武峰峰，高振秋，鄭亮，3，牛欣雨，魏佳琪，吳志軍，張華，曹宏偉，

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319；2.鹽城師范學院藥學院；3.黑龍江八一農墾大學動物科技學院）

宿主的先天免疫是抵御病毒感染的第一道防線，但一些病毒已經進化出多種逃避抗病毒先天免疫的策略。豬腸道冠狀病毒（PECS）包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬δ 冠狀病毒（PDCoV）、傳染性胃腸炎冠狀病毒（TGEV）和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV），可引起仔豬致死性腹瀉，威脅全球養(yǎng)豬業(yè)。與其他冠狀病毒一樣，PEDV 的免疫逃逸是引起感染的關鍵致病機制。

PEDV 為冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，基因組結構包括編碼S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白和N 蛋白四個結構蛋白的基因，其余基因編碼16 個非結構蛋白[1]。PEDV 可引起豬的急性和高度傳染性腸道病毒病。從2010 年開始，美國和亞洲國家的PEDV 疫情顯著增加，在全球范圍內造成了嚴重的經濟損失[2-3]，已確定導致這些疫情發(fā)生的是高毒力的PEDV 毒株的變種。這些PEDV 毒株的免疫逃逸與仔豬病情嚴重密切相關。在PEDV 感染過程中，病毒能夠通過某種途徑抵抗宿主的抗病毒反應，幾個復制酶作為干擾素拮抗劑，阻斷宿主抗病毒蛋白的表達[4]。PEDV Nsp14是一種具有鳥嘌呤N7 甲基轉移酶和外切酶結構域的雙功能酶[5]，N7 甲基轉移酶活性對病毒基因組的翻譯至關重要，能夠防止宿主將病毒mRNAs 視為“非我”[6]，如果Nsp14 的N7 甲基轉移酶結構域發(fā)生突變，那么PEDV 對宿主的天然免疫反應將會變得更加敏感。而Nsp14 的外切酶活性在抵抗病毒天然免疫反應的過程中也發(fā)揮著重要作用[6]。一項研究表明，N7 甲基轉移酶缺陷的PEDV 在復制方面存在缺陷，但感染該病毒會導致Ⅰ型和Ⅲ型IFN 分泌增加[7]。對冠狀病毒Nsp14 的研究已經逐漸深入，然而PEDV Nsp14 仍有許多功能有待進一步探究。

所以，研究擬利用RT-PCR 的方法從病變豬小腸中擴增出PEDV Nsp14 基因，并將該基因與真核表達載體PRK5-Myc 相融合后轉染真核細胞，觀察重組表達載體PRK5-Myc-Nsp14 的表達情況。試驗結果顯示，研究成功構建PEDV Nsp14 基因的重組表達載體PRK5-Myc-Nsp14，并用Western Blot 技術驗證PRK5-Myc-Nsp14 重組載體成功在真核細胞中表達，為以后深入探索PEDV Nsp14 蛋白的功能奠定了一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

HeLa 細胞和IPEC J2 細胞均保存于生物中心509 試驗室液氮罐中；小鼠抗Myc 單克隆抗體（mAb）、小鼠抗β-actin 單抗（mAb）以及山羊抗小鼠辣根酶標記IgG、FITC 標記的山羊抗小鼠IgG 均購自北京中衫金橋生物技術公司；DEME 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal cattle serum，F(xiàn)BS）、Lipofectamine TM 2 000 購自英濰捷基（Invitrogen）上海貿易有限公司；DNA 膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購于Omega 公司；MLV 逆轉錄酶，PCR 試劑盒、限制性內切酶、T4連接酶、M-MLV 反轉錄酶、Ex Taq 熱啟動DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司；引物合成和序列測定由擎科生物（北京）公司完成；感受態(tài)細胞DH5α 購自北京天根公司；PRK5-Myc 載體由實驗室保存。

1.2 引物設計及表達載體構建路線

根據(jù)已發(fā)表在GenBank 網站中PEDV USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）基因序列，設計具有特異性的PEDV Nsp14 基因上游及下游引物，上游引物：5’-AAGCCTGACATTGACATTG-3’（EcoRⅠ）和下游引物：5’-TGCCGAACCTATCATTGA-3’（HindⅢ）。將PEDV Nsp14 基因插入PRK5-Myc 的EcoRⅠ/HindⅢ位點之間。構建以Myc 為標簽的Nsp14 蛋白融合表達載體。

1.3 擴增PEDV Nsp14 基因

取部分病變的豬小腸組織于研缽中，加入液氮并迅速研磨，將研磨成粉末狀的組織分裝于1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol 溶液后劇烈搖晃60 s，靜置10 min 后加入200 μL 在4 ℃冰箱中預冷的三氯甲烷溶液并迅速搖晃20 s，靜置15 min 后在4 ℃低溫離心機中離心15 min，離心力10 000×g。將離心結束后的上清液轉移到新的離心管中并向其中加入600 μL 異丙醇溶液，輕搖混勻后靜置10 min。靜置完畢在4 ℃低溫離心機中離心10 min，離心力為10 000×g。離心結束后棄掉上清，并向其中加入600 μL用DEPC 水配制的濃度為75%的乙醇，靜置10 min后在4 ℃低溫離心機中離心10 min，離心力為10 000×g。離心結束后棄上清，靜置5 min 后加入20 μL 的DEPC 水靜止15 min，測量RNA 濃度后保存于-80 ℃冰箱中。

取1 000 ngRNA 于PCR 管中，加入1 μL oliga（dT）并補加DEPC 水至6 μL，放入PCR 儀70 ℃持續(xù)10 min。10 min 后再加入2 μL buffer，2 μL dNTP，0.25 μL RRI，0.1 μL M-MLV，5.65 μL DEPC 水，放入PCR 儀30 ℃10 min；42 ℃1 h，80 ℃10 min。反轉錄結束獲得PEDV Nsp14 基因的cDNA，測量DNA濃度后保存于-20 ℃冰箱中。

取500 ng 上一步得到的cDNA 于PCR 管中，加入4 μL dNTP Mixture，5.0 μL 10×PCR Buffer，0.4 μL上游引物、0.4 μL 下游引物、0.25 μL Taq 酶，最后加入dd H2O 至總體積為50 μL，放入PCR 儀94 ℃預變性10 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35 次。最后一個循環(huán)72 ℃，延伸10 min，獲得PEDV Nsp14 基因片段。

1.4 PEDV Nsp14 基因真核表達載體的構建及鑒定

將PEDV Nsp14 基因片段和PRK5-Myc 載體均使用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，試驗條件為37 ℃，酶切2 h，酶切完畢后將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并利用Omega DNA 膠回收試劑盒回收酶切產物。

向上述兩種回收產物中加入T4 連接酶、buffer和去離子水，置于16 ℃連接儀，連接反應持續(xù)12 h。連接產物用DH5α 感受態(tài)細胞轉化，并于固體LB 培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。從過夜培養(yǎng)的固體LB 培養(yǎng)基上挑取單菌落于液體LB 培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，并使用Omega 質粒小提試劑盒提取質粒，將所提質粒進行PCR 鑒定和雙酶切鑒定，篩選正確的質粒，保存于-20 ℃冰箱中。并從中取10 μL 質粒送至公司進行測序，重組質粒命名為PRK5-Myc-Nsp14。

1.5 轉染細胞及Western Blot 檢測

將Hela 細胞和IPEC J2 細胞接種至24 孔板內，當其細胞密度達到80%左右時進行轉染。用脂質體Lipofectin2 000 將質粒送入細胞，轉染完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h 后棄掉培養(yǎng)液，沿壁輕柔加入PBS 緩沖液清洗2~3 次，加入RIPA 裂解液30 μL，冰浴裂解30 min。裂解完畢，刮下細胞置于1.5 mL 離心管中，在4 ℃低溫離心機中離心10 min，離心力為12 000×g，收集上清液，加入5×Loading Buffer，在沸水中煮10 min。得到處理好的蛋白樣品，將所得蛋白樣品進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將目的條帶經濕轉轉至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用TBST 洗膜8 次，每次15 min，用小鼠抗Myc單克隆抗體（1∶3 000）在4 ℃低溫搖床中孵育過夜，用TBST 洗膜8 次，每次15 min，再與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3 000）搖床孵育2 h，經TBST 洗膜，利用特超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像并記錄試驗結果。

1.6 間接免疫熒光

向24 孔板中放入爬片，將Hela 細胞和IPEC-J2細胞接種至24 孔板內，待細胞密度達到60%左右時，用Lipofectin2 000 將PRK5-Myc 和PRK5-Myc-Nsp14 質粒轉染至IPEC-J2 和Hela 細胞中，4~6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM。在37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h 后棄掉培養(yǎng)液，沿壁輕柔加入4 ℃預冷的PBS 緩沖液清洗2~3 次，每孔加入500 μL 的4%的多聚甲醛，室溫條件下固定20 min；再用4 ℃預冷的PBS 緩沖液清洗細胞2~3 次，每次清洗5 min。然后加入0.1%的Triton X-100，室溫條件下透膜20 min；用4 ℃預冷的PBS 緩沖液清洗細胞2~3 次，每次5 min；加入5% BSA 封閉2 h，加入一抗孵育1 h；PBS 清洗3 次，每次清洗5 min；加入熒光素標記的二抗（1∶3 000），在室溫條件下避光孵育2 h；PBS 清洗3 次，每次5 min。最后取干凈且滅菌后的載玻片，滴加少量DAPI 染料，用針頭挑出爬片，讓帶有細胞的面朝下扣在載玻片上，用吸水紙吸掉多余液體，用橡皮輕輕壓緊，再將指甲油均勻涂抹在爬片周圍，避光晾干，待片子干燥后用熒光顯微鏡觀察拍照，并保存圖片。

2 結果與分析

2.1 PEDV Nsp14 基因片段的PCR 擴增

取病變豬小腸組織于研缽中，加入液氮研磨成粉末后，用Trizol 試劑提取組織總RNA，以提取出的總RNA 為模板，反轉錄得到cDNA，接下來以cDNA為模板進行PCR 擴增，得到片段大小為1 551 bp 的目的條帶，即為特異的PEDV Nsp14 基因片段，結果如圖1。

圖1 Nsp14 基因片段的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of Nsp14 gene fragment

2.2 PEDV Nsp14 及真核表達載體PRK5-Myc 的雙酶切

將PCR 擴增后的目的基因與真核表達載體PRK5-Myc 連接之前，用EcoRⅠ和HindⅢ核酸內切酶將目的基因和載體進行雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2。

圖2 PEDV Nsp14 基因和真核表達載體PRK5-Myc 的雙酶切Fig.2 Double restriction digestion of PEDV Nsp14 gene and eukaryotic expression vector PRK5-Myc

2.3 重組質粒PRK5-Myc-Nsp14 的PCR 鑒定

利用T4 連接酶將酶切產物進行連接，連接產物轉化及提取質粒后得到重組質粒PRK5-Myc-Nsp14。用常規(guī)方法進行PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在1 551 bp 附近有單一明亮目的條帶，符合理論設計結果，結果如圖3。

圖3 重組質粒PRK5-Myc -Nsp14 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid PRK5-Myc -Nsp14 using PCR

2.4 重組質粒PRK5-Myc-Nsp14 雙酶切鑒定

經PCR 初步鑒定后，取1 000 ng 結果為陽性的質粒，加入EcoRⅠ和HindⅢ兩種酶置于37 ℃水浴鍋中對重組質粒進行雙酶切鑒定，結果得到片段大小約為1 551 bp 和4 720 bp 的兩條目的條帶，得到結果與預期理論設計結果相符，結果如圖4。

圖4 重組質粒PRK5-Myc-Nsp14 的雙酶切分析Fig.4 Double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid PRK5-Myc-Nsp14

2.5 重組表達載體序列比對

取10 μL PRK5-Myc-Nsp 14 質粒送至北京生物公司進行測序，將測序結果與PEDV USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）序列進行多序列比對，結果顯示其同源性高達99%，結果如圖5。

圖5 PRK5-Myc-Nsp14 與USA/KS/2013 毒株（KJ184549.1）序列比對Fig.5 Sequence alignment between PRK5-Myc-Nsp14 and USA/KS/2013（KJ184549.1）strains

2.6 Western Blot 檢測細胞中表達的重組蛋白

處理好的蛋白樣品經SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將目的蛋白濕轉至PVDF 膜，轉膜完畢，先用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別用鼠抗Myc 單抗及山羊抗小鼠二抗（1∶3 000）孵育，檢測載體PRK5-Myc 及重組表達載體PRK5-Myc-Nsp14 的表達情況，其結果顯示為圖6。

圖6 Western Blot 鑒定蛋白融合表達Fig.6 Identification of protein fusion expression by western Blot

2.7 Nsp14 蛋白在細胞中的表達

利用熒光顯微鏡觀察PRK5-Myc-Nsp14 在Hela細胞和IPEC-J2 細胞中紅色熒光的分布情況，以此用來確定重組表達載體PRK5-Myc-Nsp14 在細胞中的表達以及定位的情況。結果顯示重組表達載體PRK5-Myc-Nsp14 質粒成功表達，并且在細胞核和細胞質內均有分布，結果如圖7。

圖7 Nsp14 蛋白在Hela 細胞和IPEC-J2 細胞中的表達Fig.7 Expression of Nsp14 protein in Hela cells and IPEC-J2 cells

3 討論

2010 年以來，PEDV 變異株逐漸席卷全球養(yǎng)豬業(yè)，帶來了巨大的經濟損失。病毒如此巨大的危害與其強大的傳播性分不開。一般來說，PEDV 的主要傳播途徑是糞口傳播，但在豬與豬以及農場與農場之間可能通過糞便到鼻腔的途徑進行空氣傳播[8]。PEDV 主要感染豬腸上皮細胞，然后定植于腸道，導致腸道絨毛萎縮、壞死和脫落，影響營養(yǎng)物質的吸收，引起豬嘔吐、腹瀉、體重減輕、食欲不振和抑郁[9-10]。當PEDV 進入到糞便中時，受污染的糞便可能會導致大規(guī)模疫情。保護新生哺乳仔豬免受PEDV 感染最有效的策略是從初乳和乳汁中獲得足夠的母體抗體[11]。雖然PEDV 滅活疫苗、弱毒疫苗已經開始廣泛使用，但各國豬場感染率仍然非常高[12]。因此，迫切需要對該病及其病原體進行深入研究，并迅速開發(fā)基于流行毒株的有效疫苗。

有關PEDV 各方面的研究已經展開，例如在PEDV 引起細胞自噬方面[13]，在PEDV 抗原表位鑒定方面等[14]。有報告指出Nsp14 是一種雙功能蛋白，它除了具有核酸外切酶活性外，在其C 末端結構域還具有鳥嘌呤N7 甲基轉移酶活性，屬于核酸外切酶超家族DEDD，Nsp14 還包括許多DNA 聚合酶以及其他真核和原核外核酸酶的校對結構域[15]。N7 甲基鳥苷帽是真核生物mRNA 的一個明顯的結構特征，包括那些在細胞質中復制的真核生物病毒。Nsp14 能夠催化核苷單磷酸沿3’-5’方向切除[16]。這種核酸外切酶活性對于冠狀病毒復制過程中的校對活性至關重要。Nsp14 包含三個外顯子保守基序，在三個外顯子保守基序中含有四個關鍵的金屬配位氨基酸。金屬離子Mg2+或Mn2+對Nsp14 核酸外切酶活性至關重要[16]。不同部位的基序發(fā)生突變會導致突變率增加，對致死性突變和IFN-β 更敏感，感染峰值滴度降低等影響[16-19]。

一些研究表明，冠狀病毒nsp10 是Nsp14 外切酶活性的刺激因子，使其核酸外切酶活性增加[16-17]。破壞nsp10 和Nsp14 之間的相互作用或Nsp14 外切酶活性失活會降低復制的保真度，并加速致死突變的產生[18，20-21]。雖然基本的Nsp14 外切酶活性不需要輔因子的存在，但它的活性只有在nsp10 蛋白存在的情況下才被完全激活[17]。Nsp14 核酸外切酶還參與了病毒生命周期的其他過程，包括對病毒基因組重組的調控[22]和干擾宿主的先天性免疫反應[6]。此外，Nsp14外切酶活性可能使冠狀病毒對核苷類似物（NA）藥物[20，23-25]產生特異性耐藥性，這對以nsp12（RNA 依賴RNA 聚合酶）為靶標的核苷抑制劑的開發(fā)構成了巨大的挑戰(zhàn)。因此，研究Nsp14 的功能對了解病毒免疫逃逸的機制等其他方面具有重要作用。

試驗使用Trizol 法從病變豬小腸中提取總RNA，并通過PCR 技術獲得PEDV Nsp14 基因，將基因和空載體同時雙酶切后用T4 連接酶連接，連接產物在固體LB 培養(yǎng)基上轉化，10 h 后將部分單菌落在液體LB 中擴大培養(yǎng)并提取質粒，經過PCR 檢測和雙酶切檢測鑒定重組質粒，在真核細胞中檢測表達情況和細胞定位情況。試驗為后續(xù)對Nsp14 蛋白功能的探索奠定了基礎。