黎明星 李卓嫻 李康梅 陳秀榕 周艷平 黃愉淋 白琳 吳展帥 夏猛 何國珍

1廣西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院（南寧 530200）；2廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室（南寧 530200）

女性不孕癥現(xiàn)已成為全球第三大疾病，其中女性卵源性不孕的病因主要為卵泡過度啟動引發(fā)的多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）以及原始卵泡啟動障礙導致的卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）或卵巢功不全（premature ovarian insufficiency，POI）［1］。據(jù)統(tǒng)計，約有1/100的40歲以下、1/1 000的20 ～ 30歲及1/10 000的20歲以下的婦女因卵巢早衰而提前絕經(jīng)［2］。原始卵泡啟動募集是卵泡發(fā)生的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，卵泡從受抑制的原始卵泡進入生長卵泡的過程稱為原始卵泡啟動募集或原始卵泡到初級卵泡的轉(zhuǎn)變，該過程直接影響女性一生中能提供的卵子數(shù)。一旦原始卵泡池耗竭或啟動募集障礙，可引起卵巢早衰或卵巢功能低下導致不孕。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）為多肽生長因子，其受體為c-Met（HGF-receptor，也稱c-Met），具備自主磷酸化活性［3］。HGF表達于卵巢中卵泡周圍的間質(zhì)細胞，可由卵泡膜細胞分泌［4］，c-Met則多表達于上皮來源細胞，二者特異性結(jié)合后，可激發(fā)多條信號通路，發(fā)揮多種生物活性，參與調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)細胞、卵泡膜細胞、顆粒細胞等的發(fā)育與卵泡的成熟［5］。研究發(fā)現(xiàn)［4］HGF和c-Met 的mRNA在2 d的小鼠卵巢中表達，且HGF促進顆粒細胞增殖、腔前和早期腔卵泡的數(shù)量增加，同時HGF也可刺激FSH受體的表達，提示HGF可從多方面調(diào)控卵泡細胞功能，共同促進卵泡發(fā)育，而HGF/c-Met信號通路對早期卵泡發(fā)生的影響趨勢鮮見報道。本課題組從HGF/c-Met信號通路為切入點，研究出生后不同鼠齡的小鼠卵巢中HGF/c-Met信號通路分子表達情況以及該信號通路的生物信息學分析，探討HGF/c-Met信號通路與小鼠早期卵泡發(fā)育相關(guān)性和相關(guān)的分子機制，為后續(xù)研究HGF/c-Met信號通路啟動原始卵泡募集的具體作用機制打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物性成熟昆明（KM）雌性小白鼠30只，雄性小白鼠15只，由廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供（證號：2019-0004），飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心，恒溫23 ～ 25 °C，12 h光照/12 h黑暗交替，自由采食飲水。

1.2 主要試劑及儀器HGF抗體（索萊寶科技有限公司，貨號：K002383P）；c-Met抗體（萬類生物科技有限公司，貨號：WL01758）；辣根過氧化物酶（HRP）-羊抗兔IgG（美國abcam科技有限公司，貨號：ab6721）；多聚甲醛（上海國藥集團，批號：20170413）；Trizol regent（solarbio，R1100）；RM2255型輪轉(zhuǎn)式切片機（上海Leica儀器有限公司）；低溫離心機（eppendorf公司）；超微量核酸檢測儀（遂真公司）；Veriti? 96-Well Thermal Cycler（Applied Biosystems公司）；7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems公司）。

1.3 小鼠卵巢組織采集雌性昆明小白鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）保證同步發(fā)情，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）促排卵，以2∶1比例將雌鼠與性成熟雄鼠合籠，24 h后分籠。待母鼠生產(chǎn)后將胎鼠飼養(yǎng)至所需日齡（3、7、14、21 d）后處死，分離小鼠卵巢，存于-80 ℃冰箱。

1.4 免疫組織化學染色法檢測4%多聚甲醛固定小鼠卵巢，取材、脫水、石蠟包埋并制成臘塊。石蠟切片后脫蠟水化，EDTA-TRIS修復液進行抗原修復，PBS洗3次，3% ～ 5% H2O2-水（甲醇）溶液封閉內(nèi)源性過氧化酶，PBS洗3次，一抗（20 μg/mL）覆蓋切片，4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，1∶100生物素標記的羊抗兔抗血清37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，1∶400二抗4 ℃孵育60 min，PBS洗3次；DAB顯色，蘇木精復染，PBS返藍，梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹膠封固。顯微鏡下讀片，黃色為陽性表達。采用IPP 6.0（Image Pro Plus） 測量HGF、c-Met蛋白表達，分析灰度值。

1.5 Western blotting檢測RIPA裂解小鼠卵巢，BCA法測蛋白含量。等量的蛋白質(zhì)提取物在5×樣品緩沖液中熱變性，10%聚丙烯酰胺凝膠上分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉后，一抗HGF（1∶1 000），β-actin（1∶10 000），c-Met（1∶1 500）孵育，4 ℃搖床過夜。TBST清洗，二抗孵育。TBST清洗，顯影，將目的蛋白條帶與β-actin條帶的灰度比值作為各目的蛋白的相對表達水平。

1.6 qPCR檢測Trizol裂解小鼠卵巢，混勻，加入50%體積的氯仿，離心，取上層水相，加入等體積異丙醇，離心得到RNA沉淀，70%酒精洗滌、晾干、無菌無酶水溶解，RNA濃度及純度檢測、逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA干-20 ℃保存。Real-Time PCR擴增：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為擴增反應(yīng)的模版，加入目的基因與內(nèi)參引物進行擴增；擴增條件：預變性95 ℃，30 s；變性95 ℃，5 s；退火溫度60 ℃，30 s；延伸72 ℃，15 s；循環(huán)次數(shù)40個。引物序列：HGF上游引物5'-TGATTCTTTCAGCCCGGCAT-3'，下游引物5'-CGACATGAAGCAGGAGGAGG-3'，c-Met上游引物5'-GCTCTGGAGGACAAGACCAC-3'，下游引物5'-GGTGGGAGCCTTCATTGTGA-3，內(nèi)參β-actin上游引物5'-CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT-3'，下游引物5'-TGGCATAGAGGTCTTTACGG-3'。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行分析，公式為：ΔCt=（Ct gene - Ct β-actin），ΔΔCt= （ΔCt treat - ΔCt control）。

1.7 HGF與c-Met的共同通路分析將HGF及c-Met輸入于NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索并獲得其對應(yīng)Gene ID后，將HGF、c-Met依托于DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）檢索，將物種限定為Homo sapiens，進行基因本體（Gene Ontology）分析，其中涵括細胞組分（Cell Components）、分子功能（Molecular Function）、生物過程分析（Biological Process），同時進行了KEGG信號通路富集分析。相關(guān)結(jié)果可視化依托于微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行。

1.8 統(tǒng)計學方法采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，同組前后比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF和c-Met蛋白在小鼠卵巢中的空間和時間表達規(guī)律在3、7、14、21 d的小鼠卵巢中HGF及c-Met均有不同程度的表達，并具有一定空間和時間表達規(guī)律。

2.1.1 時間表達規(guī)律（1）HGF蛋白表達規(guī)律：HGF陽性表達的平均光密度值顯示：3、7、14、21 d卵巢中HGF的表達隨日齡的增加而升高，且21 d表達量最高，見圖1；與3 d相比，7、14、21 d的HGF光密度差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1。（2）c-Met蛋白表達規(guī)律：c-Met陽性表達的平均光密度值顯示：與HGF相比，c-Met的表達較弱且規(guī)律性不如HGF明顯，在3、7、14、21 d卵巢中c-Met的表達總體上隨日齡增加而升高，也在21 d表達量最高，但在7 d內(nèi)的表達略微降低，見圖1；與3 d相比，7、14、21 d小鼠卵巢c-Met的光密度差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 不同日齡小鼠卵巢組織中HGF表達的平均光密度Tab.1 The average optical density of HGF expression in ovarian tissue of different days in mice ±s

表1 不同日齡小鼠卵巢組織中HGF表達的平均光密度Tab.1 The average optical density of HGF expression in ovarian tissue of different days in mice ±s

注：與3 d日齡組比較，*P ＜ 0.05

日齡3 d 7 d 14 d 21 d c-Met平均光密度0.289 8 ± 0.044 42 0.259 1 ± 0.018 76*0.327 8 ± 0.075 23*0.330 8 ± 0.069 79*HGF平均光密度0.245 8 ± 0.092 42 0.333 3 ± 0.003 13*0.347 2 ± 0.034 68*0.418 2 ± 0.688 90*

圖1 HGF和c-Met在早期小鼠卵巢組織中的表達位置Fig.1 The expression location of HGF and c-Met in early mouse ovarian tissues

2.1.2 空間表達規(guī)律（1）HGF蛋白表達規(guī)律：3 d和7 d卵巢中主要是原始卵泡，可見早期初級卵泡，HGF主要表達于卵母細胞胞質(zhì)中，在卵泡細胞和卵泡周圍的基質(zhì)細胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量表達；14 d原始卵泡數(shù)量減少，主要看到的是體積明顯較大、卵泡細胞增生至多層的晚期初級卵泡，HGF在卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)表達顯著，卵泡細胞和卵泡周圍的基質(zhì)細胞內(nèi)表達較3 d增強；21 d仍以晚期初級卵泡為主，開始出現(xiàn)含有卵泡腔、體積更大的次級卵泡，HGF在卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)的表達相對于14 d更為強烈，且在顆粒細胞和基質(zhì)細胞內(nèi)表達增強。（2）c-Met蛋白表達規(guī)律：各日齡小鼠卵巢c-Met與HGF蛋白表達相似，3 d與7 d同樣以大量密集的原始卵泡為主，少量的早期初級卵泡，但表達程度明顯比同日齡卵巢HGF的表達弱；14 d主要是體積大且含有較多初級卵泡，表達較3、7 d明顯增強，顆粒細胞層內(nèi)也有明顯的表達；21 d中c-Met的表達量最高。

2.2 HGF和c-Met蛋白在早期小鼠卵巢中的表達變化與3 d相比，HGF和c-Met蛋白在7、14、21 d卵巢中表達水平顯著提高（P＜ 0.05），并隨小鼠日齡的增加而上升，其中以21 d表達量最高（P＜0.05），見圖2。

圖2 早期小鼠卵巢組織中HGF和c-Met蛋白的表達變化Fig.2 The expression of HGF and c-Met protein in early mouse ovarian tissue

2.3 HGF及c-Met的mRNA在早期小鼠卵巢中的表達變化qPCR結(jié)果顯示，與3 d相比，HGF和c-Met的mRNA在7、14、21 d卵巢中表達水平顯著上升（P＜ 0.05），且隨小鼠日齡呈上升趨勢，其中以21 d表達量最高，差異最顯著（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 早期小鼠卵巢HGF和c-Met的mRNA表達變化Fig.3 The expression of HGF and c-Met mRNA in early mouse ovarian tissue

2.4 HGF/c-Met的GO富集分析與KEGG通路分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對HGF及c-Met進行了GO功能富集與KEGG通路富集。GO富集分析三大結(jié)果中僅有生物過程分析具有差異顯著性（P＜ 0.05），包括過氧化氫介導的程序性細胞死亡的負調(diào)控（negative regulation of hydrogen peroxide-mediated programmed cell death）、肝細胞生長因子受體信號通路（hepatocyte growth factor receptor signaling pathway）、正趨化性（positive chemotaxis）、自噬的負調(diào)控（negative regulation of autophagy）、肝臟發(fā)育（negative regulation of autophagy）等，見圖4，縱坐標所展示為GO功能的具體名稱。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

KEGG富集到16條信號通路，其中15條具有顯著差異性（P＜ 0.05），主要包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗通路（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。見圖5，縱坐標所展示為通路的具體名稱。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

在哺乳動物的卵巢中，原始卵泡不斷地被募集到發(fā)育卵泡庫中。這些卵泡的特征是存在快速增殖的顆粒細胞和出現(xiàn)外層卵泡膜細胞。上皮源性顆粒細胞和間質(zhì)源性卵泡膜細胞之間的相互作用對卵泡發(fā)育的協(xié)調(diào)至關(guān)重要。這些細胞間的相互作用主要是通過卵巢局部產(chǎn)生的各種生長因子調(diào)控作用。原始卵泡生長的啟動和卵泡發(fā)生的早期階段與促性腺激素無關(guān)，即使在垂體切除和促性腺激素分泌不足的動物中也可觀察到卵泡生長。

HGF為間質(zhì)來源的多效性生長因子，由α-鏈（69 kD）和β-鏈（34 kD）亞基組成?？捎陕殉布毎ò雅菽ぜ毎㈩w粒細胞等）分泌。c-Met屬于受體酪氨酸激酶家族，是一種異源二聚體，由高糖基化的50 kD α亞基和跨膜的145 kD β亞基組成，主要通過二硫鍵連接［6］。c-Met為HGF的唯一受體，具備自主磷酸化活性和高親和力，含細胞外配體結(jié)合區(qū)、細胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白激酶結(jié)構(gòu)區(qū)以及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)［7］。HGF可能在小鼠卵巢卵泡發(fā)育的早期階段與后繼卵泡發(fā)育過程中起一定作用，與其受體c-Met在顆粒細胞上的結(jié)合導致c-Met活化［4］。二者結(jié)合后形成的HGF/c-Met信號通路可調(diào)控原始卵泡發(fā)育、顆粒細胞增殖與分化，并通過促進卵母細胞生長、顆粒細胞增殖來調(diào)控卵泡閉鎖環(huán)節(jié)，以延緩卵泡退化、閉鎖與卵巢衰老［8］。UZUMCU等［9］研究表明HGF/c-Met信號通路可調(diào)控卵泡發(fā)育的各個主要階段，包括類固醇生成、卵泡膜和顆粒細胞的生長以及顆粒細胞的凋亡。此外，HGF/c-Met信號通路參與調(diào)控原始卵泡庫的激活，對原始卵泡庫的維持有重要作用。

因此，本研究采用免疫組化、qPCR和WB檢測小鼠卵巢HGF及c-Met的mRNA與蛋白表達的位置及水平，結(jié)果表明在3、7、14、21 d小鼠卵巢組織中均有HGF及其受體c-Met的表達，且蛋白水平和mRNA表達隨日齡的增加呈不斷增長趨勢，在卵母細胞、基質(zhì)細胞和顆粒細胞均有表達，這與SAHIN等［10］的研究結(jié)果，c-Met在成熟卵母細胞中的表達水平是未成熟卵母細胞的2倍相符，表明HGF不僅可以介導卵泡膜細胞和卵巢顆粒細胞的相互作用來促進卵泡發(fā)生和卵母細胞的成熟，同時也可以通過旁分泌直接作用在卵母細胞上，卵母細胞本身也可通過自分泌作用來促進卵泡發(fā)生以及卵母細胞的成熟。

生后3 ～ 21 d，是原始卵泡激活啟動募集并發(fā)育到次級卵泡的階段，即原始卵泡啟動和早期卵泡發(fā)育的階段，結(jié)合我們實驗結(jié)果提示HGF/c-Met通路參與了原始卵泡啟動和早期卵泡發(fā)育的過程，與早期卵泡發(fā)育過程具有一定的相關(guān)性。隨著卵泡的不斷發(fā)育，生后3、7、14、21 d小鼠卵巢HGF和c-Met的整體水平大致呈不斷增長趨勢，但表達程度略有不同，這可能與c-Met為HGF的唯一受體，但HGF并非c-Met的唯一配體，且c-Met可不依賴于HGF而被激活相關(guān)［11］。前期實驗發(fā)現(xiàn)小鼠約在4周齡便有生殖能力，本次實驗也證實21 d（3周）卵巢內(nèi)開始出現(xiàn)次級卵泡，28 d（4周）可發(fā)育到成熟卵泡進行排卵而具有生殖能力。卵泡發(fā)育階段分為促性腺激素非依賴時期與促性腺激素依賴時期，前者主要受多種局部卵巢因子和細胞因子等調(diào)控，而后者則以下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)為主。本實驗結(jié)果HGF與c-Met的表達隨著小鼠日齡的增加而呈不斷升高的趨勢，進一步說明HGF/c-Met通路參與調(diào)控卵泡發(fā)育的早期階段。

通過HGF/c-Met的通路富集分析結(jié)果與相關(guān)文獻檢索分析結(jié)合，我們關(guān)注到HGF/c-Met所涉及通路中的PI3K-Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)的信號傳導途徑，可響應(yīng)胞外信號而促進代謝、存活、增殖、生長及血管生成。近年來多有研究證實［12］，PI3K/Akt信號通路和其下游效應(yīng)分子所構(gòu)建而成的通路在卵泡的形成、生成、排卵以及黃體化過程中都發(fā)生了變化，并參與并調(diào)控了卵母細胞的成熟，PI3K/Akt通路在卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟中扮演了重要角色，但具體調(diào)控機制仍有待進一步探索。當HGF與c-Met相結(jié)合時，會引發(fā)c-Met胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸殘基出現(xiàn)自身磷酸化，從而激活酪氨酸激酶，最終激活PI3K/Akt等信號通路［13］。提示HGF/c-Met通路調(diào)控卵泡發(fā)育的作用可能與PI3K/Akt信號通路的激活密切相關(guān)。

綜上所述，HGF/c-Met通路可能通過自/旁分泌等途經(jīng)參與調(diào)控了小鼠卵巢的早期卵泡發(fā)育過程，尤其是原始卵泡的激活和募集的調(diào)控，其具體的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路以及與其他卵巢局部因子的相互作用機制或與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)，為后續(xù)研究HGF/c-Met通路啟動原始卵泡募集的具體機制打下實驗基礎(chǔ)，也為闡明女性卵源性不孕的具體機制提供研究基礎(chǔ)。