黃衛(wèi)紅,董樂(lè)*

(1.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 泉州 362000;2. 泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院,福建 泉州 362000)

多糖作為一種天然高分子聚合物,具有廣泛的藥理活性,如抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性[1-4].近年來(lái),對(duì)天然多糖抗氧化活性的研究已成為焦點(diǎn),其抗氧化機(jī)制也被相繼報(bào)道[4-10].研究表明,外源多糖能夠通過(guò)提高氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子Nrf2(Nuclearfactor erythroidderived 2-like 2)的表達(dá)量進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化基因或抗氧化酶表達(dá),也能直接誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)[5-7],而高表達(dá)的抗氧化基因或抗氧化酶可以進(jìn)一步阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),從而減少自由基產(chǎn)生[8-9].其次,外源多糖通過(guò)抑制誘導(dǎo)型-氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表達(dá)并減少NO產(chǎn)生,能夠顯著提高機(jī)體抗氧化能力,減輕氧化應(yīng)激損傷[4,10].

隨著海洋生物技術(shù)的發(fā)展和微藻天然活性產(chǎn)物的深入研究,微藻多糖包括抗氧化活性在內(nèi)的生物活性也備受關(guān)注[11-12].紫球藻胞外多糖(exopolysaccharide fromPorphyridiumcruentum, EPC)是一種來(lái)自紫球藻胞外分泌的高分子硫酸化多糖[13],因其具有抗病毒[14]、抗氧化[15]、抗炎癥[16]和降膽固醇[17]等多種基本生物活性,被廣泛用于保健食品和制藥行業(yè)[18-19].對(duì)EPC的抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn),EPC對(duì)各種自由基具有較強(qiáng)的清除能力,且其對(duì)自由基的清除能力與相對(duì)分子質(zhì)量大小顯著關(guān)性[20-21].表明EPC和其他大分子多糖一樣,低溶解和高黏度等特性使其生物學(xué)構(gòu)象和生物活性受到限制[22].天然多糖結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系研究表明,大分子多糖被降解為小分子多糖后其生物活性均會(huì)顯著增加[22],利用酶解技術(shù)和分級(jí)純化方法是獲得小分子多糖的主流方法[23-25].然而,目前對(duì)EPC的抗氧化等生物活性的評(píng)價(jià)主要以多糖粗提物為研究對(duì)象[21,26],對(duì)其酶解或分級(jí)純化后抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫球藻藻種,中國(guó)科學(xué)院海洋研究所藻種庫(kù);非洲大蝸牛消化道混合酶,1 874.52 U·g-1,泉州師范學(xué)院福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;纖維素DE-52(DEAE-52)、快流速Q(mào)瓊脂糖凝膠(Q SepharoseTMFast Flow)、水溶性維生素E(Trolox),美國(guó)Sigma-Aldrich公司;偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DDPH·)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS·+),aladdin公司;熒光素鈉鹽(FL),上海MACK-LIN公司;其余試劑均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器設(shè)備

Allegra 64R型臺(tái)式高速離心機(jī),美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;HH-6D型恒溫水浴鍋,金壇市城東宏業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器廠;UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;LGJ-10D型冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;Nicolet iS 10型傅立葉紅外光譜儀,美國(guó)Thermo Scientific公司;YP-2壓片機(jī),上海山岳科學(xué)儀器有限公司;Infinite 200 Pro型多功能酶標(biāo)儀,瑞士Tecan公司;W2-100S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申生科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多糖提取及酶解物制備 EPC的提取及酶解物制備均參照之前對(duì)EPC酶解物制備工藝優(yōu)化的研究[24]進(jìn)行.

1.3.2 多糖酶解物分離純化及成分的初步鑒定 將EPC酶解物配制為40 mg·mL-1溶液,10 000 r·min-1離心2 min后取4 mL上清液加入已平衡好的DEAE-52層析柱(2.6 cm×40 cm),用pH為7.5的0～4 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行線性洗脫,流速1.5 mL·min-1,每7.0 mL為1個(gè)流份,根據(jù)每個(gè)流份的多糖含量繪制洗脫曲線,合并單一峰組分陽(yáng)性反應(yīng)的高峰部分;將DEAE-52層析柱分離純化的組分配制為20 mg·mL-1溶液,10 000 r·min-1離心2 min后取取5 mL上清液加入已平衡好的Q SepharoseTMFast Flow層析柱(3.0 cm×40 cm),用pH值為7.2的2～4 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行線性洗脫,流速1.5 mL·min-1,每9.0 mL為1個(gè)流份,根據(jù)每個(gè)流份的多糖含量繪制洗脫曲線,合并單一峰組分陽(yáng)性反應(yīng)的高峰部分.紫外光譜法[27]和紅外光譜法[28]分別用于鑒定純化后不同組分的純度和結(jié)構(gòu).

1.3.3 總糖含量和硫酸基含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸比色法[29]分別對(duì)EPC粗品、EPC酶解物及其純化組分的糖含量進(jìn)行測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)品多糖濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.004 5x+0.018 4,R2=0.999 6.使用氯化鋇-明膠比濁法[30]分別對(duì)EPC粗品、EPC酶解物及其純化組分的硫酸基含量進(jìn)行測(cè)定,硫酸基濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 8x+0.008 8,R2=0.999 1.

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù),所得結(jié)果均以值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.GraphPad Prism 9.0軟件用于計(jì)算EPC酶解物及其純化組分的濃度對(duì)各種自由基清除率的IC50值.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 EPC酶解物分離純化

EPC酶解物經(jīng)DEAE-52柱層析洗脫后獲得2個(gè)組分EPCⅠ和EPCⅡ,二者分別為較窄和較寬的洗脫尖峰,說(shuō)明2個(gè)組分的總糖含量和純度差異較大(圖1).EPCⅠ和EPCⅡ經(jīng)Q SepharoseTMFast Flow柱層析分離,EPCⅠ洗脫后獲得4個(gè)組分EPCⅠ-QⅠ、EPCⅠ-QⅡ、EPCⅠ-QⅢ和EPCⅠ-QⅣ,4個(gè)組分被連續(xù)洗脫,相對(duì)分子質(zhì)量較為接近,除EPCⅠ-QⅣ總糖含量較低外,其他3個(gè)組分的總糖含量也較為接近(圖2).EPCⅡ洗脫后同樣獲得4個(gè)組分EPCⅡ-QⅠ、EPCⅡ-QⅡ、EPCⅡ-QⅢ和EPCⅡ-QⅣ,前3個(gè)組分被連續(xù)洗脫,相對(duì)分子質(zhì)量較為接近,而EPCⅡ-QⅣ被單獨(dú)洗脫,相對(duì)分子質(zhì)量不同于前3個(gè)組分(圖3).

圖1 EPC酶解物經(jīng)DEAE-52柱洗脫曲線

圖2 EPCⅠ經(jīng)Q SepharoseTM Fast Flow柱洗脫曲線 圖3 EPCⅡ經(jīng)Q SepharoseTM Fast Flow柱洗脫曲線

2.2 EPC酶解物及純化組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)

EPC酶解物及其純化組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示.所有樣品的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于30%,硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于3%,表明EPC為一種硫酸化多糖.EPC經(jīng)酶解后總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯提高,說(shuō)明酶解過(guò)程對(duì)EPC具有良好的純化作用.EPC酶解物純化后的EPCⅠ和EPCⅡ總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較小,而二者的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化明顯.EPCⅠ純化后組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低;EPCⅡ純化后除了EPCⅡ-QⅠ總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高外其他組分均有降低,EPCⅡ純化后組分的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)同樣出現(xiàn)下降.表明柱層析純化對(duì)EPC的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有明顯影響.

表1 EPC酶解物及純化組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 EPC酶解物純化組分的純度鑒定

用紫外光譜分析EPC酶解物純化后不同組分的純度,結(jié)果見(jiàn)圖4.在190～450 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi),所有多糖純化組分的吸收峰均隨著波長(zhǎng)的增加而降低,在260 nm和280 nm處均無(wú)多肽、蛋白質(zhì)和核酸的特征吸收峰,表明酶解和分級(jí)純化能夠有效去除EPC的非多糖雜質(zhì),所獲得的多糖組分的純度較高.

圖4 EPC酶解物純化后不同組分的紫外光譜圖

2.4 EPC酶解物純化組分的紅外光譜分析

EPC酶解物不同純化組分的紅外光譜分析結(jié)果表明,所有純化組分均在3 700～3 000 cm-1內(nèi)具有較強(qiáng)的O-H伸縮振動(dòng),在1 620～1 670 cm-1內(nèi)顯示了較強(qiáng)的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和N-H變角振動(dòng),在1 380～1 460 cm-1內(nèi)均顯示明顯的C-H變角振動(dòng),這些吸收峰均為多糖物質(zhì)的特征峰.992 ～1 160 cm-1內(nèi)的O-H和C-O-C變角振動(dòng)表明所有純化組分均含有吡喃糖結(jié)構(gòu).EPCⅠ和EPCⅡ純化后的組分在1 350 cm-1處均具有S=O伸縮振動(dòng),表明這些組分均含有硫酸基團(tuán),并在951～957cm-1內(nèi)均顯示了呋喃糖衍生物A型的吸收峰.此外,866 cm-1附近的吸收峰表明EPCⅠ和EPCⅡ純化的后組分糖鏈中存在的糖苷鍵為β-構(gòu)型.而EPCⅠ和EPCⅡ在783～786 cm-1處的微弱吸收峰可能是吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)的吸收峰.

2.5 EPC酶解物及純化組分的抗氧化活性

表2 EPC酶解物及純化組分對(duì)4種自由基的清除率的IC50值

圖5 EPC酶解物及純化組分對(duì)4種自由基的清除能力

2.5.2 氧自由基吸收能力(ORAC) EPC酶解物及其純化組分對(duì)氧自由基吸收能力(ORAC)的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖6,ORAC值如表3所示.與EPC酶解物相比,EPCⅠ和EPCⅡ的ORAC值分別有所降低和升高,結(jié)合EPCⅡ?qū)ζ渌?種自由基的清除能力優(yōu)于EPCⅠ的特性,表明EPCⅠ可能為1個(gè)綜合抗氧化活性較差的大分子組分,而FPCⅡ則為1個(gè)綜合抗氧化活性較高的小分子組分.EPCⅠ純化后4個(gè)組分的ORAC值較EPCⅠ有所提高,但仍低于EPC酶解物和EPCⅡ.EPCⅡ純化后EPCⅡ-QⅠ和EPCⅡ-QⅡ的ORAC值高于EPCⅡ,而EPCⅡ-QⅢ和EPCⅡ-QⅣ的ORAC值低于EPCⅡ.其中EPCⅡ-QⅠ的ORAC值高達(dá)(1 523.98±21.17) μmol ·g-1,分別是EPC酶解物、EPCⅠ和EPCⅡ的3.21、14.62和2.69倍.表明EPC經(jīng)多級(jí)純化后能夠獲得抗氧化活性更高的多糖組分.

表3 EPC酶解物及純化組分的 ORAC 值

圖6 EPC酶解物及純化組分的熒光淬滅動(dòng)力學(xué)曲線

3 討論

本研究對(duì)EPC酶解物純化組分的純度、結(jié)構(gòu)及純化前后抗氧化活性的變化進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,EPC酶解物的兩次分級(jí)純化均獲得多個(gè)不同多糖組分,其是由多個(gè)單糖及其衍生物形成的相對(duì)分子質(zhì)量高的物質(zhì),具有一般天然多糖的高分子聚合性[2,34].高于30%的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及高于3%的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)表明EPC為一種硫酸化多糖,與之前Geresh等[13]對(duì)EPC相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定及流變性能的研究結(jié)果一致.酶解作用增加了EPC的純度,使其總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)得以提高,說(shuō)明酶解過(guò)程能夠有效地去除天然多糖組分中的大部分非多糖類雜質(zhì)[35].此外,本研究使用柱層析純化后獲得的EPC組分的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有明顯差異.紫外光譜掃描結(jié)果進(jìn)一步表明了酶解和分級(jí)純化后的EPC組分無(wú)多肽、蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì),均為高純度的多糖組分[36].對(duì)比以往對(duì)天然多糖物質(zhì)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)表征分析的研究結(jié)果[37-41],發(fā)現(xiàn)所有EPC組分均具有天然多糖物質(zhì)的特征官能團(tuán),多糖結(jié)構(gòu)以吡喃糖結(jié)構(gòu)為主.然而僅在EPCⅠ和EPCⅡ純化后的組分中檢測(cè)到硫酸基團(tuán)的S=O伸縮振動(dòng)、呋喃糖衍生物A型的特征峰和β-構(gòu)型糖苷鍵,表明多次分離純化改變了EPC組分結(jié)構(gòu)[22].

4 結(jié)論