肖平 鐘殿勝

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率居高不下的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占85%[1]。隨著靶向藥物、免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的飛速進(jìn)步，肺癌的治療格局發(fā)生了重大改變。與傳統(tǒng)的化療相比，靶向藥物、ICIs治療明顯延長了無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）。因此，尋求有效的靶點(diǎn)成為肺癌治療的重要決策。

鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF）在晚期NSCLC中的突變率為2%-6%[2-4]。BRAF突變患者預(yù)后差，生存期較短，靶向藥物的出現(xiàn)為這類患者帶來了希望。目前指南推薦達(dá)拉非尼聯(lián)合曲美替尼作為BRAFV600突變的晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的首選治療[5,6]。

BRAF除了突變之外，還可以發(fā)生斷裂重排，形成新的融合基因。BRAF融合最早在2005年在甲狀腺癌中被報(bào)道[7]，開啟了BRAF融合在腫瘤治療的探索。目前研究最多的是毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤，大約60%的毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤會(huì)出現(xiàn)BRAF融合[8]。隨著基因檢測的應(yīng)用，尤其是第二代測序技術(shù)的深入，越來越多BRAF融合在其他癌種中被發(fā)現(xiàn)。2017年斯隆-凱特林癌癥研究所（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, MSKCC）應(yīng)用MSK-IMPACT檢測方法，對10,000例晚期實(shí)體瘤患者進(jìn)行第二代測序，發(fā)現(xiàn)BRAF融合39例，其中NSCLC檢出率為0.38%，結(jié)腸癌為0.2%，乳腺癌為0.08%，胰腺癌為1.43%，前列腺癌為0.8%，膽囊癌為0.41%，卵巢癌為0.46%，膠質(zhì)瘤為0.78%，生殖細(xì)胞腫瘤為0.37%，軟組織腫瘤為0.46%[9]。融合基因可能是致癌的驅(qū)動(dòng)因素，也是靶向治療的潛在目標(biāo)。在NSCLC患者中，尤其表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）靶向藥物耐藥后的患者，BRAF融合的檢出逐漸增多，然而BRAF融合的治療仍參照非驅(qū)動(dòng)基因突變的患者，缺乏有效的治療策略，因此加強(qiáng)對BRAF融合的認(rèn)識并探索更加有針對性的治療方案勢在必行。本文就BRAF融合在NSCLC患者中的臨床特點(diǎn)、作用機(jī)制、臨床治療等方面進(jìn)行綜述，為BRAF融合的治療提供更多的選擇。

1 BRAF基因的生物學(xué)特征

BRAF是一種原癌基因，定位于7號染色體，包含18個(gè)外顯子，編碼BRAF蛋白。從N端到C端依次是高度保守區(qū)（conserved regions, CR）1、CR2和CR3三個(gè)CR，其中CR1區(qū)由RAS蛋白結(jié)合區(qū)和富含半胱氨酸區(qū)組成，可以與RAS-三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate, GTP）結(jié)合；CR2區(qū)富含絲氨酸/蘇氨酸，調(diào)節(jié)磷酸化RAF激酶活性；CR3區(qū)為三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）結(jié)合位點(diǎn)和激活區(qū)，含有酪氨酸和絲氨酸殘基及有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，磷酸化后可激活BRAF蛋白和誘導(dǎo)性激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）[10]。

BRAF作為RAS-RAF-MEK-ERK通路的上游調(diào)節(jié)因子，參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）通路的活化。當(dāng)細(xì)胞外生長因子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，活化膜結(jié)合蛋白RAS，活化的RAS蛋白使BRAF二聚化，并磷酸化激活MAPK激酶（MAPK kinase,MEK）進(jìn)一步激活ERK，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移。

依據(jù)是否具有激酶活性、對RAS活化的依賴性和RAF的二聚化特征，BRAF突變可分為I、II、III類[11]。其中，I類突變?yōu)榫哂懈呒っ富钚詥误w突變，不依賴RAS活性，且不需要二聚體來激活下游ERK通路，激活的ERK對RAS蛋白產(chǎn)生負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致RAS活性降低。I類突變主要發(fā)生于CR3（BRAF激酶結(jié)構(gòu)域）的外顯子11和15，以BRAFV600突變?yōu)榇怼I類突變?yōu)榫哂屑っ富钚缘亩垠w且不依賴RAS活化。這類突變使活化區(qū)與p-LOOP交互作用解除，解除激酶的自身抑制狀態(tài)。III類突變依賴RAS活化，通過野生型CRAF的二聚作用，激活信號，為無激酶活性的異源二聚體，具有高RAS-GTP活化水平[12]。

2 BRAF融合NSCLC臨床特點(diǎn)

在一項(xiàng)大樣本NSCLC患者研究[13]中，應(yīng)用Foundation Medicine CGP檢測17,128例患者的石蠟標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)42例BRAF融合，BRAF融合僅占0.2%，非常罕見。BRAF融合主要發(fā)生在肺腺癌患者中，中位年齡為67歲（范圍：44-93歲），55%為女性患者，48%在原發(fā)灶檢出，52%在轉(zhuǎn)移灶檢出。與BRAF融合基因共存的常見驅(qū)動(dòng)基因包括TP53（67%）、CDK N2A（31%）、EGFR（29%）和CDK N2B（26%）[13]。BR A F融合患者的腫瘤突變負(fù)荷（t umor mutational burden, TMB）較低，中位數(shù)為3.8 mut/Mb，其中7%（3/42）的患者TMB>20 mut/Mb，35%（15/42）的患者TMB在6.1-19.9 mut/Mb，57%（24/42）的患者TMB在0-6 mut/Mb[13]。

在EGFR突變患者中，應(yīng)用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）耐藥后，BRAF融合檢出率為1%-2%[14-16]。BRAF融合的出現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)胞MEK、ERK通路的磷酸化增加，下游MAPK信號通路組成性激活，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對抗EGFR靶向治療的敏感性，揭示BRAF融合為EGFR-TKIs獲得性耐藥的一種機(jī)制。Peng等[17]在中國EFGR突變?nèi)巳褐?，發(fā)現(xiàn)EGFR-TKIs治療耐藥后合并BRAF融合的17例患者中有12例為EGFR19del，提示BRAF融合在EGFR19del的患者中更易出現(xiàn)（P=0.015）。此外，在BRAFV600E突變的黑色素瘤中，BRAF抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑治療后，檢出BRAF融合基因，表明BRAF融合可能為BRAF抑制劑獲得性耐藥的一種機(jī)制[18]。

3 BRAF融合作用機(jī)制

BR AFI類突變導(dǎo)致M APK持續(xù)活化，負(fù)反饋抑制RAS，阻止BRAF二聚化，保持單體構(gòu)象。與導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域突變的BRAF單體突變相反，BRAF融合蛋白保留正常的激酶結(jié)構(gòu)域，BRAF基因融合導(dǎo)致N端CR1自動(dòng)抑制區(qū)域斷裂，無法有效抑制BRAF活化，導(dǎo)致BRAF基因形成二聚體而結(jié)構(gòu)性持續(xù)活化，且不依賴上游RAS活性，功能類似于II類突變[15,19]?；罨蟮腂RAF導(dǎo)致下游MAPK信號通路異常激活。BRAF融合蛋白表達(dá)未突變的激酶結(jié)構(gòu)域，可能表現(xiàn)出多種構(gòu)象狀態(tài)，對小分子抑制劑（如Vemurafenib）的親和力降低[20]。

4 BRAF融合伴侶

目前肺癌中發(fā)現(xiàn)眾多BRAF融合伴侶，包括AGAP3、AGK、A R MC10、SA LL2、DOCK4、EPS515、GHR、KIAA1549、TRIM24、AP3B1、KCND2、GRM8、PARP12、BIN1、EYS、TRIO、PTPRN2、LMO7、PTPN13、UBN2、ZC3HAV1、ERC1、BTFL34、EPS15、MKRN1、NUP214、STAT3、ZC3HAV4等[13,21-23]，63%的融合體與BRAF位于同一條7號染色體上[24]，其中最常見的融合體為AGK、DOCK4和TRIM24。BRAF融合斷點(diǎn)常位于已知的熱點(diǎn)區(qū)域（外顯子7-11）[17]，保留了BRAF二聚化基序和BRAF激活區(qū)。融合基因的表達(dá)依賴于融合伴侶啟動(dòng)子，融合伴侶通常具有二聚化或寡聚化序列，5’端的伴侶編碼卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，使激酶二聚化。然而BRAF具有自己的二聚化基序，跨越外顯子12和13，在目前已知的BRAF融合體中BRAF二聚化基序是完整的，因此，BRAF融合功能可能不需要具有二聚化能力的5’伴侶[25]。

5 BRAF融合的治療

對于BRAF融合，目前指南沒有相關(guān)針對抗BRAF治療的相關(guān)推薦。不過，其他癌癥、臨床前研究及個(gè)案報(bào)道對BRAF融合的治療會(huì)有所啟示（表1）。

表1 BRAF融合肺癌病例匯總Tab 1 Summary of case reports of BRAF fusion in NSCLC

5.1BRAF融合與靶向治療

5.1.1 BRAF抑制劑單藥 第一代RAF抑制劑（包括達(dá)拉菲尼和威羅菲尼）針對激活的BRAF蛋白，與ATP競爭結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致活性位點(diǎn)無法暴露。第一代RAF抑制劑優(yōu)先抑制BRAF單體，因其與BRAF二聚體中的一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，顯著降低其與第二個(gè)位點(diǎn)的親和力，因此對具有激酶活性的二聚體是無效的。在BR AF融合細(xì)胞系中，應(yīng)用第一代BRAF抑制劑后，導(dǎo)致BRAF融合蛋白的反常激活以及MEK磷酸化增加[26]，無法有效抑制腫瘤生長。多項(xiàng)臨床前研究[15,18,27]顯示第一代BR AF抑制劑不能克服由于BR AF融合導(dǎo)致的耐藥。而正在臨床研究階段的新一代RAF抑制劑-RAF二聚體阻斷劑（PLX8394、FORE8394等）以及泛-RAF（pan-RAF）抑制劑，通過抑制前聚體，避免BRAF反常激活，不僅可有效抑制BRAFV600單體突變，同時(shí)能對BRAFII/III類突變以及BRAF融合有效[26]，這類藥物未來可能對BRAF融合突變的治療帶來新的改變。

5.1.2 MEK抑制劑單藥 曲美替尼是MEK1和MEK2激酶的可逆性抑制劑，通過對MEK蛋白的抑制作用，影響MAPK信號通路，抑制細(xì)胞增殖。對于BRAFV600突變的患者，曲美替尼聯(lián)合BRAF抑制劑具有協(xié)同抗腫瘤的作用。在BRAF融合的患者中，多項(xiàng)臨床前研究及個(gè)案報(bào)道發(fā)現(xiàn)曲美替尼對BRAF融合有效。Wang等[28]報(bào)告1例原發(fā)LIMD1-BRAF融合的肺腺癌，患者拒絕化療，一線應(yīng)用曲美替尼抗腫瘤治療，PFS達(dá)7.4個(gè)月。另外1例晚期肺腺癌，初始檢測出SND1-BRAF融合，經(jīng)過化療、抗血管、免疫等多線治療后，檢測出SND1-BRAF以及BRAF-RNF150融合，給予曲美替尼治療后，癥狀明顯緩解，病情評估為部分緩解[29]。在其他癌癥中，如黑色素瘤[18]、前列腺癌[30]、膠質(zhì)瘤[31]等，曲美替尼對于BRAF融合的患者治療有效也有報(bào)道。因此，對于BRAF融合的患者可考慮采用曲美替尼進(jìn)行治療。

5.1.3 多激酶抑制劑 多激酶抑制劑包括索拉菲尼、瑞戈非尼、培唑帕尼等，這類藥物為非特異性BRAF抑制劑，與BRAF非激酶活性構(gòu)象相結(jié)合，針對的是未活化的BRAF蛋白，通過結(jié)合到BRAF蛋白的“口袋”上，導(dǎo)致ATP分子無法進(jìn)入，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對包括BRAF在內(nèi)的多種激酶均有抑制作用。在黑色素瘤、前列腺癌細(xì)胞系中，索拉菲尼可以抑制BRAF融合細(xì)胞生長[32,33]。不過這類藥物單用抗腫瘤作用有限，在BRAF融合的惡性黑色素細(xì)胞瘤和惡性梭形細(xì)胞瘤中，有索拉菲尼聯(lián)合治療有效的個(gè)案報(bào)告[34,35]。

5.1.4 RAF抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑 目前在BRAF融合黑色素瘤異種模型中，pan-RAF抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑具有協(xié)同抗腫瘤的作用[24]。對于奧希替尼耐藥的患者，臨床前研究[36]表明，EGFR-MEK途徑的雙重抑制優(yōu)于單獨(dú)抑制MEK信號通路。在個(gè)案報(bào)道中，BRAF抑制劑聯(lián)合MEK抑制劑對于BRAF融合的患者療效顯著。Chou等[37]報(bào)告1例分化差的晚期肺腺癌患者，一線接受化療聯(lián)合帕博麗珠單抗，疾病進(jìn)展后基因檢測同時(shí)檢出KIAA1549-BRAF融合和MET擴(kuò)增，后續(xù)給予卡博替尼、達(dá)拉非尼和曲美替尼治療有效，疾病控制超過6個(gè)月。另外1例EGFR19del患者，一線厄洛替尼治療耐藥后，檢出T790M突變，二線奧希替尼治療，耐藥后檢出MKRN1-BRAF融合，三線化療聯(lián)合奧希替尼治療疾病進(jìn)展，四線予奧希替尼聯(lián)合曲美替尼、達(dá)拉非尼，疾病得到控制[38]，但是需要關(guān)注聯(lián)合治療導(dǎo)致的不良反應(yīng)。

5.1.5 MEK/PI3K抑制劑或MEK/CDK4/6抑制劑聯(lián)合 在惡性腫瘤中，大多會(huì)出現(xiàn)MAPK、細(xì)胞周期以及磷脂酰肌醇3-激酶-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase-mammalian target of rapamycin, PI3K-mTOR）信號通路改變，聯(lián)合抑制這些信號通路可能對抗腫瘤起到協(xié)同作用。在黑色素瘤BRAF融合細(xì)胞系中，與單用MEK抑制劑相比，應(yīng)用MEK抑制劑聯(lián)合PI3K抑制劑或MEK抑制劑聯(lián)合CDK4/6抑制劑具有協(xié)同抗腫瘤作用[39]。這些聯(lián)合治療也是未來探索的一個(gè)方向。

5.2BRAF融合與免疫治療 驅(qū)動(dòng)基因陽性的患者，ICIs的療效差強(qiáng)人意。對于BRAF突變的患者具有較高的TMB和程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）表達(dá)水平，可潛在從ICIs治療中獲益。研究[40]發(fā)現(xiàn)BRAF突變的患者單藥ICIs的客觀緩解率（objective response rate,ORR）為10%-30%，中位PFS為2-4個(gè)月，與驅(qū)動(dòng)基因野生型NSCLC二線治療中的療效類似，并且對于BR AF非600E突變的患者，免疫治療的療效更好一些。不過對于功能類似于II類突變BRAF融合的患者，總體TMB較低（中位數(shù)為3.8 mut/Mb）[13]，免疫獲益可能性較小。在黑色素細(xì)胞瘤中，Panning等[41]報(bào)告5例BRAF融合/重排的患者，應(yīng)用ICIs治療后，4例出現(xiàn)疾病進(jìn)展，提示免疫治療療效不佳。在NSCLC中，BRAF融合免疫治療效果尚不明確，目前僅在個(gè)案報(bào)道中有少量報(bào)道。Yu等[29]報(bào)告1例初始存在BRAF融合合并PD-L1（應(yīng)用22C3抗體）腫瘤細(xì)胞陽性比例分?jǐn)?shù)（tumor proportion score, TPS）為30%的肺腺癌患者，一線化療聯(lián)合抗血管進(jìn)展后，免疫單藥以及聯(lián)合化療治療效果不佳，后續(xù)給予曲美替尼治療后達(dá)部分緩解。另外Kong等[42]報(bào)告1例肺腺癌患者接受EGFR靶向藥物耐藥后，檢出BTN2A1-BRAF融合，并且PD-L1高表達(dá)（TPS為90%，應(yīng)用22C3抗體），然而給予度伐利尤單抗單藥治療無效。

在結(jié)腸癌中，BRAFV600E突變與CpG島甲基化表型相關(guān)，導(dǎo)致MLH1啟動(dòng)子過度甲基化，微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定。而基因融合同樣可導(dǎo)致MAPK信號通路活化，MLH1基因啟動(dòng)子CpG島發(fā)生甲基化，使得細(xì)胞發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定，患者可能從免疫治療獲益[43]。在一項(xiàng)回顧性研究[43]中，2314例結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)21例存在基因融合（包括8例NTRK、2例FGFR、1例ROS1、1例ALK、4例RET、5例BRAF等），其中57%（12/21）為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定狀態(tài)，并且這些患者均存在MLH1表達(dá)缺失。Heinrich等[44]報(bào)告在1例胰腺癌患者，存在TRIM24-BRAF融合，同時(shí)患者存在MLH1啟動(dòng)子超甲基化，微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定狀態(tài)，一線給予帕博麗珠單抗治療后，腫瘤達(dá)到持久的控制。因此，對于BRAF融合的患者，可以考慮行DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)/微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)檢測。

6 未來挑戰(zhàn)與方向

BRAF融合的患者比例低，治療手段有限，很難開展前瞻性臨床研究。目前其治療策略仍類似于驅(qū)動(dòng)基因陰性的患者。基于檢測方法的局限性、檢測標(biāo)本的差異以及實(shí)驗(yàn)室條件的不同，很可能低估了激酶融合導(dǎo)致的腫瘤患者人數(shù)。未來可以考慮因地制宜選擇合適的檢測方式，以最大限度地為患者提供精準(zhǔn)治療?；谝陨吓R床前研究以及個(gè)案報(bào)道，對于BRAF融合的患者仍需要進(jìn)行更多的探索。免疫治療差強(qiáng)人意，MEK抑制劑、新型RAF抑制劑以及聯(lián)合治療模式顯示出明顯的抗腫瘤效果，未來需要進(jìn)一步進(jìn)行多中心的臨床研究或“籃子”試驗(yàn)，為BRAF融合治療提供更可靠的理論依據(jù)。此外，在ALK基因融合中，不同的融合位點(diǎn)及融合方式對靶向藥物的敏感性及耐藥方式不同，但是關(guān)于BRAF不同的融合伴侶是否影響藥物的敏感性和繼發(fā)性耐藥目前尚不清楚，以及不同癌種對治療的敏感性是否存在差異，這也是未來需要進(jìn)一步進(jìn)行探索的方向。因此，BRAF融合有望成為NSCLC潛在的治療靶點(diǎn)，為肺癌的個(gè)體化治療提供新的方向。