也是自噬的標志。使用自噬誘導肽激活自噬可以通過限制神經(jīng)生長相關蛋白SCG10促進軸突再生[15]。mTOR信號通路可調節(jié)細胞增殖、生存、蛋白質合成、自噬和細胞代謝。此外,有報道稱mTOR可影響整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷神經(jīng)的再生,mTOR作為自噬的負調控因子之一,在激活自噬中具有門控作用[16]。另外,mTOR信號通路在歸根湯組的小鼠模型中明顯下調,這可能是因為歸根湯是通過mTOR信號通路起作用的,即通過下調mTOR促進神經(jīng)細胞自噬的上調,從而起到較好的組織細胞損傷的作用效果。

Bcl-2同源結構域蛋白抗體(Beclin 1)是自噬信號通路中重要的因子,參與缺氧缺血誘導的自噬發(fā)生,干擾Beclin1表達能夠降低缺氧缺血誘導的自噬[17]。因此,通過檢測分析自噬相關蛋白的水平,可以有效地評估神經(jīng)損傷的程度。研究報道,以溫陽補腎方劑可增加大鼠血漿和腦組織中的促紅細胞生成素(EPO)表達,從而降低大鼠大腦組織細胞的凋亡[18]。歸根湯堅陽道而補腎氣可益精健腦,對于治療中樞神經(jīng)損傷有一定的潛力。在本研究中,歸根湯組大鼠的大腦海馬組織細胞損傷數(shù)目明顯減少,活細胞與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,與損傷模型組大鼠比較,歸根湯組mTOR信號蛋白降低,LC3和Beclin蛋白表達升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示歸根湯對海馬組織損傷有較好的抑制作用。

藥物制劑能否抑制細胞凋亡是驗證其能否抑制神經(jīng)細胞損傷的重要影響因素之一[7,19]。細胞凋亡是細胞的基本特征之一,在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。FITC-Annexin V 與PI 匹配使用,可以有效分析給藥前后細胞的壞死、早期和晚期細胞凋亡。本實驗對比了正常大鼠、損傷模型大鼠及歸根湯治療后的損傷模型大鼠的海馬組織,結果發(fā)現(xiàn),歸根湯治療后的海馬組織細胞壞死、細胞早晚期凋亡與空白對照組差異有統(tǒng)計學意義,而損傷大鼠模型組海馬組織細胞凋亡明顯,細胞壞死增加,一定程度說明歸根湯對抑制神經(jīng)細胞損傷具有重要的潛力。

歸根湯可降低神經(jīng)損傷模型大鼠的海馬組織細胞損傷程度,其作用機制有可能是通過下調mTOR信號通路,促進損傷細胞的自噬而抑制神經(jīng)細胞損傷實現(xiàn)的。