高玲玲 謝至 林首恒 呂志異 周文斌 陳冀 朱琳琳 張莉 曾鵬輝 黃曉丹 顏文青 陳宇 盧丹霞 張水蓮 郭偉浜 李鵬 張緒超

肺癌是高發(fā)病率和高死亡率的主要癌種。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）在肺癌病例中占比約為85%[1]。肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要因素之一，而在NSCLC患者中，肝臟是最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一，據(jù)報(bào)道晚期NSCLC患者中肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率約為20%[2,3]，與其他器官轉(zhuǎn)移相比，晚期肝轉(zhuǎn)移患者死亡率最高[4]，且預(yù)后較差，中位生存期（overall survival, OS）僅約7個(gè)月[5]。肝轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響NSCLC患者的生存和預(yù)后。因此，深入探索NSCLC發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于探索肺癌肝轉(zhuǎn)移的治療策略具有重要意義。

SWI/SNF復(fù)合體（switch/sucrose nonfermentable chromatin-remodeling complex, SWI/SNF）是細(xì)胞內(nèi)重要的染色質(zhì)重塑相關(guān)的多組分復(fù)合物，主體構(gòu)架由SMARCD、SMARCB1和SMARCC組成，SMARCA2/4為ATP酶，其余亞基分別組裝在支架上形成多亞基復(fù)合體。復(fù)合體有三種亞型：cBAF（canonical BRM/BRG1-associated factor）、PBAF（polybromo-associated BAF）和ncBAF（non-canonical BAF），其中ARID1A/ARID1B為cBAF獨(dú)有亞基[6]。SWI/SNF復(fù)合體利用ATP水解產(chǎn)生的能量介導(dǎo)核小體的重新定位、改變核小體結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生染色質(zhì)重塑來(lái)改變?nèi)旧|(zhì)的可及性，從而調(diào)控基因表達(dá)[7]。肺癌及其他多個(gè)類(lèi)型的腫瘤中SWI/SNF復(fù)合體基因的突變頻率相對(duì)較高[8,9]，這些基因突變可能導(dǎo)致復(fù)合體功能喪失或改變，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10-13]。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，轉(zhuǎn)移瘤中能夠檢測(cè)到原發(fā)灶中不存在的其他突變，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)通常與獲得額外的驅(qū)動(dòng)突變有關(guān)[14]。SWI/SNF復(fù)合體變異在腫瘤進(jìn)展中具有組織環(huán)境特異性作用[15,16]。在不同腫瘤中，SWI/SNF對(duì)于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的影響可能存在差異。例如在肝細(xì)胞癌中，ARID1A在原發(fā)性腫瘤中高表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移性病灶中ARID1A表達(dá)降低或缺失可能與遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)[16]。而SMARCA4缺失可能與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。但SWI/SNF復(fù)合體基因突變與肺癌肝轉(zhuǎn)移研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬開(kāi)展SWI/SNF復(fù)合體基因突變與肺癌肝轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系及其分子機(jī)制的研究，為探索疾病機(jī)制及治療相關(guān)新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌細(xì)胞系NCI-H460、NCI-H23和NCI-H1299均來(lái)自于廣東省肺癌研究所細(xì)胞庫(kù)，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行STR鑒定（上海富衡生物），同時(shí)使用Takara支原體檢測(cè)試劑盒（CY232）進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞系正確且無(wú)支原體污染后，使用RPMI Medium 1640 basic（1×）培養(yǎng)基（Gibco）和10%胎牛血清（Gibco, 1932594C）于5% CO2、37oC無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞DNA提取及全外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing, WES） 采用細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech, DP304）提取細(xì)胞DNA。使用吉因加Gene+Seq-2000進(jìn)行WES檢測(cè)細(xì)胞基因突變狀態(tài)。

1.3 細(xì)胞R N A 提取及測(cè)序 使用R N A 提取試劑盒（QIAGEN RNeasy Mini Kit, 74104 and 74106）提取細(xì)胞RNA。吉因加公司采用真核RNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用高通量測(cè)序儀（Illumina NovaSeq6000）對(duì)3株肺癌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用BCA試劑盒（Solarbio,PC0020）檢測(cè)蛋白濃度。使用One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（6%）（Vazyme, E301-01）凝膠進(jìn)行電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜（0.45 μm, Thermo ScientificTM, 88518），TBST（Absin, abs952-1L）洗膜，脫脂奶粉（Solarbio,D8340）封閉90 min，4oC過(guò)夜孵育一抗：ARID1A（1:1000,CST, 12354S），ARID1B（1:1000, CST, 92964），SMARCA4（1:10000, Abcam, ab110641），SMARCA2（1:1000, CST,11966），ARID2（1:1000, CST, 82342），PBRM1（1:1000,CST, 38439），Vinculin（1:1000, CST, 13901S），APOBEC3B（1:500, Proteintech, 14559-1-AP），ALDH1A1（1:1000,CST, 54135）。TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h：Anti-rabbit IgG（1:2000, CST, 7074），使用Clarity Max Western ECL Substrate（BIO-RAD, 1705062）顯影液顯影，用ImageJ軟件計(jì)算分析條帶灰度值。

1.5 病毒包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)染示蹤細(xì)胞模型構(gòu)建 使用293T細(xì)胞和Lipofectamine 2000（InvitrogenTM, 11668030）以及包裝質(zhì)粒體系：pWPXLd-luciferase-EGFP（中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）9 μg+質(zhì)粒psPAX2（addgene,12260）12 μg+PMD 2 g（addgene, 12259）3 μg進(jìn)行GL（EGFP+Luciferase）病毒包裝，使用成功包裝的GL病毒和1×polybrene（GLPBIO, GC19206）對(duì)NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.6ARID1A基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株構(gòu)建 NCI-H1299細(xì)胞系來(lái)自于廣東省肺癌研究所細(xì)胞庫(kù)，使用在線CRISPR設(shè)計(jì)工具（https://en.rc-crispr.com/）設(shè)計(jì)用于ARID1A敲除的sgRNA，將兩個(gè)靶向位點(diǎn)的寡核苷酸進(jìn)行退火并連接到Y(jié)KO-RP006載體上（Ubigene Biosciences），使用NeonTM轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）將含有目標(biāo)sgRNA序列的YKO-RP006-hTFEB [gRNA]質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24-48 h后加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，抗性篩選后使用有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，篩選出的ARID1A-KO克隆通過(guò)PCR、Sanger測(cè)序和Western blot進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health, NIH）《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動(dòng)物護(hù)理和使用指南委員會(huì)批準(zhǔn)。6-8周齡同性別NSI小鼠（中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）隨機(jī)分組進(jìn)行NSCLC細(xì)胞左心室注射，每組6只，至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。使用1.25%阿佛?。ㄒ缀耍琈2910）經(jīng)腹腔注射進(jìn)行麻醉。監(jiān)測(cè)小鼠活動(dòng)、飲食和體重，使用D-Luciferin、Sodium Salt D-熒光素鈉鹽（YEASEN, 40901ES01）進(jìn)行小動(dòng)物活體成像檢測(cè)腫瘤細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度，晚期使用球后靜脈空氣注射行安樂(lè)死。觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，肝臟在4%多聚甲醛固定液中固定24 h，沖洗30 min，保存在75%酒精中。

1.8 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色和免疫組化（immunohistochemistry, IHC）分析 標(biāo)本固定后，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色和IHC分析。提前1天進(jìn)行烤片，次日脫蠟水化后用抗原修復(fù)液（GTR, GT100411）120oC修復(fù)3 min，冷卻后3% H2O2孵育10 min消除內(nèi)源性酶。PBS浸洗后，5% BSA（Solarbio, A8010）室溫封閉1 h，隨后室溫孵育一抗1 h：載脂蛋白質(zhì)B mRNA編輯催化亞基3B（apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B, APOBEC3B）（Proteintech, 14559-1-AP, 1:150），醛脫氫酶家族1A1（aldehyde dehydrogenase 1 family member A1,ALDH1A1）（CST, 54135, 1:200）。PBS浸洗后，IHC二抗試劑盒（Absin, abs996）室溫孵育30 min，PBS浸洗后，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染，透明后用中性樹(shù)脂封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度，利用H-score進(jìn)行蛋白表達(dá)水平分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，使用GraphPad Prism（V.9.0）和RStudio軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和可視化作圖。滿足正態(tài)分布且方差齊兩組獨(dú)立變量之間的比較采用Student 'st檢驗(yàn)，多組獨(dú)立變量比較采用One-way ANOVA單因素方差分析。若變量不服從正態(tài)分布，則采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P<0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞株SWI/SNF復(fù)合體基因突變分析及攜帶示蹤報(bào)告基因細(xì)胞模型建立 為了解細(xì)胞中SWI/SNF復(fù)合體基因突變情況，我們對(duì)H1299、H23和H460細(xì)胞進(jìn)行了WES分析，結(jié)果顯示，在SWI/SNF重要的6個(gè)亞基中，H460僅存在ARID1A功能失活突變（In_Frame_Del），H23同時(shí)出現(xiàn)了SMARCA2功能失活突變（In_Frame_Del）、ARID2錯(cuò)義突變（Missense_Mutation）以及SMARCA4功能失活突變（Nonsense_Mutation）和錯(cuò)義突變（Missense_Mutation）；H1299細(xì)胞未檢測(cè)到任何SWI/SNF復(fù)合體基因突變（表1）。Western blot分析顯示，H1299細(xì)胞中SM A RCA4蛋白表達(dá)水平較低，其余亞基蛋白表達(dá)正常，H 23細(xì)胞中AR ID1A、AR ID1B和SM ARCA2蛋白表達(dá)缺失，SMARCA4、ARID2和PBRM1蛋白表達(dá)水平較低，而H460細(xì)胞中僅觀察到SMARCA2蛋白的表達(dá)，其余5個(gè)亞基的蛋白均未被檢測(cè)到（圖1A）。為順利進(jìn)行小動(dòng)物活體成像，我們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了攜帶GL（EGFP+Luciferase）基因的慢病毒感染，使其成功表達(dá)了EGFP和螢火蟲(chóng)熒光素酶，圖1B展示了感染效率大于90%的細(xì)胞圖像。

表1 H1299、H23和H460細(xì)胞中SWI/SNF復(fù)合體基因突變情況Tab 1 Molecular mutation of SWI/SNF genes in cells of H1299, H23 and H460

圖1 SWI/SNF復(fù)合體基因突變、蛋白表達(dá)和病毒感染的細(xì)胞特征分析。A：SWI/SNF基因蛋白表達(dá)水平；B：H1299、H23和H460細(xì)胞感染EGFP-Luciferase病毒后照片F(xiàn)ig 1 Comprehensive analysis of SWI/SNF gene mutations, protein expression and viral infection. A: Protein expression levels of SWI/SNF genes in cells of H1299, H23 and H460; B: Images of EGFP-Luciferase-infected H1299, H23 and H460 cells. SWI/SNF: switch/sucrose nonfermentable chromatin-remodeling complex; EGFP: enhanced green fluorescent protein.

2.2 SWI/SNF復(fù)合體變異細(xì)胞在NSI小鼠體內(nèi)促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移發(fā)生 為探索不同SWI/SNF復(fù)合體基因突變狀態(tài)的肺癌細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的肝轉(zhuǎn)移情況，我們通過(guò)左心室注射H1299、H23和H460細(xì)胞建立了肺癌肝轉(zhuǎn)移模型，生物活體發(fā)光成像監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)SWI/SNF復(fù)合體基因野生型細(xì)胞H1299組的小鼠均未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移（0.0%），SWI/SNF復(fù)合體基因突變的細(xì)胞中H23組小鼠肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率為75.0%，而H460組所有小鼠均發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移（100.0%），圖2A是代表性活體成像照片。分析肝臟中腫瘤細(xì)胞負(fù)荷發(fā)現(xiàn)：在H460組小鼠疾病終末期即左心室注射后第14天，ARID1A失活突變的H460與SWI/SNF復(fù)合體野生型H1299（P<0.0001）和SMARCA2/4失活突變的H23（P<0.001）相比，轉(zhuǎn)移到肝臟的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷更高，而在第28天，H23轉(zhuǎn)移到肝臟的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷也顯著高于H1299（P<0.001）。且隨著時(shí)間的推移，與H1299相比，H23和H460組小鼠轉(zhuǎn)移到肝臟中的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷逐漸增多（P<0.001，圖2B）。

圖2 SWI/SNF復(fù)合體基因突變對(duì)免疫缺陷小鼠肺癌肝轉(zhuǎn)移的影響。左心室內(nèi)注射H1299、H23和H460細(xì)胞后的活體生物發(fā)光圖像（A）、小鼠肝臟熒光信號(hào)值強(qiáng)度和變化趨勢(shì)（B）、小鼠體重隨時(shí)間變化趨勢(shì)（C）和各組小鼠生存時(shí)間比較（D）；各組小鼠肝臟解剖學(xué)觀察（E）和肝臟組織HE染色（F）。***：P<0.001；****：P<0.0001。Fig 2 The effects of SWI/SNF complex gene mutations in the incidence of liver metastasis in immune-deficient mice with lung cancer.Representative ex vivo bioluminescence images (A), intensity and change trend of fluorescence signal in liver (B), the change of body weight over time (C) and comparison of survival time (D) of mice in each group after intracardiac injections with H1299, H23 and H460 cells. Anatomical observation (E) and representative images (F) of HE staining of liver in mice of each group. HE: hematoxylin-eosin. ***: P<0.001; ****: P<0.0001.

記錄小鼠體重變化情況發(fā)現(xiàn)，與H 1 2 9 9 和H 2 3相比，H4 6 0組小鼠體重隨時(shí)間變化呈明顯下降趨勢(shì)（P=0.0101），特別是左心室注射腫瘤細(xì)胞后的第14天，H460組小鼠體重下降趨勢(shì)最為顯著（圖2C）。生存分析顯示，與H1299和H23組小鼠相比，H460組小鼠OS顯著縮短（P=0.0015），中位OS僅14天，而H1299和H23組小鼠在觀察截止時(shí)間點(diǎn)仍存活（圖2D）。

解剖學(xué)觀察顯示H1299組小鼠肝臟未見(jiàn)腫瘤病灶，H23組75%的小鼠肝臟可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶，而H460組小鼠肝臟中均可觀察到轉(zhuǎn)移灶且數(shù)量明顯多于H23組小鼠（圖2E）。小鼠肝臟石蠟標(biāo)本連續(xù)切片后HE染色結(jié)果顯示：H1299組小鼠肝臟切片在鏡下仍未觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移灶，H23組小鼠中有75.0%的個(gè)體顯示肝臟存在腫瘤轉(zhuǎn)移灶，而H460組小鼠所有肝臟切片均觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移灶且數(shù)量最多，圖2F為HE染色的代表性圖像。

2.3ARID1A基因敲除細(xì)胞在NSI小鼠體內(nèi)促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移發(fā)生 利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）基因編輯技術(shù)構(gòu)建了ARID1A基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株H1299 sgARID1A。Western blot分析ARID1A蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示H1299 sgARID1A細(xì)胞中ARID1A蛋白表達(dá)缺失，而H1299正常對(duì)照（normal control, NC）組細(xì)胞中ARID1A蛋白正常表達(dá)（圖3A）。隨后，對(duì)兩株細(xì)胞進(jìn)行了攜帶GL基因的慢病毒感染，使其成功表達(dá)EGFP和螢火蟲(chóng)熒光素酶，挑選感染效率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（圖3B）。

圖3 H1299細(xì)胞中敲除ARID1A基因?qū)Ψ伟└无D(zhuǎn)移的影響。Western blot分析轉(zhuǎn)染vector或sgARID1A的H1299中SWI/SNF基因蛋白表達(dá)水平（A）；感染EGFP-Luciferase病毒后的細(xì)胞圖像（B）；左心室內(nèi)注射H1299 NC和H1299 sgARID1A細(xì)胞后的活體生物發(fā)光圖像（C）、小鼠肝臟熒光信號(hào)值強(qiáng)度和變化趨勢(shì)（D）、小鼠體重隨時(shí)間變化趨勢(shì)（E）和各組小鼠生存時(shí)間（F）比較；各組小鼠肝臟解剖學(xué)觀察（G）和肝臟組織HE染色（H）。*：P<0.05；***：P<0.001。Fig 3 The impact of ARID1A knockout in H1299 cells on liver metastasis in lung cancer. Western blot analysis of protein expression levels of SWI/SNF genes in H1299 transduced with either vector or sgARID1A (A); Images of EGFP-Luciferase-infected H1299 NC and H1299 sgARID1A cells (B);Representative ex vivo bioluminescence images (C), Intensity and change trend of fluorescence signal in liver (D), The change of body weight over time (E) and comparison of survival time of mice (F) in each group after intracardiac injections with H1299 NC and H1299 sgARID1A cells;Anatomical observation (G) and representative images of HE staining of liver (H) in mice of each group. NC: normal control. *: P<0.05; ***: P<0.001.

使用H1299 NC和H1299 sgARID1A細(xì)胞經(jīng)NSI小鼠左心室注射建立肺癌肝轉(zhuǎn)移模型，活體成像顯示H1299 NC組小鼠均未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，而H1299 sgARID1A組小鼠全部發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移（圖3C）。肝臟腫瘤細(xì)胞負(fù)荷分析顯示H1299sgARID1A組小鼠在左心室注射后第14天（P<0.001）和第21天（P=0.010）的肝臟腫瘤細(xì)胞負(fù)荷均顯著高于H1299 NC組小鼠，隨著時(shí)間的推移H1299 sgARID1A組小鼠轉(zhuǎn)移到肝臟中的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷也在逐漸增多（圖3D）。與H1299 NC組相比，H1299 sgARID1A組小鼠體重隨時(shí)間變化呈明顯下降趨勢(shì)，特別是在腫瘤終末期（P=0.0038，圖3E）。生存分析顯示，與H1299 NC組相比，H1299 sgARID1A組小鼠OS也顯著縮短（P=0.0017，圖3F）。

H1299 NC組小鼠肝臟肉眼未見(jiàn)腫瘤病灶，H1299 sgARID1A組所有小鼠肝臟均可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶（圖3G）。小鼠肝臟石蠟標(biāo)本連續(xù)切片后HE染色結(jié)果顯示：H1299 NC組小鼠肝臟切片在鏡下仍未觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移灶，H1299 sgARID1A組小鼠所有個(gè)體均顯示肝臟存在腫瘤轉(zhuǎn)移灶（圖3H）。

2.4 SWI/SNF復(fù)合體基因突變調(diào)節(jié)ALDH1A1和APOBEC3B的表達(dá) 為探索SWI/SNF復(fù)合體基因突變對(duì)肺癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響和其可能的促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制改變，我們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了RNA-Seq和差異基因表達(dá)分析，SWI/SNF突變細(xì)胞H23和H460相較于野生型細(xì)胞H1299有3417個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，2554個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，與H1299 NC相比，H1299 sgARID1A細(xì)胞有4204個(gè)基因上調(diào)，3171個(gè)基因下調(diào)，這些表達(dá)的變化呈現(xiàn)在火山圖中（圖4A和圖4B），將兩組差異基因取交集后得到共同上調(diào)的基因1628個(gè)和共同下調(diào)的基因1127個(gè)（圖4C）。差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析顯示SWI/SNF復(fù)合體基因突變和野生型細(xì)胞間的基因表達(dá)譜存在顯著差異，其中ALDH1A1和APOBEC3B是比較重要的與肺癌細(xì)胞干性、腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，H460和H1299 sgARID1A中ALDH1A1顯著高表達(dá)，APOBEC3B在H23和H1299 sgARID1A中表達(dá)較高，其次為H460，而在H1299中不表達(dá)（圖4D）。Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，ALDH1A1蛋白僅在H460中高表達(dá)，在H1299和H23中均不表達(dá)，但APOBEC3B的表達(dá)在三者之間未觀察到顯著差異（圖4E）。而相比于H1299 NC細(xì)胞，ALDH1A1和APOBEC3B均在H1299 sgARID1A中表達(dá)較高（圖4F）。

圖4 SWI/SNF復(fù)合體基因突變影響肺癌肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。A：SWI/SNF復(fù)合體突變細(xì)胞H23和H460與SWI/SNF野生型細(xì)胞H1299相比的差異基因表達(dá)火山圖；B：H1299 NC與H1299 sgARID1A相比的差異基因火山圖；C：兩組上調(diào)（上）和下調(diào)（下）的差異基因交集；D：差異基因表達(dá)熱圖；E，F(xiàn)：Western blot分析重要差異表達(dá)基因在細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)水平。Fig 4 Molecular mechanisms of lung cancer metastasis induced by the gene mutations of SWI/SNF complex. A: Clustering volcano plot of differential gene expression in SWI/SNF-mut (H23 and H460) and SWI/SNF-wt group (H1299); B: Clustering volcano plot of differential gene expression in H1299 sgARID1A and H1299 NC cells; C: Intersection of up-regulated (up) and down-regulated (down) differential genes in two groups; D: Clustering heat map of differentially expressed genes; E, F: Protein analyses by Western blot for important differentially expressed genes in cell. ALDH1A1: aldehyde dehydrogenase 1 family member A1; APOBEC3B: apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B.

2.5 SWI/SNF復(fù)合體基因突變的肝轉(zhuǎn)移灶中ALDH1A1和APOBEC3B蛋白表達(dá)水平分析 為進(jìn)一步驗(yàn)證SWI/SNF復(fù)合體基因突變對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及其在增加肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率中的作用機(jī)制，我們通過(guò)IHC染色評(píng)估了差異基因ALDH1A1和APOBEC3B在小鼠肝轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織中的蛋白表達(dá)水平。

H1299組小鼠肝臟中無(wú)轉(zhuǎn)移灶，經(jīng)IHC驗(yàn)證，ALDH1A1和APOBEC3B蛋白分別在H23和H460組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)與RNA-Seq結(jié)果一致。ARID1A失活突變的H460組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶中ALDH1A1的蛋白表達(dá)水平顯著高于SMARCA2/4失活突變的H23組（158.5vs0.0，P<0.0001，圖5A），APOBEC3B蛋白在SWI/SNF復(fù)合體基因突變的兩組細(xì)胞H460和H23組小鼠的肝轉(zhuǎn)移灶中均有表達(dá)，但其表達(dá)水平在兩組間未見(jiàn)顯著差異（13.0vs10.0，P=0.847，圖5B）?？梢?jiàn)在SWI/SNF復(fù)合體基因突變的細(xì)胞中，ARID1A失活突變的細(xì)胞H460可能主要通過(guò)上調(diào)ALDH1A1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，而SMARCA2/4失活突變的細(xì)胞H23發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與APOBEC3B的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

圖5 SWI/SNF復(fù)合體基因突變對(duì)肝轉(zhuǎn)移灶中ALDH1A1和APOBEC3B蛋白表達(dá)水平的影響。H23和H460組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶A(yù)LDH1A1（A）和APOBEC3B（B）分子免疫組化染色代表圖以及H_Score統(tǒng)計(jì)分析；H1299 sgARID1A組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶A(yù)LDH1A1和APOBEC3B分子免疫組化染色代表圖（C）。****：P<0.0001；ns：無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Fig 5 ALDH1A1 and APOBEC3B protein expression levels in liver metastases are affected by the gene mutations of SWI/SNF. Representative images of IHC staining of ALDH1A1 (A) and APOBEC3B (B), and bar plots showing their expression in in liver metastases of H23 and H460 groups; Representative images of IHC staining of ALDH1A1 and APOBEC3B in liver metastases of H1299 sgARID1A group (C). Scale bars, 200 μm,magnification at ×4; scale bars, 50 μm, magnification at ×20. IHC: immunohistochemistry; ****: P<0.0001; ns: no statistical differences.

H1299 NC組小鼠肝臟也無(wú)轉(zhuǎn)移灶，經(jīng)IHC染色發(fā)現(xiàn)，ALDH1A1蛋白在H1299 sgARID1A組小鼠肝臟轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，而APOBEC3B蛋白也在H1299 sgARID1A組小鼠肝轉(zhuǎn)移灶中有表達(dá)（圖5C），提示在H1299 sgARID1A細(xì)胞中ARID1A基因缺失也可能通過(guò)上調(diào)ALDH1A1的表達(dá)而促進(jìn)小鼠肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

3 討論

隨著對(duì)SWI/SNF復(fù)合體在癌癥中作用的認(rèn)知加深，亟需適宜的臨床前模型以探究其突變與臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)。我們鑒定了常見(jiàn)肺癌細(xì)胞系及其SWI/SNF復(fù)合體基因突變圖譜，從基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白水平進(jìn)行分析，為細(xì)胞模型的選擇和研究突變與臨床觀察結(jié)果關(guān)系的研究提供了參考。本研究探索了免疫缺陷小鼠中SWI/SNF復(fù)合體基因突變?cè)诜伟└无D(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制，全外顯子組測(cè)序顯示H460僅存在ARID1A失活突變，H23同時(shí)存在SMARCA2/4的失活突變和ARID2錯(cuò)義突變，而H1299中未檢測(cè)到SWI/SNF復(fù)合體基因突變，與先前研究[17-19]數(shù)據(jù)一致，強(qiáng)調(diào)不同細(xì)胞中SWI/SNF復(fù)合體基因突變的異質(zhì)性，為深入探究其在肺癌發(fā)展中的作用提供線索。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)SWI/SNF復(fù)合體基因突變促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。突變型細(xì)胞H23和H460在小鼠體內(nèi)引發(fā)肝轉(zhuǎn)移，而野生型細(xì)胞H1299無(wú)肝轉(zhuǎn)移，其中H460組小鼠肝臟中腫瘤負(fù)荷高于H23組小鼠，突出了ARID1A失活突變影響肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，體重和生存監(jiān)測(cè)進(jìn)一步證實(shí)突變細(xì)胞導(dǎo)致了更嚴(yán)重的疾病進(jìn)展。而與親本細(xì)胞H1299 NC相比，ARID1A基因敲除的細(xì)胞H1299 sgARID1A也促進(jìn)了NSI小鼠肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，同時(shí)H1299 sgARID1A組小鼠也表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腫瘤進(jìn)展。SMARCA4或ARID1A缺失與多種癌癥進(jìn)程有關(guān)，如病理性MYC信號(hào)傳導(dǎo)、DNA修復(fù)缺陷和細(xì)胞周期控制受損[20-23]。盡管小鼠肺腺癌模型尚未詳細(xì)研究ARID1A失活突變的效應(yīng)，而SMARCA4失活突變可促進(jìn)已惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)，但其環(huán)境特異性效應(yīng)尚未完全闡明[24]。ARID1A突變?cè)谛∈竽[瘤模型和肺切除患者癌前病變中均存在，但在更晚期的腫瘤疾病中，ARID1A缺失也可能促進(jìn)疾病進(jìn)展[25]。

為了進(jìn)一步揭示SWI/SNF復(fù)合體基因突變對(duì)細(xì)胞表達(dá)譜的影響，本研究開(kāi)展了基于RNA-Seq的基因表達(dá)譜差異分析。突變型細(xì)胞H23和H460相對(duì)于野生型細(xì)胞H1299以及ARID1A基因敲除的細(xì)胞H1299 sgARID1A相對(duì)于親本細(xì)胞H1299 NC差異表達(dá)的基因調(diào)控了多個(gè)與腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因的表達(dá)，包括ALDH1A1和APOBEC3B。蛋白印跡和IHC染色結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了差異基因的蛋白產(chǎn)物表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為深入探究SWI/SNF復(fù)合體基因突變對(duì)肺癌細(xì)胞行為的影響提供了關(guān)鍵線索。

ALDH1A1參與細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)，與腫瘤干細(xì)胞特性、細(xì)胞遷移和侵襲及預(yù)后不良有關(guān)[26-29]。我們發(fā)現(xiàn)SWI/SNF復(fù)合體基因ARID1A失活突變與ALDH1A1高表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)，特別是H460細(xì)胞和ARID1A基因敲除的細(xì)胞H1299 sgARID1A引發(fā)的肝轉(zhuǎn)移灶中ALDH1A1表達(dá)顯著上調(diào)，可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)策略之一，提示ARID1A突變可調(diào)節(jié)ALDH1A1的表達(dá)，影響肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，這一發(fā)現(xiàn)為深入研究SWI/SNF復(fù)合體基因ARID1A與ALDH1A1的相互作用及其在肺癌轉(zhuǎn)移中的精細(xì)調(diào)控提供了新方向。既往研究[30-34]已經(jīng)提到了ALDH1A1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，ALDH1A1高表達(dá)與腫瘤患者的分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，尤其是在乳腺癌和消化道腫瘤中。研究[35]表明S100A9可在奧希替尼耐藥的肺癌細(xì)胞中上調(diào)ALDH1A1的表達(dá)并激活維甲酸（retinoic acid,RA）信號(hào)通路，而高表達(dá)胞內(nèi)S100A9的肺癌細(xì)胞可逃逸奧希替尼并引發(fā)腦轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)。同樣，ALDH1A1還可通過(guò)增強(qiáng)BRCA2卵巢癌細(xì)胞的DNA修復(fù)，促進(jìn)PARP抑制劑的耐藥性[36]。然而，對(duì)于ALDH1A1與SWI/SNF復(fù)合體基因突變之間的關(guān)聯(lián)，目前的研究仍有限。本研究初步證實(shí)了這一關(guān)聯(lián)，強(qiáng)調(diào)ALDH1A1在SWI/SNF復(fù)合體基因突變肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的潛在作用。APOBEC3B是APOBEC家族中的重要成員，該家族成員的酶活性對(duì)適應(yīng)性免疫和先天性免疫反應(yīng)都至關(guān)重要，而APOBEC3B的表達(dá)在多種癌癥尤其是NSCLC中上調(diào)，且基因組體細(xì)胞突變也更頻繁[37]，APOBEC相關(guān)突變?cè)贜SCLC發(fā)展的后期更多見(jiàn)，且與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[38,39]。我們的研究結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)APOBEC3B在SWI/SNF復(fù)合體基因尤其是ARID1A基因失活突變的細(xì)胞和肝轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)上調(diào)，提示了SWI/SNF復(fù)合體基因的突變可能也通過(guò)上調(diào)APOBEC3B的表達(dá)從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本研究揭示了SWI/SNF復(fù)合體基因突變能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。我們還發(fā)現(xiàn)了與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)的基因，SW I/SNF復(fù)合體基因突變可能經(jīng)由上調(diào)ALDH1A1和APOBEC3B的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。下一步擬詳細(xì)研究SWI/SNF復(fù)合體基因功能變異與ALDH1A1/APOBEC3B表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，為肺癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制闡述和潛在治療靶點(diǎn)探索提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Zhang XC conceived and designed the study. Gao LL, Lin SH, Xie Z and Lv ZY performed the experiments. Gao LL,Zhou WB, Chen J, Zhu LL, Zhang L, Huang XD and Zeng PH analyzed the data. Yan WQ, Chen Y, Lu DX, Zhang SL and Guo WB contributed analysis tools. Zhang XC and Li P provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.