鄧楚珺,孟勝喜,陳慧澤

癲癇(elilepsy,EP)是以反復(fù)性、發(fā)作性、短暫性、刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的腦部神經(jīng)元高度同步化且常具自限性的異常放電所導(dǎo)致的綜合征。由于異常放電神經(jīng)元的位置不同,放電和擴散的范圍不等,病人發(fā)作可表現(xiàn)為感覺、運動、意識、精神、行為、自主神經(jīng)功能障礙或兼而有之[1-2]。目前,全球約有7 000萬例以上的癲癇病人[3],我國約有900萬例以上的癲癇病人,其中活動性癲癇病人有500萬～600萬例,同時每年新發(fā)癲癇病人65萬～70萬例[4]。恒清Ⅴ號方是本課題組經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)、歸納和驗證研發(fā)的治療癲癇中藥經(jīng)驗復(fù)方?；谇捌谘芯砍晒?本實驗驗證中藥復(fù)方恒清Ⅴ號方的抗癲癇作用,并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器

XY-1B系列精密電子天平(上海奕宇電子科技有限公司);5811型低溫高速離心機(Eppen-dorf公司);Epoch酶標(biāo)儀(BioTek公司);超微量紫外可見分光光度計(Thermo Scientific公司);正置熒光顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]。

1.1.2 藥物與試劑

丙戊酸鈉緩釋片[商品名:德巴金,生產(chǎn)企業(yè):賽諾菲(杭州)制藥有限公司,規(guī)格:500 g×30片,國藥準(zhǔn)字H20010595,lot:BHG0357)];戊四唑(pentylenetetrazole,PTZ,上海源葉生物科技有限公司,lot:S48261);谷氨酸(Glu)試劑盒(lot:A089-1-1)和谷氨酰胺合成酶(GS)測定試劑盒(lot:A089-1-1),均購自南京建成生物工程研究所。超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、熱休克蛋白70(HSP-70)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海初態(tài)生物科技有限公司。GFAP、Fos抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。恒清Ⅴ號方組方:膽南星15 g,僵蠶10 g,全蝎2 g,石菖蒲15 g,蟬蛻10 g,川芎15 g。由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中藥房提供。按處方比例稱取以上中藥藥材,加10倍量水,浸泡0.5 h,煎煮3次,每次40 min,過濾,合并以上3次濾液,37 ℃水浴加熱濃縮,根據(jù)臨床實際用藥情況對藥液進行濃縮處理,并以中質(zhì)量濃度匹配臨床的實際用藥濃度。中質(zhì)量濃度濃縮至0.535 g/mL,恒清Ⅴ號方低劑量為0.267 g/mL,恒清Ⅴ號方中劑量為0.535 g/mL,恒清Ⅴ號方高劑量為1.070 g/mL,分別置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實驗動物

無特定病原體(SPF)級,雄性C57BL/6J小鼠110只,體質(zhì)量(23±3)g,購自上海靈暢生物科技有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2018-003。飼養(yǎng)于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司動物房,全部動物預(yù)飼養(yǎng)2周,分別單籠喂養(yǎng)。光照/黑暗:12 h/12 h,隨意飲水和進食,溫度(22±2)℃,相對濕度(60±5)%。

1.2 方法

1.2.1 癲癇小鼠模型的建立

采用戊四唑(PTZ)點燃、的方法制備癲癇小鼠模型[5]。將112只C57BL/6J小鼠隨機分為正常組(18只)和造模組(94只)。造模組以35 mg/kg腹腔注射戊四唑,每2 d 1次。根據(jù)Racine分級表評估小鼠的癲癇發(fā)作級別[6](見表1)。連續(xù)3次注射戊四唑后,小鼠癲癇發(fā)作為4級或5級,提示為點燃成功。共點燃造模成功90只小鼠,將90只小鼠隨機分為模型組、恒清Ⅴ號方低劑量組、中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組,每組18只。

表1 Racine分級

1.2.2 給藥

丙戊酸鈉組給予丙戊酸鈉緩釋片溶液(丙戊酸鈉緩釋片加入生理鹽水中配制而成)灌胃,恒清Ⅴ號方低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予0.267、0.535、1.070 g/mL劑量的恒清Ⅴ號方灌胃,均為每日 2次。丙戊酸鈉緩釋片溶液濃度或恒清Ⅴ號方給藥濃度依據(jù)人和動物體表面積折算系數(shù)進行換算[7],計算結(jié)果為14.8 g/kg。正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,每日2次,各組均持續(xù)灌胃30 d。在灌胃給藥的過程中,除正常組外,其他各組繼續(xù)以35 mg/kg腹腔注射戊四唑,每5 d 1次。

1.2.3 癲癇發(fā)作級別與發(fā)作潛伏期

分別于治療后10 d、治療后20 d、治療后30 d時,觀察小鼠的癲癇發(fā)作級別和發(fā)作潛伏期。觀察方法:注射戊四唑后把小鼠放入透明箱中,連續(xù)觀察30 min,記錄小鼠的癲癇發(fā)作級別和癲癇發(fā)作潛伏期。癲癇發(fā)作潛伏期記錄為戊四唑注射完成后到2級發(fā)作的時間,若30 min內(nèi)未發(fā)作,則潛伏期記為1 800 s;同時記錄最高癲癇發(fā)作級別。

1.2.4 血清hs-CRP和HSP-70水平

分別于治療前1 d、治療后30 d,將各組小鼠麻醉后,尾靜脈取血,離心后取其上清液,采用hs-CRP、HSP-70的ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中的hs-CRP和HSP-70水平。

1.2.5 Fluoro-Jade B(FJB)染色檢測海馬神經(jīng)元損傷

治療30 d后,每組小鼠中隨機選取6只,然后麻醉、多聚甲醛灌注、取腦、固定、切片、脫蠟、水洗、加入FJB綠色熒光探針、DAPI染核、沖洗、吹干、透明、封片、切片,待熒光顯微鏡觀察,采集圖像以Image J軟件計數(shù)FJB陽性神經(jīng)元數(shù)量。

1.2.6 大腦皮層及海馬Glu含量等水平

治療30 d后,各組余下的小鼠中均隨機選取6只。然后麻醉,冰上去除嗅球、小腦及低位腦干,分離大腦皮層、海馬-80 ℃冰箱保存。按體質(zhì)量1∶9加入提取液,4 000 r/min離心10 min,取上清于冰上待測。分別按照Glu和GS試劑盒說明書測定小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量和GS活性。治療30 d后,各組余下的6只小鼠,麻醉取腦分離海馬組織,沖洗干凈后平均分為2部分。一部分用多聚甲醛固定石蠟包埋、切片、烤片等。采用GFAP、Fos抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒進行染色冰封片。40×倍鏡下觀察、拍照。參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[8]的內(nèi)容進行陽性評價,并計算陽性得分,最終得分=顏色得分+陽性細胞占比得分。余下的另外一部分制備成組織勻漿,采用hs-CRP、HSP-70的ELISA試劑盒檢測各組小鼠海馬組織中的hs-CRP和HSP-70水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠給藥后不同時間點癲癇發(fā)作級別及癲癇發(fā)作潛伏期比較

給藥10 d時,與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05)。分別在給藥20、30 d時,與模型組比較,各用藥組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05)。詳見表2、表3。

表2 各組小鼠給藥后不同時間點癲癇發(fā)作級別比較 單位:級

表3 各組小鼠給藥后不同時間點癲癇發(fā)作潛伏期比較 單位:s

2.2 各組小鼠給藥前后血清hs-CRP、HSP-70水平比較

與給藥前比較,各用藥組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的血清hs-CRP、HSP-70水平均下降(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠給藥前后血清hs-CRP、HSP-70水平的比較

2.3 各組小鼠給藥后30 d海馬組織GFAP、Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平比較

與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平均降低(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組給藥后30 d海馬組織GFAP、Fos陽性表達評分及hs-CRP、HSP-70水平比較

2.4 各組小鼠給藥后30 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性情況比較

與正常組比較,模型組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量增多(P<0.01);與模型組比較,各用藥組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量均減少(P<0.05或P<0.01)。與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組給藥后30 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性情況比較 單位:個

2.5 各組小鼠給藥30 d后大腦皮層、海馬Glu含量及GS活性比較

與正常組比較,模型組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量升高,GS活性下降(P<0.01);與模型組比較,各用藥組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01)。與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05)。詳見表7。

表7 各組給藥后30 d大腦皮層、海馬Glu含量和GS活性比較

3 討 論

癲癇在中醫(yī)學(xué)中隸屬于“癲疾”“癇證”等范疇,其病因與痰、火、驚、風(fēng)、氣關(guān)系密切,特別是以痰邪作祟為主。肝風(fēng)內(nèi)動、痰瘀互結(jié)是癲癇的宿根,因此,息風(fēng)化痰、活血化瘀應(yīng)作為本病的主要治法。

癲癇的發(fā)生與炎癥機制密切相關(guān),hs-CRP可作為癲癇的生物學(xué)標(biāo)志物之一[9]。熱休克蛋白(HSP)與癲癇進展有關(guān),癲癇病人神經(jīng)細胞受損后,其變性蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)HSP-70的生成[10],在癲癇發(fā)作時也可見到HSP-70的聚集[11]。Glu是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要神經(jīng)遞質(zhì),被星形膠質(zhì)細胞攝取并轉(zhuǎn)化成無神經(jīng)元毒性的谷氨酰胺,谷氨酰胺重新被運回到神經(jīng)元,可作為神經(jīng)遞質(zhì)合成的前體物質(zhì)[12],谷氨酰胺合成酶活性降低則可造成細胞外液中Glu的蓄積,從而誘發(fā)癲癇。

恒清Ⅴ號方是經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)、歸納和驗證的治療癲癇療效確切的中藥經(jīng)驗復(fù)方,恒清Ⅴ號方全方共同起到息風(fēng)化痰、定驚、活血化瘀之效,從而有效治療癲癇。本研究結(jié)果顯示,與給藥10 d時比較,給藥20 d時的恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均縮短(P<0.05或P<0.01);與給藥20 d時比較,給藥30 d時的恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均漸縮短(P<0.05或P<0.01)。給藥10、20、30 d時,在相同的給藥時間,與模型組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均延長(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的癲癇發(fā)作級別均降低,癲癇發(fā)作潛伏期均縮短(P<0.05)。這表明恒清Ⅴ號方給藥時間越長,癲癇模型小鼠的癲癇發(fā)作級別越低,癲癇發(fā)作潛伏期越長;恒清Ⅴ號方給藥劑量越大,癲癇模型小鼠的癲癇發(fā)作級別越低,癲癇發(fā)作潛伏期越長。

與模型組比較,各用藥組小鼠的血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平、海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分均降低,海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少,大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方低劑量組比較,恒清Ⅴ號方中劑量組、高劑量組及丙戊酸鈉組小鼠的血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平、海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分均降低,海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少,大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01);與恒清Ⅴ號方中劑量組、丙戊酸鈉組比較,恒清Ⅴ號方高劑量組小鼠的血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平、海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分均降低,海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量減少,大腦皮層和海馬中的Glu含量下降,GS活性升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明,恒清Ⅴ號方可以降低模型小鼠海馬組織GFAP和Fos陽性表達評分及hs-CRP和HSP-70水平,升高GS活性,促進Glu的轉(zhuǎn)化,降低Glu的含量。其作用與劑量有一定關(guān)系。

恒清Ⅴ號方可以改善戊四唑誘發(fā)的癲癇模型小鼠癥狀,減輕其海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞變性損傷,其作用與劑量呈正相關(guān),作用機制可能是與恒清Ⅴ號方促進癲癇小鼠腦組織Glu的轉(zhuǎn)化、降低血清及海馬組織的hs-CRP、HSP-70水平有關(guān)。