尉建輝,劉虎軍

腦卒中是具有高致殘率、致死率的常見腦血管疾病,其中缺血性腦卒中占70%[1]。臨床采用物理或藥物溶栓、恢復(fù)血流供應(yīng)的方式治療缺血性腦卒中,但此過程常引發(fā)腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)。缺血/再灌注損傷發(fā)病機制復(fù)雜,其中神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷、細胞凋亡是導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的重要原因[2]。因此,抑制神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡有利于減輕缺血/再灌注損傷。桑白皮為桑科植物Morus alba L.的干燥根皮,富含多糖、黃酮類化合物、類固醇、揮發(fā)油等多種成分,可瀉肺平喘、利水消腫[3]。研究顯示,桑白皮多糖可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激,保護心肌細胞免受氧化損傷,其作用機制與調(diào)控circDLGAP4/miR-320軸有關(guān)[4]。但還少見桑白皮多糖影響腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)細胞損傷的相關(guān)報道。微小RNA(miR)-122是一種在缺血/再灌注損傷大鼠腦組織、缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中均表達增加的微小RNA,下調(diào)miR-122可通過促進DJ-1基因表達及增強磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路活性抑制神經(jīng)細胞凋亡,miR-122可作為減輕缺血/再灌注損傷的分子靶點[5]。本研究建立氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)誘導(dǎo)PC12細胞損傷模擬缺血/再灌注損傷,主要探究桑白皮多糖對缺血/再灌注損傷過程中細胞氧化損傷、凋亡的影響及其能否通過調(diào)控miR-122發(fā)揮作用,以期為缺血/再灌注損傷治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

PC12細胞購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司(批號:20190203);桑白皮多糖購自上海益本生物醫(yī)藥科技有限公司(純度:≥98%,批號:20190408);胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司(批號:20190511);乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:20181203,20181118,20181223);DMEM培養(yǎng)液、LipofectamineTM2000試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒,北京索萊寶科技有限公司(批號:20190107,20190121,20190123);一抗[活化的半胱天冬酶(Cleaved-Caspase)-3、Cleaved-Caspase-9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]、山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司(批號:20180911,20181224,20181217);逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)實驗相關(guān)試劑盒購自大連寶生物(批號:20190214);引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成;轉(zhuǎn)染物均購自廣州銳博生物。StepOnePlus的qRT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司;FACS Calibur流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特;電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和OGD/R處理

用完全培養(yǎng)液(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液)于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃、5%二氧化碳、95%空氣)中培養(yǎng)PC12細胞。參照文獻[6]方法建立OGD/R模型:先用無糖無血清DMEM培養(yǎng)液于缺氧培養(yǎng)箱(37 ℃、5%二氧化碳、95% N2)培養(yǎng)2 h,再換為完全培養(yǎng)液于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.2.2 細胞分組

于6孔板中(1.0×105個/孔)常規(guī)培養(yǎng)PC12細胞12 h后,分為對照(Control)組、OGD/R組、OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組。OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組分別用含0.1、0.2、0.4 μg/mL桑白皮多糖的培養(yǎng)液于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[4],再建立OGD/R模型;OGD/R組用不含桑白皮多糖的培養(yǎng)液于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,再建立OGD/R模型;Control組用不含桑白皮多糖的培養(yǎng)液于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)38 h。各組培養(yǎng)結(jié)束后,收集細胞培養(yǎng)上清液、細胞,分別進行指標檢測。

1.2.3 比色法檢測LDH漏出率、MDA含量、SOD活性

將收集的上清液350 r/min離心10 min,取上清10 mL,利用LDH試劑盒檢測上清液中LDH水平,LDH漏出率(%)=(LDH實驗組-LDH對照組)/LDH對照組×100%。裂解收集細胞,350 r/min離心10 min,取上清液,分別利用MDA、SOD試劑盒檢測上清中MDA含量、SOD活性。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)對收集細胞清洗,300 r/min離心5 min,棄上清液。加Binding Buffer重懸細胞,至密度為1.0×106個/mL。取100 μL細胞懸液,利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達

用RIPA試劑裂解收集細胞對總蛋白進行提取,二喹啉甲酸法(BCA)檢測蛋白濃度。SDS-PAGE實驗對總蛋白進行分離,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,并于5 %脫脂奶粉中封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用cleaved-Caspase-3(1∶500)、Cleaved-Caspase-9(1∶500)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育12 h,洗膜。室溫下,用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h。滴加顯影液顯影,曝光拍照,Image J軟件分析條帶灰度值,以Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9與GAPDH灰度值的比值表示其相對表達量。

1.2.6 qRT-PCR法檢測miR-122表達

利用miRNA提取試劑盒對細胞中總RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,行PCR擴增。引物序列:miR-122正向5′-CGTGGAGTGTGACAATGGTGTT-3′,反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;U6正向5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′,反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法計算miR-122相對U6的表達量。

1.2.7 細胞轉(zhuǎn)染與處理

于6孔板中(1.0×105個/孔)培養(yǎng)PC12細胞24 h,利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染anti-miR-122、anti-miR-NC、miR-122 mimics、miR-NC,轉(zhuǎn)染12 h,qRT-PCR法檢測miR-122表達驗證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染anti-miR-122、anti-miR-NC的PC12細胞接種至6孔板中,均按照OGD/R組處理,分別記為OGD/R+anti-miR-122組、OGD/R+anti-miR-NC組;轉(zhuǎn)染miR-122 mimics、miR-NC的PC12細胞接種至6孔板中,均按照OGD/R+桑白皮多糖高劑量組處理,分別記為OGD/R+桑白皮多糖+miR-122組、OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC組。按照上述試驗步驟分別檢測各組氧化應(yīng)激指標(LDH、MDA、SOD)、細胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量。每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞氧化損傷的影響

OGD/R組LDH漏出率、MDA含量高于Control組(P<0.05),SOD活性低于Control組(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組LDH漏出率、MDA含量低于OGD/R組(P<0.05),SOD活性高于OGD/R組(P<0.05),且各檢測指標在OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞氧化損傷的影響

2.2 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的影響

OGD/R組凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量高于Control組(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量低于OGD/R組(P<0.05),且各檢測指標在OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表2。

圖1 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響

表2 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響比較

2.3 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞miR-122表達的影響

OGD/R組miR-122表達量高于Control組(P<0.05);OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組miR-122表達量低于OGD/R組(P<0.05),且miR-122表達量在OGD/R+桑白皮多糖低劑量組、OGD/R+桑白皮多糖中劑量組、OGD/R+桑白皮多糖高劑量組組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞miR-122表達的影響

2.4 干擾miR-122表達對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的影響

miR-122在轉(zhuǎn)染anti-miR-122的PC12細胞中的表達量為(0.25±0.02),低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的細胞(1.00±0.00),差異有統(tǒng)計學意義(t=-112.500,P<0.05),說明轉(zhuǎn)染anti-miR-122的PC12細胞中miR-122表達受到干擾。OGD/R+anti-miR-122組LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量均低于OGD/R+anti-miR-NC組(P<0.05),SOD活性高于OGD/R+anti-miR-NC組(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 干擾miR-122表達對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響

表4 干擾miR-122表達對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞損傷影響的比較

2.5 上調(diào)miR-122表達逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的作用

miR-122在轉(zhuǎn)染miR-122 mimics的PC12細胞中的表達量為(2.85±0.22),高于轉(zhuǎn)染miR-NC的細胞(1.00±0.00),差異有統(tǒng)計學意義(t=25.227,P<0.05),說明轉(zhuǎn)染miR-122 mimics的PC12細胞中miR-122表達上調(diào)。OGD/R+桑白皮多糖+miR-122組LDH漏出率、MDA含量、凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9蛋白表達量均高于OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC組(P<0.05),SOD活性低于OGD/R+桑白皮多糖+miR-NC組(P<0.05)。詳見圖3、表5。

表5 上調(diào)miR-122表達逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞損傷的作用比較

3 討 論

近年來,由于工作、生活壓力增加,缺血性腦卒中發(fā)病率不斷增長,且呈年輕化趨勢[7]。腦缺血發(fā)生后,血流中斷,治療以恢復(fù)血流供應(yīng)為主。但再灌注時,腦組織產(chǎn)生大量活性氧,造成過氧化氫、超氧自由基、氫自由基增多,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)氧化,神經(jīng)細胞受損[8]。LDH是一種表達于細胞胞質(zhì)的糖酵解酶,在細胞受損后被釋放,因此,細胞培養(yǎng)上清液中LDH漏出率可間接反映細胞受損程度。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,也是反映細胞氧化損傷的重要指標?；钚匝踉黾訉?dǎo)致抗氧化平衡被破壞,抗氧化酶如SOD活性降低。過度的氧化損傷可進一步引起神經(jīng)細胞凋亡,加劇缺血/再灌注損傷。大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤PC12細胞高度分化后,具有神經(jīng)細胞特性,常用OGD/R誘導(dǎo)PC12細胞損傷模擬缺血/再灌注損傷[9]。本實驗結(jié)果顯示,PC12細胞經(jīng)OGD/R誘導(dǎo)后,LDH漏出率、MDA含量均增加,而SOD活性降低,且細胞凋亡率增加,提示OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型建立成功。

目前,缺血/再灌注損傷發(fā)病機制復(fù)雜,缺乏有效的治療藥物。中藥或其活性成分毒性低、作用靶點多,且療效強,是疾病治療藥物研究的重點。桑白皮多糖是中藥桑白皮的主要活性成分,具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[10]。Zhao等[11]報道,桑白皮多糖可通過激活核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)信號通路、促進過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性保護肝細胞免受棕櫚酸誘導(dǎo)的氧化損傷和脂毒性,改善脂質(zhì)代謝紊亂。本實驗結(jié)果顯示,桑白皮多糖可降低OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞氧化損傷,并減少細胞凋亡,且呈劑量依賴性,提示其具有減輕缺血/再灌注損傷的潛在價值。Caspase-9和Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)的重要參與者,其被活化后傳遞凋亡信號或誘導(dǎo)細胞凋亡[12]。本實驗數(shù)據(jù)提示,桑白皮多糖可能通過間接抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)減少OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡,且呈劑量依賴性,可能有助于缺血性腦卒中的治療。

miRNA是一類小分子非編碼RNA,研究已表明,多種miRNA如miR-193b-3p[13]、miR-381-3p[14]、miR-455[15]在腦缺血再灌注腦組織或OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中異常表達,參與調(diào)控OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡、炎癥反應(yīng)或氧化應(yīng)激,為減輕缺血/再灌注損傷提供了潛在分子靶點。作為一種miRNA,miR-122的異常表達與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究顯示,miR-122是放射性腦損傷(RBI)小鼠腦組織中表達上調(diào)的miRNA,敲減miR-122可有效改善RBI小鼠認知障礙,減輕神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥[16];miR-122在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠心肌細胞H9c2中表達增加,敲減miR-122通過靶向G蛋白偶聯(lián)受體激酶結(jié)合蛋白1(GIT1)抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2細胞炎癥、氧化應(yīng)激及細胞凋亡,有利于減輕膿毒癥引發(fā)的心肌損傷[17];miR-122在LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中表達上調(diào),敲減miR-122可保護腎小管上皮細胞免受LPS損傷,miR-122是治療膿毒癥引起的急性腎損傷的潛在分子靶點[18]。

本實驗數(shù)據(jù)顯示,miR-122在OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞PC12中表達增加,干擾miR-122表達減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞氧化損傷,并減少細胞凋亡,這與上述研究結(jié)果一致[16-18],提示miR-122也可作為治療缺血/再灌注損傷的分子靶點。Meng等[19]研究顯示,灰樹花多糖可減輕脂多糖/d-半乳糖胺(LPS/d-GalN)誘導(dǎo)的小鼠肝組織炎癥損傷及氧化應(yīng)激損傷,這與其下調(diào)肝組織中miR-122表達進而激活Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。本實驗結(jié)果表明,桑白皮多糖可呈劑量依賴性抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞PC12中miR-122表達,而上調(diào)miR-122可逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激、細胞凋亡的影響,提示桑白皮多糖可能通過下調(diào)miR-122減輕缺血/再灌注損傷,但其具體作用的miR-122靶基因和下游信號通路有待進一步探究。

綜上所述,桑白皮多糖對OGD/R誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激、細胞凋亡具有顯著抑制作用,其作用機制可能與下調(diào)miR-122表達有關(guān),提示其可減輕缺血/再灌注損傷,有助于缺血性腦卒中的治療,但尚需進一步在體內(nèi)探究。