韓思梁,趙澤群,石 云,孔繁昌

心肌肥大是一種強有力的代償形式,如果代償形式時間持續(xù)延長或者強度無限增大,則肥大心肌在一定疾病程度上可轉(zhuǎn)向心力衰竭,危害生命健康[1-2]。環(huán)氧化酶2(COX2)/前列腺素E2(PGE2)途徑可以調(diào)控多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,抑制該信號通路可延緩某些疾病的進(jìn)展[3-4]。川芎嗪對心臟有抑制心肌收縮的作用,對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[5-6]。但川芎嗪對心肌肥大的影響及其可能作用機制尚未明確。本實驗探究川芎嗪通過抑制COX2/PGE2途徑減輕血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌肥大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠心肌細(xì)胞H9c2系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自美國Hycolne公司;AngⅡ購自上海源葉生物技術(shù)有限公司;甲基噻唑基四唑(MTT)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;鈣離子熒光探針Fluo-3/AM購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;采用比色法測定細(xì)胞一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS),試劑盒以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自大連寶生物科技有限公司;二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒購自北京Apuris生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物

川芎嗪購自無錫市第七制藥有限公司(規(guī)格:40 mg/2 mL;純度:≥98%),批號06032411。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組

H9c2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞融合80%～90%時,進(jìn)行傳代培養(yǎng),收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。培養(yǎng)小鼠正常心肌細(xì)胞H9c2作為對照組;用0.1 μmol/L的AngⅡ誘導(dǎo)建立H9c2肥大模型作為模型組。用低劑量(0.01 mmol/L)、中劑量(0.1 mmol/L)、高劑量(1 mmol/L)的川芎嗪干預(yù)AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞作為低劑量川芎嗪組、中劑量川芎嗪組、高劑量川芎嗪組。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞的活性

收集各組細(xì)胞,接種于96孔板(每孔100 μL),每組設(shè)置3個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h,每孔加20 μL MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO),應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔相對吸光度值(OD=450 nm),計算細(xì)胞活性。

1.3.3 Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)測量細(xì)胞表面積

收集各組細(xì)胞,以5×108個/L接種于6孔板中,培養(yǎng)48 h后,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)測量細(xì)胞表面積。

1.3.4 激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度[Ca2+]i

收集各組細(xì)胞,以1×108個/L接種于Petri皿中,培養(yǎng)48 h后,加入5 μmol/L的鈣離子熒光探針Fluo-3/AM,45～60 min后分析細(xì)胞[Ca2+]i。

1.3.5 比色法測定細(xì)胞NO含量和NOS活性

收集各組細(xì)胞,采用比色法測定細(xì)胞NO含量和NOS活性,實驗步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明逐步進(jìn)行。

1.3.6 ELISA法測定細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)含量

收集各組細(xì)胞,采用ELISA法檢測細(xì)胞中TGF-β1含量,實驗過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.7 qRT-PCR檢測細(xì)胞COX2和PGE2 mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞的總RNA,將RNA合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR,循環(huán)條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s,共40個循環(huán);60 ℃延長5 min。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。

1.3.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測細(xì)胞COX2、PGE2蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞提取蛋白濃度,BCA試劑盒測定蛋白濃度,行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至二氨基聯(lián)苯胺(PVDF)膜上,分別加入一抗(1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過夜,加入二抗(1∶2 000稀釋),室溫孵育90 min,用增強型化學(xué)(ECL)發(fā)光液顯影,Quantity One凝膠分析蛋白條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活性的影響

與對照組比較,模型組細(xì)胞活性下降(P<0.05);與模型組比較,各劑量川芎嗪組細(xì)胞活性升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活性的影響

2.2 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞表面積和[Ca2+]i的影響

與對照組比較,模型組細(xì)胞表面積和[Ca2+]i升高(P<0.05);與模型組比較,各劑量川芎嗪組細(xì)胞表面積和[Ca2+]i降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞表面積和[Ca2+]i的影響

2.3 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞NO含量和NOS活性的影響

與對照組比較,模型組細(xì)胞NO含量和NOS活性降低(P<0.05);與模型組比較,各劑量川芎嗪組細(xì)胞NO含量和NOS活性升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞NO含量和NOS活性的影響

2.4 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞TGF-β1含量影響

與對照組比較,模型組細(xì)胞TGF-β1含量升高(P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量川芎嗪組細(xì)胞TGF-β1含量降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞TGF-β1含量的影響

2.5 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞COX2和PGE2 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較,模型組細(xì)胞COX2和PGE2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比較,各劑量川芎嗪組細(xì)胞COX2和PGE2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。詳見表5。

表5 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞COX2和PGE2 mRNA表達(dá)的影響

2.6 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞COX2和PGE2蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較,模型組細(xì)胞COX2和PGE2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比較,川芎嗪各劑量組細(xì)胞COX2和PGE2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。詳見圖1、表6。

圖1 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞COX2/PGE2途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表6 川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞COX2和PGE2途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

心肌肥大常見于各種原發(fā)或繼發(fā)的心肌病,是一種不平衡的生長形式。心肌肥大發(fā)展到一定程度,可能出現(xiàn)心力衰竭,嚴(yán)重威脅生命安全[7-8]。有研究報道,川芎嗪對于治療心臟疾病具有顯著的療效[9]。

本研究表明,AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性降低,而川芎嗪處理后細(xì)胞活性升高,與既往研究報道結(jié)果相似[10]。黃芪甲苷通過激活Sirt3抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大細(xì)胞的活性[11]。本實驗研究表明,AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積和[Ca2+]i顯著升高,與既往研究報道結(jié)果相似[12],而川芎嗪處理后細(xì)胞表面積和[Ca2+]i降低,提示川芎嗪可促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及改善心肌肥大。

小檗堿可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化,改善心室重塑,其作用與促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分泌NO、減少TGF-β1含量有關(guān)[13]。本實驗研究結(jié)果,AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞NO含量和NOS活性降低,TGF-β1的含量升高,而川芎嗪可提高NO含量及增強NOS活性,并可降低TGF-β1的含量。提示川芎嗪可通過抑制TGF-β1表達(dá)及提高NO含量、增強NOS活性從而改善心肌肥大。COX2/PGE2途徑在機體生理過程中發(fā)揮極其重要的信號調(diào)控作用,參與了眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展[14-15]。本研究結(jié)果顯示,AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中COX2和PGE2的表達(dá)量升高,而川芎嗪能夠以濃度依賴性方式降低COX2和PGE2的表達(dá)。川芎嗪通過抑制COX2/PGE2途徑減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大。