董樂,傅俊杰,李世琪,王芳,林曉思,黃兆斌

(1.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 泉州 362000;2.泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院,福建 泉州 362000)

靈紅素(prodiginines,PGs)家族是一類由三吡咯結(jié)構(gòu)組成的微生物生物堿類天然紅色色素[1].PGs家族中的靈菌紅素(prodigiosin,PG)于粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中首次被發(fā)現(xiàn)[2],并從該菌中分離出PG純品,確定PG分子式為C22H29N3O[1].目前,PGs已被發(fā)現(xiàn)存在于沙雷氏菌屬(Serratia)[3]、假單胞菌屬(Pseudomonas)[4]、弧菌屬(Vibrio)[5]、霍氏菌屬(Hahella)[6]、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)[7]、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)[8]、鏈霉菌屬(Streptomyces)[9]、鄰米草菌屬(Spartinivicinus)[10]、無色桿菌屬(Achromobacter)[11]和李氏紅色菌屬(Zooshikella)[12]等多種微生物中.據(jù)報(bào)道,已鑒定結(jié)構(gòu)的PGs包括PG、十一烷基靈菌紅素、環(huán)庚基靈菌紅素(heptylprodigiosin,hPG)、間環(huán)靈菌紅素、鏈玉紅菌素B、靈菌紅素R1、壬基靈菌紅素、甲基環(huán)庚基靈菌紅素、類靈菌紅素以及鹽酸環(huán)狀靈菌紅素等[13].本實(shí)驗(yàn)室從紅色鄰米草菌(Spartinivicinusruber)菌株S2-4-1HT中分離鑒定獲得六氫環(huán)庚基靈菌紅素(six hydrogen cycloheptane prodigiosin,ShcPG),分子式為C22H27N3O[10].PG、十一烷基靈菌紅素和類靈菌紅素屬于線性三吡咯結(jié)構(gòu),其他靈紅素屬于環(huán)狀三吡咯結(jié)構(gòu)[10-11].PGs被證明具有抗痢疾內(nèi)變形蟲[1]、抗腫瘤[14]、抗炎癥細(xì)胞因子[15]、神經(jīng)調(diào)節(jié)[15]、抗氧化[15-16]、抗細(xì)菌[16]、抗真菌[17]、抗病毒[18]、抗瘧疾[19]、抗克氏錐蟲[20]、抗寄生蟲[21]、免疫抑制[22]、殺藻[23]和降解塑化劑[24]等作用.值得關(guān)注的是,PGs對正常細(xì)胞系具有低毒性或無毒性[16].在PGs的研究與開發(fā)上,PG相對較為深入.PG不僅被用于各種癌癥的實(shí)驗(yàn)藥物,且被用作先導(dǎo)物合成了一種靈菌紅素衍生物(GX15-070或簡稱obatoclax).Obatoclax被用于治療晚期慢性淋巴細(xì)胞白血病的I期臨床試驗(yàn)[18,25],并被證明具有良好的安全性[18].因此,PGs在臨床藥物開發(fā)、環(huán)境處理、食品添加劑制備等方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值,在全球市場上占有越來越重要的地位[26].

PGs可以通過化學(xué)合成和微生物生產(chǎn)進(jìn)行制備.PGs化學(xué)合成的步驟多、反應(yīng)成本高、合成速率低[26],而其微生物生產(chǎn)具有環(huán)境友好、條件溫和、低成本、易于工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn),因此,PGs的微生物生產(chǎn)被認(rèn)為是其制備的發(fā)展方向[26].然而,在PGs的微生物生產(chǎn)中目前仍存在著產(chǎn)量低的問題[26].高水平的微生物發(fā)酵色素產(chǎn)品依賴于優(yōu)良的微生物菌株和有效的發(fā)酵方法.PGs作為微生物的次生代謝產(chǎn)物,其生產(chǎn)取決于培養(yǎng)基組成、生產(chǎn)條件、發(fā)酵方法和微生物菌株等許多因素[27].

優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)的一個經(jīng)典方法是一次改變一個因素(如氮源、碳源、礦物質(zhì)、pH值、溫度等)而保持其他參數(shù)不變,但這一方法不僅耗時、費(fèi)力,而且不能確定各種參數(shù)的同時交互作用[28].響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)是同時考慮幾個因素變化時優(yōu)化工藝參數(shù)的最常用的統(tǒng)計(jì)工具,它不僅提供了關(guān)于直接效應(yīng)、成對組合交互效應(yīng)和變量參數(shù)的曲線變量效應(yīng)的全面知識[29],而且省時省力.

本實(shí)驗(yàn)室從紅色鄰米草菌菌株S2-4-1HT中分離鑒定了hPG和ShcPG(以下稱hPG+ShcPG),其中ShcPG為首次發(fā)現(xiàn),ShcPG的含量占hPG+ShcPG總含量的70%以上,并且ShcPG對腫瘤細(xì)胞A549的半抑制濃度(half-inhibitory concentration,IC50)值為(0.2261±0.0261) μmol/L,其抑制效果為PG的25倍、順鉑的42倍[10].因此,ShcPG具有極高的研究價(jià)值和抗腫瘤新藥開發(fā)潛力.目前,國內(nèi)PG的價(jià)格高昂,1 mg 98%純度PG的價(jià)格約3 000元,限制了其進(jìn)一步的開發(fā)和應(yīng)用,如何優(yōu)化微生物發(fā)酵條件提高PG產(chǎn)率依然是國內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)[30].ShcPG的研究重點(diǎn)在于:如何優(yōu)化S.ruber菌株S2-4-1HT通過搖瓶發(fā)酵產(chǎn)ShcPG的工藝,以提高ShcPG的產(chǎn)率.本研究通過單因素試驗(yàn)對菌株S2-4-1HT發(fā)酵工藝的培養(yǎng)基配方進(jìn)行考察,在此基礎(chǔ)上通過RSM實(shí)驗(yàn)對菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化,以期得到穩(wěn)定可靠的菌株S2-4-1HT搖瓶發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的發(fā)酵工藝參數(shù)數(shù)據(jù),旨在為ShcPG的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色鄰米草菌(S.ruber)菌株S2-4-1HT,由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中心(保藏編號:MCCC 1K03745T=KCTC 72148T),已完成對該菌株的形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA鑒定.PG(相對分子質(zhì)量為350)、ShcPG(相對分子質(zhì)量為352),純度均達(dá)98%以上,由本實(shí)驗(yàn)室純化制備,華僑大學(xué)分析測試中心核磁鑒定;金龍魚純正花生油,嘉里糧油(青島)有限公司生產(chǎn);海生菌肉湯2216(Marine Broth 2216,MB)和瓊脂粉,生物級,美國Becton,Dickinson and Company公司生產(chǎn);酵母粉胰蛋白胨,生物級,美國OXOID公司生產(chǎn);其他試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株解凍后劃線接種于MB的固體培養(yǎng)基上,于28 °C恒溫條件下培養(yǎng)48～72 h.挑取生長狀態(tài)好的紅色單菌落于MB的液體培養(yǎng)基中,于28 °C、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,待培養(yǎng)液呈紅色后于4 °C冷藏,備用.其中,配制每升MB液體培養(yǎng)基,應(yīng)在(多少)mL去離子水中加入37.4 g MB粉;配制每升MB固體培養(yǎng)基,應(yīng)在每升MB液體培養(yǎng)基中加入15.0 g瓊脂粉.

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 (1)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源氮源的確定.按照MB培養(yǎng)基成分配方,在其他成分不變的情況下,將碳源分別替換為葡萄糖和花生油,氮源分別替換為酵母粉、蛋白胨,并將碳源氮源進(jìn)行兩兩組合配制成4種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其中碳源和氮源的濃度均為5 mg/mL.4種發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌溫度降至室溫后,按1∶400的比例分別接入1.2.1中活化備用的菌液,于28 °C、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后,提取發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)物并進(jìn)行含量的測定.比較不同碳源氮源組合對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響,選擇最優(yōu)的碳源氮源組合進(jìn)行單因素試驗(yàn).

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn).按照MB培養(yǎng)基成分配方,其他成分不變,主要考察無水氯化鈣(以下簡稱氯化鈣)、六水合氯化鎂(以下簡稱氯化鎂)和檸檬酸鐵的添加量等因素對發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響.因素水平見表1.

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)因素水平

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取氯化鈣、氯化鎂、檸檬酸鐵的添加量作為自變量,以S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵液中hPG+ShcPG的質(zhì)量濃度為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的RSM中心組合設(shè)計(jì),優(yōu)化搖瓶發(fā)酵hPG+ShcPG的培養(yǎng)基配方.試驗(yàn)因素和水平見表2.

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)的因素水平

1.3 發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的測定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以hPG+ShcPG純品為標(biāo)準(zhǔn)樣品,以其無水乙醇溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),于535 nm下的吸光度(A535)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為y=0.123 4x+0.012 5(R2=0.999 1),表明hPG+ShcPG純品質(zhì)量濃度在0.547 0～7.020 0 mg/L時,A535值和hPG+ShcPG的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

1.3.2 發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的測定 發(fā)酵完成后,將S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵液和乙酸乙酯按照1∶1體積混合,充分超聲破碎菌體細(xì)胞,靜置后取8 mL上清液于10 000 r/min離心5 min.將離心后上清液全部移至另一離心管中,待乙酸乙酯揮發(fā)完全即獲得hPG+ShcPG產(chǎn)物.用無水乙醇溶解hPG+ShcPG產(chǎn)物并全部轉(zhuǎn)移到10 mL比色管中,定容至5 mL.定容后的溶液于10 000 r/min離心5 min,移取上清液,采用比色法測定溶液中的hPG+ShcPG產(chǎn)量.

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)均為3次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.采用Design-Expert 8.0.6分別對發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)、方差分析及二次方差分析、繪制等高線圖和響應(yīng)曲面圖,采用Microsoft Office 2019進(jìn)行基本的圖表制作、繪制單因素試驗(yàn)相關(guān)曲線圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源氮源的確定

不同碳源氮源組合下hPG+ShcPG的產(chǎn)量見表3.由表中可知,在相同碳源和氮源濃度下,花生油和蛋白胨組合培養(yǎng)時S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵液中hPG+ShcPG濃度最大,且與其他組合相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

表3 不同碳源氮源組合下hPG+ShcPG的產(chǎn)量

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

2.2.1 花生油添加量對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響 花生油添加量對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖1.由圖可知,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中花生油添加量在(0.5～2.0) mg/mL時,hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)花生油濃度大于4.0 mg/mL時,hPG+ShcPG產(chǎn)量開始降低;并且當(dāng)花生油添加量為2.0 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的產(chǎn)量達(dá)最大值.因此,發(fā)酵培養(yǎng)基中的花生油添加量在(1.0～4.0) mg/mL時適合S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG.

圖1 不同花生油添加水平下hPG+ShcPG產(chǎn)量 圖2 不同蛋白胨添加水平下hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.2.2 蛋白胨添加量對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響 蛋白胨添加量對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖2.由圖可知,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨添加量為0.5～4.0 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.0～8.0 mg/mL時,hPG+ShcPG的產(chǎn)量呈下降趨勢;當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.0 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值.因此,發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨添加量為2.0～8.0 mg/mL時適合S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG.

2.2.3 氯化鈣添加量對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響 氯化鈣添加量對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖3.由圖可知,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈣添加量為0.05～0.45 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)氯化鈣添加量大于1.35 mg/mL時,hPG+ShcPG的產(chǎn)量急劇下降,并且當(dāng)氯化鈣添加量為0.45 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值,因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時,培養(yǎng)基中的氯化鈣添加量適合選擇在0.05～1.35 mg/mL.

圖3 不同氯化鈣添加水平下hPG+ShcPG產(chǎn)量 圖4 不同氯化鎂添加水平下hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.2.4 氯化鎂添加量對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響 氯化鎂添加量對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖4.由圖可知,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鎂添加量為0.0～6.0 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)氯化鎂添加量大于6.0 mg/mL時,hPG+ShcPG的產(chǎn)量開始下降;當(dāng)氯化鎂添加量為6.0 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值.因此,在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時,培養(yǎng)基中的氯化鎂添加量適合選擇在0.0～12.0 mg/mL.

2.2.5 檸檬酸鐵添加量對hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響 檸檬酸鐵添加量對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的影響見圖5.由圖可知,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵添加量為0.02～0.10 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)檸檬酸鐵添加量大于0.50 mg/mL時,hPG+ShcPG的產(chǎn)量開始下降;當(dāng)檸檬酸鐵添加量為0.10 mg/mL時,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量達(dá)最大值.因此,在S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG發(fā)酵的RSM法優(yōu)化分析確定最佳工藝參數(shù)水平時,培養(yǎng)基中的檸檬酸鐵添加量適合選擇在0.02～0.50 mg/mL.

圖5 不同檸檬酸鐵添加水平hPG+ShcPG產(chǎn)量

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方RSM法優(yōu)化分析

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與最佳工藝參數(shù)確定 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,依據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理,采用3 因素3 水平的RSM分析法,以發(fā)酵液中hPG+ShcPG質(zhì)量濃度為響應(yīng)值,結(jié)果見表4.

表4 酵培養(yǎng)基RSM法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸分析,試驗(yàn)結(jié)果如表5,得到hPG+ShcPG質(zhì)量濃度的回歸方程為

表5 hPG+ShcPG發(fā)酵培養(yǎng)基RSM中心組合設(shè)計(jì)的方差分析

Y=4.43+0.54A-0.50B-0.73C+0.17AB+0.03AC-0.15BC-0.35A2-0.85B2-1.98C2.

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果建立的回歸方程進(jìn)行分析和擬合,得到響應(yīng)面對應(yīng)的等高線圖和響應(yīng)曲面圖,見圖6.響應(yīng)面圖中若圖形越陡峭,則說明兩因素間的交互作用影響越顯著;若圖形越平坦反而影響越不顯著.等高線圖可以根據(jù)其圖形的形狀來判斷其交互影響的程度,若圖形為橢圓且密集則交互現(xiàn)象越明顯.

圖6 氯化鈣、氯化鎂與檸檬酸鐵的添加水平對hPG+ShcPG產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖(A)和等高線圖(B)

由響應(yīng)面分析圖分析3個因素對S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的作用.圖6(1)和圖6(2)中三維曲面圖較平緩,且圖6(1)和圖6(2)等高線圖形接近圓形,表明氯化鈣和氯化鎂的添加量、氯化鎂和檸檬酸鐵的添加量的交互作用的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).圖6(3)中高線圖形接近橢圓形,但圖6(3)三維曲面圖較平緩,表明氯化鈣和檸檬酸鐵的添加量的交互作用的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).

若將B和二次項(xiàng)A2、交互項(xiàng)AB、AC、BC從回歸方程中剔除,且將其平方和和自由度并入實(shí)驗(yàn)誤差,進(jìn)行第二次方差分析,結(jié)果見表6.

表6 hPG+ShcPG發(fā)酵培養(yǎng)基RSM中心組合設(shè)計(jì)的二次方差分析

二次方差分析表明,各項(xiàng)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且失擬項(xiàng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).因此hPG+ShcPG質(zhì)量濃度的回歸方程為

Y=4.30+0.45A-0.66C-0.53B2-2.02C2.

在3個試驗(yàn)因素的編碼范圍內(nèi),Excel規(guī)劃求解得到發(fā)酵液中hPG+ShcPG產(chǎn)量的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:氯化鈣、氯化鎂和檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度分別為1.35、9.00、0.22 mg/mL.在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方條件下hPG+ShcPG產(chǎn)量預(yù)測值為4.81 mg/L.

2.3.2 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基工藝參數(shù)驗(yàn)證性試驗(yàn) 按照MB培養(yǎng)基成分配方,其他成分不變,氯化鈣、氯化鎂和檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度分別為1.35、9.00和0.22 mg/mL的配方工藝下,S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG產(chǎn)量的驗(yàn)證值為(4.86±0.30) mg/L(n=3),與預(yù)測值接近(P<0.05),證明了RSM法優(yōu)化S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的最佳培養(yǎng)基配方的可行性.

3 結(jié)論

S.ruber菌株S2-4-1HT發(fā)酵產(chǎn)hPG+ShcPG的培養(yǎng)基配方優(yōu)化為:花生油、蛋白胨、氯化鈣、氯化鎂和檸檬酸鐵的質(zhì)量濃度分別為2.00、4.00、1.35、9.00、0.22 mg/mL.在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方工藝下發(fā)酵48 h,hPG+ShcPG的產(chǎn)量為(4.86±0.30) mg/L,是用MB培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)量的19.44倍,且預(yù)測值和測定值的絕對差值小于5%,表明回歸模型可靠.