徐永健 柏 揚(yáng) 潘 霞 張文馨

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧波 315211)

大海馬(Hippocampus kudaBleeker)為珍稀小型魚類,主要分布在印度太平洋沿岸[1],是《中國(guó)藥典》錄用的5種藥用海馬之一,有較高的藥用價(jià)值。大海馬還有較高的觀賞和收藏價(jià)值[2,3]。近些年來(lái),海馬的國(guó)際貿(mào)易交易很大,市場(chǎng)供需矛盾較為嚴(yán)重,推動(dòng)了人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而,當(dāng)前養(yǎng)殖中存在著一些問(wèn)題導(dǎo)致人工養(yǎng)殖效益差,其中大部分問(wèn)題來(lái)源于養(yǎng)殖系統(tǒng)中的環(huán)境脅迫[4—7]。許多問(wèn)題已被重視并開始研究和解決,但還有一些仍被忽視,如養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水質(zhì)不均一性現(xiàn)象,即養(yǎng)殖容器不同位置水質(zhì)存在細(xì)微的差異,并隨著養(yǎng)殖時(shí)間延長(zhǎng)形成較大的差異[8,9],這種水質(zhì)的微梯度差異可能會(huì)影響到養(yǎng)殖魚類的生長(zhǎng)和發(fā)育,甚至?xí)黾訉?duì)病原生物的易感性[10—12],特別是像海馬這一類對(duì)環(huán)境極度敏感的生物。盡管大海馬適合生長(zhǎng)的水溫和鹽度的范圍較寬[13],但其不同階段的生長(zhǎng)和發(fā)育都極易受到溫度或鹽度波動(dòng)的影響[13]。這些影響表現(xiàn)在: 生長(zhǎng)、存活率[13]、攝食行為、攝食效率[14]、養(yǎng)殖產(chǎn)品藥用品質(zhì)[15]和其腸道菌群組成[16]等。然而,養(yǎng)殖管理經(jīng)驗(yàn)和水質(zhì)調(diào)控技術(shù)的提高并沒(méi)有增加大海馬的養(yǎng)殖效率,內(nèi)在原因尚不清楚。

我們推測(cè)可能是養(yǎng)殖系統(tǒng)中的微環(huán)境間水質(zhì)的不均勻性造成的,并開展了驗(yàn)證。在前期的有關(guān)試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),大海馬對(duì)鹽度或溫度變化具有一定的緩沖能力,只是這種能力較其他生物相對(duì)弱,但是只要及時(shí)處置,幼體生長(zhǎng)仍不會(huì)受到影響。本實(shí)驗(yàn)的目的就是通過(guò)觀察海馬幼體外部和內(nèi)部指標(biāo)變化,研究短期鹽度變化對(duì)大海馬幼體的影響。外部指標(biāo)選擇攝食行為,內(nèi)部指標(biāo)包括生理生化指標(biāo)和相關(guān)敏感基因。由于基因表達(dá)的復(fù)雜性和操作的延時(shí)性[17],不適合對(duì)養(yǎng)殖進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的指導(dǎo)。本研究分析了外部指標(biāo)與內(nèi)部指標(biāo)的關(guān)系,希望找出一個(gè)或多個(gè)外部行為參數(shù)可以反映養(yǎng)殖系統(tǒng)中鹽度的過(guò)量變化/波動(dòng)對(duì)大海馬幼體生長(zhǎng)的影響,最終通過(guò)篩選的外部參數(shù)對(duì)大海馬的養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè),及時(shí)處置有關(guān)情況的發(fā)生,使得養(yǎng)殖中的溫鹽變化在大海馬的緩沖范圍內(nèi),保證大海馬始終處于其適宜的生長(zhǎng)環(huán)境條件中。

1 材料與方法

1.1 海馬來(lái)源與暫養(yǎng)

試驗(yàn)所用的大海馬幼體來(lái)自于寧波大學(xué)海馬養(yǎng)殖基地,平均體重為(0.2759±0.0309) g,平均體長(zhǎng)為(4.96±0.34) cm。試驗(yàn)前將海馬幼體在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周,水溫(25±0.5)℃,鹽度25,光強(qiáng)1000 lx,光周期L14h∶D10h。每日早上7時(shí)和下午3時(shí)喂食兩次初孵鹵蟲幼體,投喂約2h后抽吸掉糞便和沉底殘?jiān)?并更換約20%的海水。在試驗(yàn)開始前1天,對(duì)幼體禁食24h。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用16個(gè)規(guī)格為40 cm×40 cm×40 cm玻璃缸,分別加入不同鹽度的海水,鹽度設(shè)置分別為17(處理記為17S,下同)、19(19S)、21(21S)、23(23S)、25(25S)、27(27S)、29(29S)和31(31S),其他條件同暫養(yǎng)。然后將480尾暫養(yǎng)的大海馬幼體隨機(jī)從暫養(yǎng)池中直接分到16個(gè)玻璃缸中,每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)重復(fù)(共60尾)。幼體在不同鹽度條件下生活12h,然后開始取樣觀察與分析。

攝食行為觀察每組隨機(jī)選取6—8尾大海馬幼體進(jìn)行行為觀察,錄制其攝食行為視頻用于后續(xù)反復(fù)觀察與分析。

行為拍攝用的玻璃缸規(guī)格為L(zhǎng)15 cm×W10 cm×H13 cm。兩個(gè)SONY 2216E便攜式攝像機(jī)分別設(shè)置于該缸的正上方和正前方,同時(shí)用于記錄其攝食行為。缸內(nèi)的水溫、鹽度和光強(qiáng)等條件與原實(shí)驗(yàn)環(huán)境相同。每次拍攝一組幼體的攝食行為。具體步驟為: 讓大海馬幼體在拍攝新環(huán)境中適應(yīng)60min,然后投喂密度為1 ind./mL的活鹵蟲幼體。攝像機(jī)在投喂前5min開始記錄,并持續(xù)45min。根據(jù)記錄的視頻分析各處理組的以下3個(gè)攝食行為參數(shù)。

攝食響應(yīng)時(shí)間(s): 從鹵蟲進(jìn)入水中到第一次被捕食的經(jīng)歷時(shí)間;

進(jìn)食速率(ind./min): 在6min至15min共10min內(nèi),大海馬幼體所進(jìn)食鹵蟲幼體的平均速率;

攝食量(ind./次): 在整個(gè)喂食期間,大海馬幼體所進(jìn)食的鹵蟲幼體總數(shù)。

生理生化指標(biāo)測(cè)定從各處理中隨機(jī)選取9尾大海馬幼體,分為3組,均漿離心后進(jìn)行生理生化分析。有關(guān)指標(biāo)包括: 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、脂肪酶(LPS)、淀粉酶(AMS)和胰蛋白酶。酶活性和總蛋白定量測(cè)定(BCA法)的試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定和分析。

RNA提取和cDNA合成各處理組同樣選取9尾大海馬幼體,也分為3組。麻醉后,解剖幼體,取出肝臟組織并立即轉(zhuǎn)移到RNA Keeper組織穩(wěn)定液中(中國(guó)南京瓦酶生物技術(shù)有限公司)。分析時(shí)取出組織,加入RNAiso PLUS溶液,將溶解的組織溶液離心,上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。向新管中加入氯仿,再次混合離心和吸取上層無(wú)色溶液,再轉(zhuǎn)移到另一根新管中。加入等量的異丙醇混勻,讓RNA沉淀。然后離心得到RNA白色沉淀,用乙醇洗滌兩次,最后加入DEPC水進(jìn)行下一步分析。在260和280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定RNA溶液濃度,用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其純度和完整性。然后在20 μL的體系中加入適量的總RNA、gDNA Remover、隨機(jī)引物和RNase-free水,按照TRANS反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書完成基因組DNA的去除和cDNA的合成。將得到的cDNA稀釋8倍,進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)。

基因表達(dá)的定量PCR (qPCR)分析相關(guān)分析的基因從H.kuda轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中選取[18]。用Primer premier 5設(shè)計(jì)出引物,引物序列見表 1。PCR擴(kuò)增采用Eppendorf realplex4 real-time PCR系統(tǒng)(Eppendorf,德國(guó))和TB Green Premix ExTaqTMⅡ(大連TaKaRa有限公司)。RT-PCR程序?yàn)? 預(yù)變性:95℃下2 min;變性: 95℃下10s,退火: 在58℃下15s,延伸: 在72℃下30s,循環(huán)(變性、退火、延伸)40次,繪制熔解曲線。選擇β2-微球蛋白(Beta-2 microglobulin,β2M)為內(nèi)參基因,目標(biāo)基因的相對(duì)定量計(jì)算使用2-ΔΔCt方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析,直方圖采用Origin 8軟件繪制。采用Duncan單因素方差分析(One-Way variance analysis)及多重比較法分析各處理組之間的顯著性差異程度,*表示在P＜0.05水平上存在顯著性差異。相關(guān)分析采用Pearson檢驗(yàn),*表示0.05水平(雙側(cè))顯著相關(guān),**表示0.01水平(雙側(cè))顯著相關(guān)。所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 鹽度變化對(duì)攝食行為的影響

從25S對(duì)照處理開始,隨著鹽度的升高或降低,大海馬幼體對(duì)鹵蟲的攝食響應(yīng)時(shí)間都在逐漸增加。所有低鹽處理(鹽度低于25的處理)和29S、31S兩個(gè)高鹽處理(鹽度高于25的處理)中的響應(yīng)時(shí)間均顯著高于對(duì)照處理組(P＜0.05),并在17S和31S處理中有最大的攝食響應(yīng)時(shí)間(圖1),說(shuō)明在此兩個(gè)處理中的鹽度條件下,大海馬幼體對(duì)食物最不敏感。

圖1 不同鹽度處理下大海馬幼體攝食行為的參數(shù)變化Fig.1 Parameter changes of feeding behavior of juvenile H.kuda in different salinity treatments

從對(duì)照處理開始,隨著鹽度的升高或降低,海馬的進(jìn)食速率卻在逐漸減少。其中17S、19S、21S和31S處理均低于25S(P＜0.05),最大降幅出現(xiàn)在17S和31S(圖1);但23S、27S和29S處理與對(duì)照間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

大海馬幼體的攝食量也隨鹽度的改變而逐漸下降。其中,17S、19S和29S、31S處理中鹵蟲的攝入量均顯著低于25S(P＜0.05);而21S、23S、25S和27S4處理之間不存在顯著性差異(圖1)。

2.2 鹽度變化對(duì)酶活性的影響

在短期鹽度變化過(guò)程中,大海馬幼體體內(nèi)的SOD與CAT、ACP與AKP間的酶活性變化相似,這2對(duì)酶的活性與鹽度變化的相關(guān)性不強(qiáng)(圖2)。此外,鹽度變化對(duì)LPS活性影響也不很明顯,僅17S處理有所升高,29S和31S較25S有顯著降低(P＜0.05)。所有處理中的消化酶AMS的活性均有顯著升高(P＜0.05),且隨鹽度降低不斷增加,隨鹽度升高而不斷減小(圖2)。胰蛋白酶活性在低鹽度處理與對(duì)照相差不大,而在高鹽度處理中均有顯著性提高。MDA含量只在低鹽度的17S、19S和21S處理中有顯著性上升(P＜0.05)。

圖2 不同鹽度處理下大海馬幼體幾種酶活性和MDA含量的變化(n=9)Fig.2 Changes of several enzyme activities and MDA content in juvenile H.kuda in different salinity treatments (n=9)

2.3 鹽度變化對(duì)基因表達(dá)的影響

攝食相關(guān)基因的表達(dá)在不同鹽度脅迫下,Pyy基因(肽YY基因)的表達(dá)在各處理中有所差異。除27S處理外,其余各處理中Pyy基因的表達(dá)量比對(duì)照均有顯著性上調(diào),31S處理有最大的上調(diào)倍數(shù)(圖3)。而Mtor基因的表達(dá)量?jī)H在17S處理中有顯著性上調(diào),在其他處理均低于25S的表達(dá)量(P＜0.05)?？傊?這2個(gè)基因在17S處理中均有顯著上調(diào)表現(xiàn),表達(dá)量分別為對(duì)照的2—4倍(圖3)。

圖3 不同鹽度處理大海馬幼體中的食性相關(guān)基因表達(dá)(n=9)Fig.3 Expressions of feeding-related genes of juvenile H.kuda in different salinity treatments (n=9)

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物設(shè)計(jì)序列Tab.1 Primers pair sequences for RT-PCR

應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)與25S相比,除21S和27S處理外,其余各個(gè)鹽度下大海馬幼體體內(nèi)的Sod基因的表達(dá)量均高于對(duì)照(P＜0.05),在鹽度19中有最高的表達(dá)量;Gst基因的表達(dá)量在所有處理中與對(duì)照相似或略有下降(圖4)。此外,Hsp70和Hsp90的表達(dá)僅在17S處理中有顯著性升高,在其余各處理中的表達(dá)均下調(diào)(圖4)。

圖4 不同鹽度處理大海馬幼體中的應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)(n=9)Fig.4 Expressions of stress-related genes of juvenile H.kuda in different salinity treatments (n=9)

凋亡相關(guān)基因的表達(dá)在不同鹽度脅迫下,大海馬幼體中的凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Casp9、P53、Gadd45α和Casp3的表達(dá)如圖5。其中,Gadd45α和Casp3在各處理中的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(P＜0.05),特別是隨著鹽度的升高,兩基因的表達(dá)量隨鹽度變幅的增大而逐漸增加。另外在3個(gè)基因Bcl-2、P53和Casp9中,Bcl-2在所有處理中的表達(dá)量均比25S低,而P53和Casp9也僅在17S處理中有所升高(P＜0.05),在其余各處理中也均下降(圖5)。

圖5 不同鹽度處理大海馬幼體中的凋亡相關(guān)基因表達(dá)(n=9)Fig.5 Expressions of apoptosis-related genes of juvenile H.kuda in different salinity treatments (n=9)

代謝相關(guān)基因的表達(dá)在鹽度脅迫下,8個(gè)與能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況如圖6。Pdha1和Mdh1在除17S處理外的各處理中的表達(dá)量均顯著低于25S(P＜0.05)。Idh3b的表達(dá)量隨著鹽度變幅的增大而逐漸增加。G6pd在各處理(除17S外)中的表達(dá)量均比對(duì)照高,基本上也隨鹽度變幅增大而逐漸增加,分別于19S和29S中有最高的表達(dá)量(圖6)。此外,脂肪酸代謝相關(guān)基因Cpt1僅在17S和19S處理中的表達(dá)量有所上升,Fas僅在17S和21S處理中表達(dá)上升,其余各處理均為顯著性下調(diào)。在各鹽度脅迫下Cyp51的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著性降低(P＜0.05),而Fadsd6僅在27S中表達(dá)增加,在17S、29S和31S中下調(diào)(圖6)。

圖6 不同鹽度處理下大海馬幼體體內(nèi)代謝相關(guān)基因的表達(dá)(n=9)Fig.6 Expressions of metabolism-related genes of juvenile H.kuda in different salinity treatments (n=9)

2.4 相關(guān)分析

從上述分析看,本試驗(yàn)中的所有基因的表達(dá)水平都與鹽度變化密切相關(guān)。由相關(guān)性分析的表 2可知,除Casp3基因與其他基因呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)外,Hsp70、Hsp90、Bcl-2、P53、Casp9、Cpt1、Fas、Pdha1、Mdh1和Mtor基因間均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。特別是這些基因與調(diào)控海馬攝食行為的Mtor基因表達(dá)間有密切的相關(guān)性(P＜0.01)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),有以下5個(gè)基因(Gadd45α、Cpt1、Idh3b、Sod和Pyy)與海馬的攝食行為的參數(shù)之間存在有顯著相關(guān)關(guān)系(表3)。與此同時(shí),MDA、AMS兩個(gè)酶的活性也與外部行為參數(shù)之間存在有顯著相關(guān)關(guān)系(表3),表現(xiàn)為與攝食響應(yīng)時(shí)間呈正相關(guān)性(P＜0.01),與進(jìn)食速率和攝食量呈負(fù)相關(guān)性(P＜0.01)。

表2 鹽度脅迫下各基因表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between gene expression under salinity stresses

表3 內(nèi)外部指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between external and internal indexes

根據(jù)以上的分析,選取表 3中大海馬幼體在鹽度脅迫下同時(shí)發(fā)生變化的內(nèi)部和外部指標(biāo)共5個(gè),并繪制出這些指標(biāo)的關(guān)系(圖7)。

圖7 鹽度脅迫下大海馬幼體的內(nèi)部與外部指標(biāo)間的關(guān)系Fig.7 Relationships between internal and external indexes of H.kuda under salinity stresses

3 討論

3.1 鹽度變化對(duì)攝食行為的影響

攝食行為的變化可以作為生物對(duì)環(huán)境急性變化的應(yīng)激指標(biāo)[19]。鹽度的變化會(huì)影響魚類的進(jìn)食速率、食物攝入量和攝食成功率[16,20]。在本研究中,大海馬幼體的攝食行為隨鹽度變化而改變。隨著鹽度變幅的增大,其攝食響應(yīng)時(shí)間逐漸增加,進(jìn)食速率逐漸降低,攝食量也逐漸減少。海洋青鳉(Oryzias melastigma)在鹽度脅迫下的攝食行為也有類似的結(jié)果[16],歐洲鱸[21]在低鹽度脅迫下減少攝食量。此外,在鯉(Cyprinus carpio)[22]、金頭鯛(Sparus aurata)[23]和黑鯛(Acanthopagrus butcheri)[24]中也報(bào)道了鹽度增加導(dǎo)致魚類攝食減少,可能是鹽度的變化會(huì)導(dǎo)致滲透壓、激素含量和能量代謝的變化所致[25]。此外,鹽度變化還會(huì)影響消化酶活性和養(yǎng)分運(yùn)輸[26—28],并最終影響了魚類的進(jìn)食行為。然而鹽度對(duì)大海馬幼體攝食行為的影響小于溫度[18],這可能是由于大海馬是一種廣鹽性魚類(適宜鹽度范圍為10—32)。因此,鹽度的微小變化對(duì)其攝食行為幾乎沒(méi)有影響[13],魚類的味覺(jué)系統(tǒng)和食物感知系統(tǒng)也沒(méi)有受到影響[29]。

3.2 鹽度變化對(duì)內(nèi)部指標(biāo)的影響

鹽度的變化不僅導(dǎo)致了大海馬幼體體內(nèi)SOD、CAT、MDA、AKP和ACP活性或含量的變化,而且還導(dǎo)致了消化酶活性的變化。SOD和CAT是重要的抗氧化酶[30],MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物分解的最終產(chǎn)物,是反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平的生物標(biāo)志物之一[31]。AKP和ACP是魚體內(nèi)重要的免疫和代謝調(diào)節(jié)的指標(biāo)[32]。因此,鹽度的變化影響了大海馬幼體的生理生化反應(yīng)。Shi等[33]也有類似報(bào)道。這些酶活性變化可以在一定程度上反映消化的生理特征(即攝食食欲)[34]。因此,內(nèi)部生理生化指標(biāo)的分析可以進(jìn)一步支持鹽度對(duì)外部行為影響的結(jié)果。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)MDA含量或AMS活性與外部行為參數(shù)存在顯著相關(guān)性。MDA含量隨鹽度變化幅度的增大而增加,即鹽度變化幅度越大,MDA在幼體體內(nèi)積累得越多,受到的氧化損傷越大,越有可能改變幼體的外部行為。鹽度的變化也促進(jìn)AMS活性,當(dāng)鹽度變幅增大,AMS活性逐漸增強(qiáng),推測(cè)AMS活性的增加可能在幼體應(yīng)對(duì)鹽度脅迫中起了重要作用。因此,MDA和AMS可能與外部行為參數(shù)的變化存在更緊密的關(guān)系。

魚類的攝食行為和攝食食欲通常是由營(yíng)養(yǎng)、代謝等內(nèi)部因素和溫度、鹽度、光周期等外部因素共同決定的,最終由基因和激素調(diào)節(jié)來(lái)改變[35]。近年來(lái),對(duì)海馬分子機(jī)制的研究逐漸深入,但對(duì)海馬攝食調(diào)控的研究卻較少[36]。本研究首次測(cè)定了大海馬幼體肝臟中兩個(gè)攝食相關(guān)基因Pyy和Mtor的表達(dá)水平,這2個(gè)基因在魚類攝食調(diào)控中都非常重要[36]。Pyy因具有抑制胃腸道蠕動(dòng)、使機(jī)體產(chǎn)生飽腹感、降低攝食食欲的作用,被廣泛應(yīng)用于攝食行為的研究中[37]。Mtor是魚食欲中央調(diào)節(jié)的重要上游調(diào)節(jié)者之一[38,39]。在本研究中,Pyy與鹽度脅迫下的攝食行為參數(shù)顯著相關(guān)。而Mtor基因表達(dá)僅在17S處理組中有所升高,在其他處理組中均顯著下調(diào)。因此,Pyy可能是指示大海馬幼體攝食行為和鹽度變化的潛在生物標(biāo)志物。

其他基因的表達(dá)在鹽度脅迫下也發(fā)生了變化。Sod、Hsp70、Hsp90和Gst是反映鹽脅迫氧化應(yīng)激的候選基因,氧化應(yīng)激是生物應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分[40]。溫度和鹽度的變化會(huì)對(duì)水生生物造成應(yīng)激,進(jìn)而引發(fā)氧化損傷[41]。在本研究中,通過(guò)測(cè)定這些基因的表達(dá)來(lái)研究鹽度脅迫對(duì)大海馬幼體的影響。在鹽度脅迫下,只有Sod的表達(dá)與外部行為參數(shù)有較好的相關(guān)性。這說(shuō)明鹽度脅迫與Sod表達(dá)有一定的關(guān)系。許多研究表明,在一定范圍內(nèi),隨著鹽度的增加或減少,會(huì)顯著促進(jìn)Sod的表達(dá),從而增強(qiáng)其抗氧化能力,如鰻鱺(Anguillidae)[42]、黑雙鋸魚(Amphiprion melanopus)[43]和巴西紅耳龜(Trachemys scripta elegans)[44]。氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞內(nèi)大分子的損傷,加重細(xì)胞凋亡[45]。在本研究中,測(cè)定了Bcl-2、Casp9、p53、Gadd45α和Casp3細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。其中Bcl-2、Casp3、Casp9、P53與Mtor基因相關(guān)性顯著,Gadd45α與外部行為參數(shù)相關(guān)性顯著。與Bcl-2不同的是,Casp9、P53、Gadd45α和Casp3對(duì)鹽度的輕微變化表現(xiàn)出極大的敏感性。Casp3調(diào)控相關(guān)酶的合成并進(jìn)行細(xì)胞凋亡,Gadd45α是一種重要的DNA損傷識(shí)別和修復(fù)基因[46],有望成為一種新的基因毒性生物標(biāo)志物[47]。它們表達(dá)量的增加表明細(xì)胞損傷已經(jīng)發(fā)生。然而在所測(cè)試的5個(gè)基因中,只有Gadd45α與外部行為參數(shù)密切相關(guān),這表明損傷在控制范圍內(nèi)[46],又一次證明大海馬是一種廣鹽性魚類,輕微的鹽度變化對(duì)細(xì)胞損傷影響不大。因此,Gadd45α更適合作為鹽度變化的生物標(biāo)志物。

氧化應(yīng)激也會(huì)影響生物代謝[48]。本研究測(cè)定了Fadsd6、Cpt1、Idh3b、G6pd、Fas、Cyp51、Pdha1和Mdh1的代謝相關(guān)基因。其中,Cpt1的表達(dá)與外部行為參數(shù)顯著相關(guān),2個(gè)鹽度單位的變化會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)量的顯著降低,并隨著鹽度變化幅度的增大而逐漸增加。Cpt1和Fas在低鹽脅迫下的表達(dá)量高于其在高鹽脅迫下的表達(dá),表明在低鹽脅迫下,脂肪酸代謝可能發(fā)揮了更重要的作用。Cyp51的表達(dá)也明顯下降,這可能與膜流動(dòng)性和滲透調(diào)節(jié)有關(guān)。此外,Idh3b的表達(dá)也與外部行為參數(shù)顯著相關(guān)。鹽度的變化會(huì)導(dǎo)致魚類體內(nèi)滲透壓的變化,魚類需要消耗大量的能量來(lái)維持穩(wěn)態(tài)和滲透平衡。肝臟通過(guò)滲透調(diào)節(jié)提供能量、碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝是能量代謝的重要組成部分[49]。有研究報(bào)道,在低鹽度條件下,碳水化合物代謝為南美白對(duì)蝦提供了平衡滲透壓的能量[50]。同樣在低鹽度時(shí),Idh3b在海鱸魚鰓中的表達(dá)顯著上調(diào)[51]。在本研究中,隨著鹽度變幅增大,Idh3b在大海馬幼體肝臟中的表達(dá)量逐漸增加,且Idh3b表達(dá)量與外部行為參數(shù)存在顯著相關(guān)性。Idh3b和G6pd在各處理中的表達(dá)量也均高于對(duì)照。因此,推測(cè)能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的增加為機(jī)體維持滲透壓平衡提供了大量能量,從而導(dǎo)致食物攝入量減少。肝臟AMS酶活性與外部行為指標(biāo)密切相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)。因此,Idh3b和Cpt1可能是指示鹽度變化的重要潛在分子標(biāo)記。

3.3 鹽脅迫下內(nèi)外指標(biāo)的關(guān)系

在鹽度脅迫下,大海馬幼體的許多生理生化指標(biāo)和功能基因發(fā)生了變化。如Hsp70、Hsp90、Bcl-2、P53、Casp3、Casp9、Cpt1、Fas、Pdha1、Mdh1和Mtor表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào)。這些基因?qū)Νh(huán)境變化敏感,且與本研究鹽度變化密切相關(guān),可作為進(jìn)一步研究的綜合指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的5個(gè)基因(Sod、Gadd45α、Cpt1、Idh3b和Pyy)和2個(gè)生理生化指標(biāo)(MDA和AMS),涉及抗氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷、能量代謝和營(yíng)養(yǎng)攝取等功能。這些功能基因的變化直接影響海馬幼體的生長(zhǎng)和發(fā)育,同時(shí)對(duì)鹽度脅迫較為敏感。因此,這是一個(gè)內(nèi)部監(jiān)測(cè)指標(biāo)體系,可用于表明鹽度對(duì)大海馬生長(zhǎng)的影響。

在短期的鹽度變化下,大海馬幼體的外部指標(biāo)也發(fā)生了規(guī)律性的變化,攝食響應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),進(jìn)食速率和攝食量降低,表明了有效營(yíng)養(yǎng)攝入減少,幼體生長(zhǎng)即將減緩。由上述分析可知,本研究攝食行為的內(nèi)部指標(biāo)(調(diào)控基因)與外部參數(shù)之間存在密切的相關(guān)性。攝食響應(yīng)時(shí)間參數(shù)、進(jìn)食速率參數(shù)與攝食量這3個(gè)外部的行為參數(shù)能正確反映與生長(zhǎng)密切相關(guān)的生理、生化和敏感功能基因的變化,說(shuō)明外部參數(shù)能反映了內(nèi)部指標(biāo)的變化。通過(guò)直接觀察和分析這些外部參數(shù),可以及時(shí)、快速地檢測(cè)到海馬生長(zhǎng)的養(yǎng)殖環(huán)境的變化。此外,結(jié)合內(nèi)部指標(biāo),外部參數(shù)也增加了敏感性和定量特征?？傊?這一結(jié)果說(shuō)明可能是一個(gè)重要的潛在生物標(biāo)志物,可以用來(lái)反映鹽度微變化對(duì)大海馬幼體生長(zhǎng)的影響。

4 結(jié)論

在短期鹽度變化的影響下,大海馬幼體的攝食行為呈規(guī)律性變化,變化幅度越大,攝食反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng),攝食率和攝食量越低,均表明大海馬幼體的營(yíng)養(yǎng)攝取量減少。同時(shí),AMS活性和MDA濃度的變化與取食行為的反應(yīng)時(shí)間和攝食量顯著相關(guān),Gadd45α、Idh3b、Sod、Cpt1和Pyy基因表達(dá)與取食行為參數(shù)同時(shí)密切相關(guān)。該結(jié)果可作為揭示大海馬在體內(nèi)和體外對(duì)鹽度脅迫的響應(yīng)及其相互關(guān)系的幾種重要的潛在組合生物標(biāo)志物,可用于反映鹽度對(duì)大海馬幼體生長(zhǎng)的影響。而外部行為變化可以正確反映鹽度過(guò)度波動(dòng)對(duì)大海馬幼體的危害。