孟凡舜，李仕韋，夏榕鴿，趙天睿，劉鼎鑫，李鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，大慶 163319）

對于我國北方高寒地域的動物，特別是對新生的動物而言，冷應(yīng)激是較為常見的一種應(yīng)激源。在北方高寒地域，初春的雛雞孵化、初春末秋的母豬產(chǎn)崽以及冬天的母牛產(chǎn)犢等，冷應(yīng)激對于畜牧業(yè)的迅速發(fā)展都是需要重視的必要環(huán)節(jié)[1]。然而，由低溫環(huán)境所引起的冷應(yīng)激往往會導致動物生長速度減慢、抗病能力變差，甚至導致動物死亡等問題。嚴重的冷應(yīng)激會對動物產(chǎn)生較大的影響，除了會降低其生產(chǎn)性能，還可引發(fā)動物呼吸系統(tǒng)疾病，甚至導致動物死亡[2]。即使動物適應(yīng)冷應(yīng)激后，也會引起基礎(chǔ)代謝率和采食量提高，導致動物的能量儲備及生產(chǎn)性能有所降低，進而影響生產(chǎn)效益。綜上可知，低溫環(huán)境所引起的冷應(yīng)激是影響我國北方畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

動物體內(nèi)的能量資源不是無限的，當體內(nèi)某一系統(tǒng)所需能量增加時，為適應(yīng)自身變化，機體會對自身能量的利用進行重新分配，以維持自己的生命。當外界溫度降低時，恒溫動物首先通過非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱來增加產(chǎn)熱，當達到臨界點時，就會發(fā)生戰(zhàn)栗。作為三大營養(yǎng)物質(zhì)的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)是機體熱量的主要來源。而肝臟是許多生理過程的關(guān)鍵樞紐，作為機體內(nèi)物質(zhì)代謝最旺盛的器官，它也是機體主要的產(chǎn)熱器官之一。肝臟與三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝之間存在著十分密切的關(guān)系，它是糖異生、調(diào)節(jié)血糖濃度以及將體內(nèi)糖轉(zhuǎn)化為脂肪的主要器官，并在脂類代謝過程中發(fā)揮著重要作用，同時肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝也很活躍。在進食時，肝臟以糖原形式儲存葡萄糖，空腹時則通過糖異生途徑組裝葡萄糖，肝臟能夠氧化脂肪，也可將多余的脂肪進行包裝，以分泌和儲存到其他組織，肝臟還負責血液中分泌的大多數(shù)蛋白質(zhì)，能夠處理用于能量的氨基酸，還可通過以尿素新陳代謝的形式處理蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的含氮廢物[3]。當機體處于寒冷環(huán)境中時，肝臟的代謝活動會有所增強，以此提高機體熱量，同時也為骨骼肌的戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱提供能量。因此，在處于寒冷環(huán)境的情況下促進肝臟產(chǎn)熱對動物機體抵御低溫環(huán)境具有重要意義。

川芎，傘形科藁本屬植物，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，又名香果，其性溫，味辛，常用于活血行氣、祛風止痛，在散偏湯、四物湯、溫經(jīng)湯等方劑中均可見其身影。川芎中所含化學成分眾多，如川芎嗪、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁基苯酞等。川芎嗪（ligustrazine，TMP）是從中草藥川芎中分離得到的一種活性生物堿，化學名稱為2，3，5，6-四甲基吡嗪，于1957 年首次被分離，具有2000 多年的廣泛藥用歷史。在我國川芎嗪被廣泛用于心腦血管疾病，至今已有40 多年的歷史，同時由于其對機體多個系統(tǒng)均表現(xiàn)有效性，而受到了廣泛關(guān)注[4]。在過去的幾十年里，研究人員探索了TMP 在各種疾病中的藥理作用，例如心腦血管缺陷[5-6]、脂肪肝[7-8]、胰腺炎[9]、Ⅱ型糖尿病[10-12]及癌癥[13-15]等，驗證了其保護肝臟和腎臟[16-17]、抗氧化[18]、抗炎[19]及抗腫瘤活性[20]等作用。

鹽酸川芎嗪是川芎嗪最常用的藥物制劑，在臨床中具有良好的使用效果，穩(wěn)定性更好，半衰期較川芎嗪更長和副作用較小等特點。介于上述背景，鹽酸川芎嗪在冷暴露中尚未有研究。因此，試驗選擇鹽酸川芎嗪作為治療藥物，探究其在冷暴露條件下對小鼠肝臟產(chǎn)熱能力的影響，為提高畜禽冬季抗寒能力提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

4%多聚甲醛、蘇木精染色劑、伊紅染色劑、油紅O 染色試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、SDS-PAGE 制膠試劑盒、SDA-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5X）購自上海碧云天公司；蛋白marker、底物發(fā)光液、PVDF 膜購自美國MILLIPORE 公司；UCP1 兔多克隆抗體、β-Tublin 鼠單克隆抗體、HRP 標記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 購自美國Proteinch 公司。

1.2 實驗動物

4 周齡雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。將其隨機分為常溫對照組（N 組）、冷暴露組（CN 組）、冷暴露+50 mg·kg-1鹽酸川芎嗪組（C50 mg·kg-1組）以及冷暴露+100 mg·kg-1鹽酸川芎嗪組（C100 mg·kg-1組），每組10 只，晝夜交替光照12 h，自由飲水，室溫（26±1）℃預(yù)飼一周后對加藥組小鼠進行相應(yīng)濃度的灌胃，灌胃組在灌胃結(jié)束后與冷暴露組一起每天置于4 ℃人工氣候室中冷刺激3 h，4 周后處死小鼠，并采集肝臟組織。

1.3 HE 染色

將肝臟組織固定于4%多聚甲醛緩沖液，置于包埋盒中，流水沖洗30 min，利用不同濃度的酒精脫水，在二甲苯溶液中使組織透明后，將透明組織放在石蠟中，包埋后進行切片。染色前，采用二甲苯溶液脫蠟后，放入從高到低濃度的酒精中，再用蒸餾水清洗。將切片置于蘇木精染液中幾分鐘，然后放于鹽酸乙醇和氨水中各30 s 進行分色，再用伊紅染色液染色2~3 min，再通過不同濃度的酒精脫水，利用二甲苯溶液透明后封片。在×200 放大倍率下觀察各組肝臟是否有損傷。

1.4 油紅O 染色

取肝臟組織，將其包埋在OCT 化合物中，并置于-80 ℃條件下保存。利用冰凍切片機以10 μm 的厚度切割組織。采用異丙醇配制0.5%的油紅O 原液，工作濃度60%用DDH2O 稀釋。用60%異丙醇對切片進行洗滌，用油紅O 工作液染色1 h，染色完成后用自來水沖洗切片20 min。在×200 放大倍率下對各組肝臟中脂滴數(shù)量進行觀察。

1.5 UCP1 免疫組織化學法檢測

將固定后的肝臟組織進行固定和脫水處理，將處理后的組織包埋在石蠟中，包埋后的肝臟組織用切片機切成5 μm 厚的切片，將處理后的切片進行脫蠟和抗原修復(fù)。處理完畢后，對切片進行血清封閉然后加一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后加入二抗37 ℃孵育30 min，二抗孵育結(jié)束后加入SABC 37 ℃孵育30 min，孵育結(jié)束后加入顯色劑，將顯色后的切片加入蘇木精復(fù)染，復(fù)染結(jié)束后進行脫水和封片。

1.6 UCP1 蛋白表達水平的檢測

用RIPA 提取肝臟組織中的總蛋白質(zhì)，提取后在4 ℃和12 000RCF 的條件下離心10 min。離心結(jié)束后收集上清液用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液使其變性。將每個樣品等量的加入SDS-PAGE 凝膠上并進行電泳。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h，封閉結(jié)束后孵育一抗（1∶1 000）8 h，加入HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗鼠（1∶10 000 稀釋）孵育1 h。用ChemiDoc XRS+（Bio-Rad，USA）凝膠成像系統(tǒng)檢查印跡，并用Image-J 軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值。

1.7 統(tǒng)計學分析

利用Graphpad-prism8.0 進行統(tǒng)計分析和繪圖，采用單因素方差分析方法分析數(shù)據(jù)，結(jié)果采用平均數(shù)±標準差進行表示（±s），P＜0.05 表示差異具有顯著性；P＜0.01 表示差異具有極顯著性；P＜0.001 表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠肝臟組織病理變化

HE 染色結(jié)果如圖1 所示。經(jīng)觀察，各組肝細胞形態(tài)正常、染色均勻，小鼠肝臟組織并未出現(xiàn)炎性浸潤等炎癥現(xiàn)象，鹽酸川芎嗪并未引起肝臟損傷。說明試驗所選的鹽酸川芎嗪添加濃度屬于安全范圍。

圖1 小鼠肝臟組織HE 染色形態(tài)圖（×200）Fig.1 HE staining morphology of liver tissue in mice（×200）

2.2 小鼠肝臟組織脂滴數(shù)量變化

油紅O 染色結(jié)果如圖2 所示，冷暴露條件下添加鹽酸川芎嗪后，C50 mg·kg-1組脂滴數(shù)大量增多，CN組相對于N 組脂滴少量增多，C100 mg·kg-1組相對于CN 組脂滴數(shù)少量增多。說明冷暴露下添加鹽酸川芎嗪后大量脂質(zhì)如甘油三酯等轉(zhuǎn)運至肝臟中，可提高機體的脂質(zhì)代謝，進而使機體產(chǎn)生熱量以維持體溫。

圖2 小鼠肝臟組織油紅O 染色形態(tài)圖（×200）Fig.2 Morphological map of oil red O staining in mouse liver tissue（×200）

2.3 UCP1 的IHC 結(jié)果

IHC（圖3）結(jié)果顯示，冷暴露條件下添加鹽酸川芎嗪后，小鼠肝臟組織中的UCP1 表達量提高，其中C50 mg·kg-1組的表達量最高，說明添加鹽酸川芎嗪可促進小鼠肝臟組織產(chǎn)熱。

圖3 小鼠肝臟組織IHC 結(jié)果圖（×200）Fig.3 IHC results of mouse liver tissue（×200）

2.4 UCP1 蛋白表達水平

通過Western Blot 對產(chǎn)熱關(guān)鍵蛋白UCP1 進行了檢測，結(jié)果如圖4 所示。相較于CN 組，C50 mg·kg-1組及C100 mg·kg-1組小鼠肝臟中的UCP1 均有顯著升高，其中C50 mg·kg-1組升高更多。由此可見，添加鹽酸川芎嗪可以提高肝臟產(chǎn)熱蛋白表達，促進肝臟產(chǎn)熱來維持體溫。

圖4 Western blot 檢測各組肝臟中UCP1 蛋白表達水平Fig.4 The expression of UCP1 protein in liver of each group detected by western blot

3 討論

寒冷是北方冬季氣候的代名詞，冷應(yīng)激是北方一種常見的應(yīng)激源。冷應(yīng)激會給動物的生長繁殖、免疫功能、生產(chǎn)性能等方面帶來許多不良影響。當動物受到冷應(yīng)激刺激時，作為一個整體，機體會通過神經(jīng)—內(nèi)分泌途徑對體內(nèi)全部的器官和組織進行動員，以應(yīng)對寒冷應(yīng)激源帶來的刺激。如交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)經(jīng)過一系列反應(yīng)會使兒茶酚胺類激素分泌增多，從而促進機體分解肝糖原、肌糖原和脂肪來升高血糖，去甲腎上腺素還會收縮血管減少散熱；下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸也會發(fā)生正反饋調(diào)節(jié)，其中皮質(zhì)醇會通過加強代謝、加快糖異生、促進脂肪分解和脂肪酸氧化等來增加機體產(chǎn)熱；下丘腦—垂體—甲狀腺軸中甲狀腺激素能促進三大物質(zhì)代謝來增加產(chǎn)熱[21]。雖然在不斷進化和適應(yīng)環(huán)境的過程中，很多動物都擁有了一定的抗寒能力，但仍有許多畜禽因自身所產(chǎn)生的熱量無法抵御周圍的低溫環(huán)境或受到其他因素影響而經(jīng)歷寒冷所帶來的病痛，甚至走向死亡。因此，冷應(yīng)激仍應(yīng)受到重視。

TMP 已被驗證在治療心腦血管疾病和保護肝臟等方面具有一定作用，TMP 可通過抑制炎癥因子和p—NF—κB/ROS 信號通路，對高脂飲食所引發(fā)的非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟產(chǎn)生保護作用[22]和對反式脂肪酸所導致的大鼠肝臟損傷具有較好的保護效果[23]。機體暴露在寒冷中會引起特定的急性和慢性生理反應(yīng)[24]，TMP 可以減少砷誘導的活性氧（ROS）的產(chǎn)生、提高谷胱甘肽（GSH）的水平、防止線粒體功能出現(xiàn)障礙、抑制促炎信號的激活以及抑制自噬和細胞凋亡的發(fā)展，結(jié)合試驗結(jié)果來看，小鼠肝臟并未出現(xiàn)損傷現(xiàn)象，這與前人研究基本一致。肝臟是甘油三酯（TG）的主要合成場所，冷暴露會增強機體物質(zhì)代謝，因此機體生成的TG 也會隨之增多。同時，甘油三酯是機體內(nèi)重要的儲能物質(zhì)，其儲量最大、產(chǎn)能也最多，在油紅O 染色結(jié)果中可見冷暴露條件下的肝臟脂滴數(shù)量都有所增加，其中C50 mg·kg-1組脂滴數(shù)最多，說明冷暴露下添加鹽酸川芎嗪可以提高肝臟的產(chǎn)熱能力。

UCP1 是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，屬于線粒體載體家族。當UCP1 被激活時，它會使線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子濃度差被消除，減慢氧化磷酸化過程，使三磷酸腺苷（ATP）的形成受阻，從而將營養(yǎng)能量直接轉(zhuǎn)化為熱量，以增加機體產(chǎn)熱。UCP1 特異性表達存在于線粒體內(nèi)膜，通過解偶聯(lián)氧化磷酸化產(chǎn)熱，而其產(chǎn)熱受冷暖中樞的興奮調(diào)控[25]。與此同時下丘腦通過與攝食中心連接到相對應(yīng)產(chǎn)熱系統(tǒng)中，以控制體溫和體重調(diào)節(jié)。

UCP1 可通過高效能的介導其質(zhì)子滲漏，使質(zhì)子梯度中貯存的勢能轉(zhuǎn)化成熱能而散失，并增加機體的非震顫性產(chǎn)熱，為動物保溫、御寒以及維持高等哺乳動物恒定的體溫，還可預(yù)防因能量代謝不平衡帶來的Ⅱ型糖尿病和肥胖癥。雖然體力活動可消耗多余能量，但多余的能量會通過線粒體UCP1 解偶聯(lián)棕色脂肪細胞氧化磷酸化，轉(zhuǎn)化為保護自身免受低溫影響的生熱系統(tǒng)。此外，UCP1 可與游離脂肪酸相互作用催化質(zhì)子從線粒體膜間到基質(zhì)的熱生成凈轉(zhuǎn)移，盡管在大型哺乳動物中所占的比重較低，但其對小型哺乳動物的靜息能量消耗和體重調(diào)節(jié)都起到重要的作用[26]。研究結(jié)果顯示，在添加了鹽酸川芎嗪后，小鼠肝臟組織UCP1 的表達量顯著提高。結(jié)合油紅O染色結(jié)果分析，冷暴露環(huán)境下添加鹽酸川芎嗪后，可促進機體的脂質(zhì)代謝，甘油三酯等物質(zhì)大量轉(zhuǎn)運至肝臟，提高了肝臟的產(chǎn)熱能力。同時，鹽酸川芎嗪還具有效果穩(wěn)定，抑制炎性發(fā)生發(fā)展和氧化應(yīng)激的損傷的特點。通過添加鹽酸川芎嗪來應(yīng)對北方畜牧業(yè)所遭受的冷應(yīng)激損失，可能是一個安全又有效的方法。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，冷暴露下鹽酸川芎嗪能夠顯著提高UCP1 的表達水平，促進小鼠肝臟產(chǎn)熱，其中C50 mg·kg-1組的效果最強，為提高畜禽的抗寒能力，降低冷應(yīng)激對北方畜牧業(yè)發(fā)展的影響提供了一定的參考。