曹嘉玥，李曉慧，李慶秀，王 娜，閆師杰,3,*，陳存坤

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300392；4.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所（國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

蘋果甘甜性涼，營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界四大水果之冠[1]。因其適應(yīng)性強(qiáng)、可長(zhǎng)期貯藏、便于運(yùn)輸、滿足全年供應(yīng)等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。由粉紅單端孢霉（Trichothcium roseum）引起的心腐病是我國(guó)蘋果采后貯藏期間的主要病害，國(guó)內(nèi)將該類病害統(tǒng)稱為蘋果霉心病[3]。近年來(lái)蘋果的霉心病危害程度有所上升，常因果實(shí)心室發(fā)霉，果心腐爛和病果早期脫落，果肉腐爛等而損失[4]，且如果貯藏條件不當(dāng)，其發(fā)病率可高達(dá)40%[5-7]。

粉紅單端孢霉可導(dǎo)致甜瓜、番茄、杏、芒果等果實(shí)采后腐爛，在侵染果實(shí)過(guò)程中可以穿過(guò)心皮，導(dǎo)致整個(gè)果實(shí)腐爛，除了造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)產(chǎn)生單端孢霉烯族類毒素[8-10]，這類毒素具有致癌、致畸、致突變等作用，嚴(yán)重威脅人類健康[11]。目前，主要采用氣相色譜法[12]、高效液相色譜法[13-14]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[15]等方法檢測(cè)果蔬中真菌毒素，其中應(yīng)用最廣的方法是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

目前我國(guó)蘋果主要以冷藏（CS）方式貯藏保鮮，氣調(diào)（CA）貯藏占比在10%以下，而發(fā)達(dá)國(guó)家的蘋果氣調(diào)貯藏占總貯藏量的40%以上[16]。冷藏僅通過(guò)控制溫度和濕度來(lái)延緩果實(shí)衰老，而氣調(diào)貯藏是在冷藏的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步控制環(huán)境中的二氧化碳和氧氣的比例，具有比冷藏更顯著的保鮮效果[17]。在蘋果、梨、獼猴桃、四季豆等多種果蔬上的研究發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)貯藏可以有效抑制果蔬的呼吸強(qiáng)度，維持較高的抗氧化酶活性，從而提高貯藏品質(zhì)[18]。氣調(diào)貯藏對(duì)接種蘋果毒素含量及相關(guān)生理指標(biāo)的影響是通過(guò)CO2和O2的協(xié)同作用，在氣調(diào)貯藏中，調(diào)節(jié)適宜O2與CO2體積分?jǐn)?shù)的聯(lián)合貯藏效果比O2與CO2單獨(dú)作用顯著。任小林等[19]認(rèn)為，富士蘋果果肉致密并且不耐高CO2，氣調(diào)貯藏時(shí)的CO2體積分?jǐn)?shù)要始終低于O2體積分?jǐn)?shù)。目前，針對(duì)調(diào)節(jié)O2和CO2體積分?jǐn)?shù)對(duì)接種粉紅單端孢霉蘋果在貯藏期間的影響相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究以紅富士蘋果為材料，采用固相萃取-超高效液相色譜質(zhì)譜法對(duì)不同氣調(diào)貯藏的接種蘋果毒素含量進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)定蘋果的生理指標(biāo)，探究不同氣調(diào)貯藏條件對(duì)蘋果毒素含量及生理指標(biāo)的影響，旨在為蘋果貯藏保鮮技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

市售紅富士蘋果，于2021 年10 月下旬在山東省煙臺(tái)市采摘，選擇大小均勻、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，采后當(dāng)日運(yùn)回天津農(nóng)學(xué)院冷庫(kù)中，單果質(zhì)量200～250 g。

粉紅單端孢霉（Trichothcium roseum），北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；毒素標(biāo)準(zhǔn)品（赭曲霉素A（OTA）、T-2 毒素、HT-2 毒素、鐮刀菌烯酮（Fus-X）、新茄腐鐮刀菌烯醇（NEO）、細(xì)交鏈孢菌酮酸（TeA）、乙二酰鑣草鐮刀菌烯醇-蛇形毒素（DAS）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-AcDON）），美國(guó)Romer 公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、乙醇、乙腈（分析純、色譜純）、檸檬酸、乙酸銨（色譜純），天津韻尼科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Acquity TM 型超高效液相色譜-Xevo TQ-S 串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；CA-10型呼吸代謝測(cè)定儀，美國(guó)Stable systems 公司；GC-14C 型氣相色譜儀，日本島津公司；Check point 型便攜式O2/CO2測(cè)定儀，丹麥PBI Dansensor 公司；3-30k 型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；N-EVAP-112 型氮吹儀，美國(guó)Organomation 公司；VORTEX-BE1 型渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PAL-1 型數(shù)顯糖度計(jì)，日本愛(ài)拓公司；PHS-3B型數(shù)顯酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；BSC-250 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

菌種培養(yǎng)→制備孢子懸浮液→接種蘋果→氣調(diào)貯藏→指標(biāo)測(cè)定

1.2.2 菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)操作，將粉紅單端孢霉標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在25 ℃條件下避光培養(yǎng)，采用平板劃線法將培養(yǎng)好的菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿封口后，在25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7～8 d，備用。

1.2.3 孢子懸浮液的制備

參照Bi 等[20]的方法并略作修改。用無(wú)菌水沖洗帶菌培養(yǎng)基，在顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2～3次，計(jì)算出每毫升孢子懸浮液所含孢子細(xì)胞數(shù)（5 個(gè)中格孢子細(xì)胞總數(shù)×5×104×稀釋倍數(shù)），及孢子懸浮液的濃度，并將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至108個(gè)/mL。

1.2.4 接種

隨機(jī)選取無(wú)機(jī)械損傷、大小均一的紅富士蘋果，在超凈工作臺(tái)用75%的乙醇消毒后，再用滅菌打孔器在蘋果的赤道部位均勻打4個(gè)孔，將孢子懸浮液接入蘋果，每孔50 μL，每個(gè)處理接種35個(gè)蘋果。

1.2.5 氣調(diào)貯藏

本試驗(yàn)以具有良好氣密性的盒子作為氣調(diào)貯藏的場(chǎng)所，并通過(guò)充入N2和CO2調(diào)節(jié)氣體組成。將接種有粉紅單端孢霉的蘋果分別放于不同氣體組分條件（氣調(diào)Ⅰ：3%～4% O2+1%～2% CO2；氣調(diào)Ⅱ：3%～4%O2+3%～4%CO2；氣調(diào)Ⅲ：3%～4%O2+5%～6%CO2）進(jìn)行貯藏，對(duì)照組（CK）不進(jìn)行氣調(diào)處理，貯藏溫度均為15 ℃，相對(duì)濕度為90%～95%，每5 d 進(jìn)行1 次產(chǎn)毒素水平和相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.2.6.1 粉紅單端孢霉生長(zhǎng)曲線的繪制

各處理均取4個(gè)蘋果作為每次測(cè)量的固定用果，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定，采用十字交叉法測(cè)定蘋果病斑橫縱直徑，取平均值作為腐爛直徑，每5 d 記錄1次，當(dāng)腐爛直徑大于60 mm 時(shí)結(jié)束測(cè)定，以貯藏時(shí)間為橫坐標(biāo)，腐爛直徑為縱坐標(biāo)，繪制不同氣體貯藏條件下粉紅單端孢霉生長(zhǎng)曲線。

1.2.6.2 蘋果中毒素含量

參考韋迪哲等[21]的方法略作修改，對(duì)已接種蘋果中的毒素進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6.3 可溶性固形物含量

參照Tappi 等[22]的方法，隨機(jī)挑選6 個(gè)已接種蘋果，用PAL-1數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)量可溶性固形物含量，將蘋果的未發(fā)生腐爛部分削皮、切塊、用壓汁器壓汁，并用紗布過(guò)濾，設(shè)定3組平行測(cè)量。

1.2.6.4 可滴定酸含量

隨機(jī)選取6個(gè)已接種蘋果，將蘋果未腐爛部位切塊壓汁，紗布過(guò)濾后用PHS-3B 數(shù)顯酸度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)蘋果重復(fù)3次測(cè)量，其結(jié)果用百分比表示。

1.2.6.5 呼吸強(qiáng)度

將Liu 等[23]的方法稍加修改后，隨機(jī)選取6 個(gè)蘋果作為呼吸強(qiáng)度定果，悶氣時(shí)間為1 h，悶氣溫度為蘋果貯藏溫度，采用CA-10 呼吸代謝測(cè)定儀測(cè)定樣品的呼吸強(qiáng)度，單位為mg CO2/(kg·h)，每個(gè)處理設(shè)3 組平行。

1.2.6.6 乙烯釋放量

隨機(jī)挑選6 個(gè)已接種蘋果，采用GC-14C 型氣相色譜儀進(jìn)行乙烯釋放量的測(cè)定，單位為μL/（kg·h），每個(gè)處理設(shè)3組平行。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，用WPS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)貯藏對(duì)蘋果中粉紅單端孢霉產(chǎn)毒的影響

2.1.1 氣調(diào)貯藏對(duì)粉紅單端孢霉生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可以看出，接種粉紅單端孢霉后的蘋果在貯藏期間都會(huì)出現(xiàn)病斑，且在貯藏期間其病斑（腐爛直徑）持續(xù)增大，在氣調(diào)Ⅱ（3%～4%O2+3%～4%CO2）環(huán)境下，粉紅單端孢霉生長(zhǎng)速度較其他兩種氣調(diào)環(huán)境快，氣調(diào)Ⅰ（3%～4% O2+1%～2% CO2）和氣調(diào)Ⅲ（3%～4% O2+5%～6% CO2）之間無(wú)顯著性差異。10～25 d期間，接種粉紅單端孢霉蘋果的對(duì)照組腐爛直徑顯著大于氣調(diào)組（P＜0.05），說(shuō)明適當(dāng)上調(diào)二氧化碳體積分?jǐn)?shù)可以延緩粉紅單端孢霉的生長(zhǎng)。

圖1 不同氣調(diào)處理對(duì)蘋果粉紅單端孢霉生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effects of different CA treatments on growth curves of T.roseum

2.1.2 氣調(diào)貯藏對(duì)接種蘋果中毒素產(chǎn)生情況的影響

由表1可以看出，接種蘋果在貯藏期間有TeA毒素產(chǎn)生，其他幾種毒素均未達(dá)到檢測(cè)限。貯藏前期（0、5 d）各處理接種蘋果中均未檢測(cè)到TeA毒素，相同貯藏時(shí)間內(nèi)對(duì)照組毒素含量顯著高于氣調(diào)組（P＜0.05），說(shuō)明適當(dāng)提高貯藏環(huán)境中CO2體積分?jǐn)?shù)有利于抑制接種蘋果中毒素的積累，但并不是CO2體積分?jǐn)?shù)越高抑制效果越好，貯藏在氣調(diào)Ⅱ環(huán)境中的TeA毒素含量高于氣調(diào)Ⅰ和氣調(diào)Ⅲ，氣調(diào)Ⅰ與氣調(diào)Ⅲ差異不顯著。

表1 貯藏期間接種粉紅單端孢霉的蘋果中TeA的檢出情況Table 1 Contents of TeA toxin of apples inoculated with T.roseum during storage 單位：μg/L

2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)蘋果產(chǎn)毒相關(guān)生理指標(biāo)的影響

2.2.1 氣調(diào)貯藏對(duì)蘋果可溶性固形物含量的影響

由圖2可以看出，所有處理蘋果中可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，各個(gè)氣調(diào)處理組均于貯藏15 d 時(shí)達(dá)到最高值，氣調(diào)Ⅰ、氣調(diào)Ⅱ、氣調(diào)Ⅲ蘋果中可溶性固形物含量峰值分別為13.6%、13.7%、13.7%，而對(duì)照組于貯藏20 d 時(shí)達(dá)到最高值。在貯藏15 d 后氣調(diào)組可溶性固形物含量又迅速下降，氣調(diào)Ⅲ處理組蘋果中可溶性固形物含量始終低于其他2組氣調(diào)處理。在貯藏后期，氣調(diào)處理的蘋果可溶性固形物含量均低于對(duì)照組，說(shuō)明氣調(diào)貯藏可有效抑制蘋果的呼吸作用，更有利于延長(zhǎng)果品的貯藏期。

圖2 不同氣調(diào)處理對(duì)接種蘋果中可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effects of different CA treatments on soluble solids contents of inoculated apples

2.2.2 氣調(diào)貯藏對(duì)蘋果可滴定酸含量的影響

由圖3 可以看出，3 種氣體組分下貯藏的接種蘋果中可滴定酸含量均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。氣調(diào)Ⅰ、氣調(diào)Ⅱ、氣調(diào)Ⅲ組蘋果的可滴定酸含量分別于第10、5、5 天時(shí)達(dá)到高峰，而后開(kāi)始下降。在貯藏中后期，氣調(diào)Ⅰ和氣調(diào)Ⅱ處理蘋果中可滴定酸含量普遍略高于對(duì)照組。氣調(diào)Ⅲ在貯藏25 d時(shí)低于對(duì)照組，說(shuō)明氣調(diào)處理可在貯藏中后期適當(dāng)抑制接種蘋果中可滴定酸的降解，延緩果實(shí)成熟和品質(zhì)劣變。

圖3 不同氣調(diào)處理對(duì)接種蘋果中可滴定酸含量的影響Fig.3 Effects of different CA treatments on titration acid contents of inoculated apples

2.2.3 氣調(diào)貯藏對(duì)蘋果呼吸強(qiáng)度的影響

由圖4 可以看出，在貯藏前期，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氣調(diào)和對(duì)照處理接種蘋果的呼吸強(qiáng)度均呈上升趨勢(shì)，氣調(diào)Ⅰ、氣調(diào)Ⅱ、氣調(diào)Ⅲ以及對(duì)照組分別于第10、15、15、10天達(dá)到呼吸高峰，且對(duì)照組的呼吸高峰值顯著高于氣調(diào)組（P＜0.05）。說(shuō)明貯藏環(huán)境中適宜的高二氧化碳體積分?jǐn)?shù)有助于推遲接種蘋果呼吸高峰的出現(xiàn)時(shí)間，并能大幅度降低其呼吸強(qiáng)度。

圖4 不同氣調(diào)處理對(duì)接種蘋果呼吸強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of different CA treatments on respiration rates of inoculated apples

2.2.4 氣調(diào)貯藏對(duì)蘋果乙烯釋放量的影響

由圖5 可以看出，在3 種氣調(diào)環(huán)境下，接種粉紅單端孢霉的蘋果乙烯釋放量快速增加，氣調(diào)Ⅰ和對(duì)照組的蘋果在第15 天出現(xiàn)乙烯釋放高峰，氣調(diào)Ⅱ和氣調(diào)Ⅲ處理的蘋果于第20 天出現(xiàn)乙烯釋放高峰，之后下降，說(shuō)明氣調(diào)處理有助于降低果實(shí)乙烯釋放峰值，且高體積分?jǐn)?shù)的二氧化碳能夠推遲乙烯釋放高峰的出現(xiàn)時(shí)間。

圖5 不同氣調(diào)處理對(duì)接種蘋果乙烯釋放量的影響Fig.5 Effects of different CA treatments on ethylene release of inoculated apples

3 討論與結(jié)論

粉紅單端孢霉侵染水果后會(huì)產(chǎn)生如T-2 毒素、HT-2毒素等單端孢烯族毒素，它們和伏馬毒素、雪腐鐮刀菌烯醇等共同隸屬于鐮刀菌毒素，這些鐮刀菌毒素能在植物中代謝或結(jié)合并轉(zhuǎn)化為其他霉菌毒素[24]。細(xì)交鏈孢菌酮酸是由鏈格孢菌或其他植物病原菌產(chǎn)生的一種真菌毒素[25]。本試驗(yàn)中所產(chǎn)生的TeA 毒素可能是由于粉紅單端孢霉所產(chǎn)生的鐮刀菌毒素轉(zhuǎn)化而來(lái)，但具體產(chǎn)生途徑還需進(jìn)一步探究。

接種蘋果在貯藏期間對(duì)照組TeA 含量遠(yuǎn)高于氣調(diào)組，說(shuō)明適當(dāng)提高貯藏環(huán)境中CO2體積分?jǐn)?shù)有利于抑制接種蘋果中毒素的積累，但并不是CO2體積分?jǐn)?shù)越高抑制效果越好，貯藏在氣調(diào)Ⅱ環(huán)境下蘋果的TeA毒素含量高于氣調(diào)Ⅰ和氣調(diào)Ⅲ，氣調(diào)Ⅰ與氣調(diào)Ⅲ差異不顯著。有研究表明，蘋果心腐病在貯藏期發(fā)病情況與貯藏溫度以及貯藏環(huán)境中O2、CO2等有關(guān)，且與貯藏溫度呈正相關(guān)[26]；Ali 等[27]將荔枝果實(shí)貯藏于10 種不同的氣體環(huán)境下，貯藏溫度為（5±1）℃，研究不同氣體組分對(duì)果皮褐變、生化特性和抗氧化活性的影響，結(jié)果表明，1%O2+5%CO2氣調(diào)處理可延緩果皮褐變，保持抗氧化活性和生化特性，更好地保持荔枝果實(shí)的感官品質(zhì)。然而，不是所有氣調(diào)保鮮都可以延長(zhǎng)水果貨架期，當(dāng)氣調(diào)參數(shù)設(shè)置不當(dāng)時(shí)，會(huì)對(duì)果蔬起反作用。錢卉蘋等[28]研究表明，CO2體積分?jǐn)?shù)過(guò)高會(huì)造成李子和鴨梨褐變以及風(fēng)味物質(zhì)代謝紊亂，還可使桃口感變差。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：氣調(diào)貯藏有明顯延緩粉紅單端孢霉生長(zhǎng)的作用，并能降低蘋果中TeA 毒素含量，氣調(diào)Ⅰ（3%～4% O2+1%～2% CO2）和氣調(diào)Ⅲ（3%～4%O2+5%～6%CO2）對(duì)粉紅單端孢霉生長(zhǎng)以及毒素積累的抑制效果優(yōu)于氣調(diào)Ⅱ（3%～4% O2+3%～4% CO2）。貯藏25 d 時(shí)，與其他2 種氣體環(huán)境相比，氣調(diào)Ⅲ中的蘋果可溶性固形物含量最低，氣調(diào)Ⅰ和氣調(diào)Ⅲ環(huán)境下的蘋果中可滴定酸含量低于氣調(diào)Ⅱ，適當(dāng)提高貯藏環(huán)境中CO2體積分?jǐn)?shù)有利于抑制接種蘋果中TeA毒素的積累以及推遲呼吸高峰和乙烯釋放高峰的出現(xiàn)，進(jìn)而可以提高果實(shí)的貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)果實(shí)的采后壽命，但并不是CO2體積分?jǐn)?shù)越高抑制效果越好。