于俊琦 陶 鵬 張皓迪 李 虹 李洪琴 羅 浩 劉天驥劉 匆 鄭 軻 羅 莉

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室,水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點實驗室,重慶 400715;2.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站,重慶市生態(tài)漁產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系,重慶 400400;3.四川新希望六和科技創(chuàng)新有限公司,成都 610000;4.江西天之佳生物科技有限公司,南昌 331700)

鱖(Siniperca chuatsi)俗稱“桂花魚”,隸屬于鱸形目,是我國特有的名優(yōu)魚類,因其肉質(zhì)鮮美被大眾所喜愛。據(jù)2022年漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示,鱖養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)達到37.4萬噸[1],是近幾年來在我國發(fā)展迅速的名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一。在鱖傳統(tǒng)養(yǎng)殖過程中,養(yǎng)殖戶在冬季通常一次性放入活餌料魚,保證鱖安全越冬,但因鱖存塘量估算缺乏精準性,則可能存在餌料不足處于饑餓狀態(tài)。為響應(yīng)水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖五大行動之一的配合飼料替代冰鮮雜魚,本研究團隊在重慶各地區(qū)對于飼料鱖健康養(yǎng)殖進行示范推廣,并實現(xiàn)了冬季低水溫飼料鱖健康養(yǎng)殖新模式[2]。在冬季飼料鱖養(yǎng)殖過程中如果面臨短期饑餓,則會導(dǎo)致魚體消瘦、易患病[3,4],對養(yǎng)殖生產(chǎn)造成隱形損失。所以本課題組對鱖在低水溫(13±1)℃下短期(15d)饑餓和攝食的生理狀態(tài)進行比較,攝食相較于饑餓增重量差值達到15.93%,表明低水溫下鱖攝食可以維持體重的增長,饑餓則會使鱖體重和消化、免疫、抗氧化能力降低[3]。

為進一步探究在低水溫下,15d饑餓脅迫對鱖生理指標造成負面影響的動態(tài)變化過程,本研究依據(jù)鱖主產(chǎn)區(qū)之一的廣東省冬季的低溫期水溫(10—16)℃,在(13±1)℃水溫條件下,進行15d的饑餓實驗,以采樣時間分組D0、D3、D6、D9、D12和D15。研究低水溫下短期饑餓對鱖形體指標、肌肉組成、血液生理生化指標、消化能力、肝臟和鰓抗氧化能力、肝臟脂質(zhì)代謝水平等指標的動態(tài)生理變化,旨在探究鱖在低水溫下短期饑餓的生理狀態(tài)變化,豐富鱖生理學(xué)研究內(nèi)容,為其在越冬期科學(xué)合理采用配合飼料的飼養(yǎng)管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗前期馴化飼料

根據(jù)鱖的營養(yǎng)需求,前期馴化飼料配方及主要營養(yǎng)成分如表1所示。

表1 試驗前期馴化飼料配方及主要營養(yǎng)成分Tab.1 Formula and main nutrients of acclimated feed in the early stage of the experiment

表2 低水溫下短期饑餓對鱖肌肉組成的影響(鮮樣基礎(chǔ))Tab.2 The effect of short-term starvation on the muscle composition of mandarin fish under low water temperature (fresh matter basis)

表3 低水溫下短期饑餓對鱖血液生化指標的影響Tab.3 The effect of short-term starvation on blood biochemical indexes of mandarin fish at low water temperature

表4 低水溫下短期饑餓對鱖肝臟和鰓抗氧化能力的影響Tab.4 The effects of short-term starvation at low water temperature on the antioxidant capacity of mandarin fish liver and gills

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理

試驗所需鱖購于重慶市潼南區(qū)興水漁場,共1000尾,運回實驗室先靜養(yǎng)2d,再用1.0%的NaCl溶液浸泡消毒15min,饑餓2d后放置于3個5 m3的養(yǎng)殖缸內(nèi)馴養(yǎng)30d,期間投喂自配鱖專用配合飼料(配方見1.1),馴化15d達到90%的鱖轉(zhuǎn)食配合飼料后,每天投喂2次(上午9: 00,下午17: 00)進行15d飽食投喂。取轉(zhuǎn)食飼料后的健康鱖270尾用于試驗,均重(84.13±0.14) g。實驗設(shè)計D0、D3、D6、D9、D12和D15共6個組,分別饑餓0、3d、6d、9d、12d和15d,每組3個重復(fù),每個重復(fù)15尾,共計270尾,飼養(yǎng)于西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院國家示范中心循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的18個圓形養(yǎng)殖缸(0.5 m3)中,正式試驗時間為15d,在饑餓試驗開始后,每天吸污1次,以確保水質(zhì)清潔,光周期為自然周期,水溫(13±1)℃,溶解氧≥6.0 mg/L,氨氮含量≤0.50 mg/L,亞硝酸鹽含量≤0.03 mg/L,pH 6.5—7.5。

1.3 樣品采集

分別在鱖饑餓的0、3d、6d、9d、12d和15d,每組每個重復(fù)隨機選取5尾鱖用50 mg/L的MS-222麻醉,稱重后用1 mL一次性無菌注射器在尾靜脈處取血,用羅氏活力型血糖儀測定血糖后,其余血液轉(zhuǎn)移至離心管中4500 r/min離心10min制備血漿放入液氮罐速凍后,轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存,用于血漿生化指標測定。取血后將鱖冰上解剖,取鰓、內(nèi)臟團和背部肌肉,將肝臟、胃、脾臟和腸道分離并稱重,液氮速凍放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。指標測定前,取組織按1∶9 (g/mL)或1∶4 (g/mL)加入生理鹽水,迅速轉(zhuǎn)入高速分散器勻漿(勻漿過程在冰水浴中進行),后將勻漿液離心(4℃,4000 r/min,10min),取上清液制得粗酶液,分裝存于-80℃冰箱待用。

1.4 指標測定

形體指標: 饑餓實驗結(jié)束后,準確稱量各組鱖體質(zhì)量、內(nèi)臟重及肝重,計算公式如下:

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=Wv/W×100;

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=Wl/W×100;

肥滿度(Condition factor,CF,g/cm3)=W/BL3×100;式中,W為每組魚體質(zhì)量(g);Wv為內(nèi)臟重(g);Wl為肝臟重(g);BL為魚體長(cm)。

肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分: 水分含量測定采用105℃烘箱干燥法(GB/T 6435-2006)、粗蛋白測定采用凱氏半微量蒸餾定氮法(GB/T 6432-1994)、粗脂肪測定采用索氏抽提法(GB/T 6433-1994)、粗灰分采用550℃灼燒法(GB/T 6438-1992)。

血液生化指標均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。其中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)采用賴式法(貨號: C009-1),谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用比色法(貨號: C010-1),堿性磷酸酶(AKP)采用比色法(貨號: A059-1),甘油三酯(TG)采用GPO-PAP法(貨號:A110-2),膽固醇(TC)采用COD-PAP法(貨號: A111-2),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用直接法(貨號分別為A112-2、

A113-2)。

消化指標均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定,其中胃蛋白酶采用比色法(貨號:A080-1);胰蛋白酶采用紫外比色法(貨號: A080-2);脂肪酶采用比色法(貨號: A054-1);淀粉酶采用淀粉-碘比色法(貨號: C016-1)。

抗氧化指標均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,其中總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法(貨號: A015-1);總超氧化物歧化酶(T-SOD)采用羥胺法(貨號: A001-1);丙二醛(MDA)采用TBA法(貨號: A003-1)。

脂質(zhì)代謝指標均采用上海優(yōu)選生物科技有限公司Elisa試劑盒進行測定。肝臟肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)采用酶聯(lián)免疫吸附法(貨號分別為YX-22445F、YX-22438F)。

H+-K+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶均采用南京建成生物工程研究所試劑盒(定磷法)進行測定(貨號分別為A069-1和A016-2)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗和單因子方差分析(One-way ANOVA,LSD),用Tukey多重比較分析組間差異顯著性程度,顯著水平為(P＜0.05)。數(shù)據(jù)用平均值±標準差(mean±SD)形式表示。

2 結(jié)果

2.1 低水溫下短期饑餓對鱖形體指標的影響

低水溫下短期饑餓能顯著影響鱖的形體指標(P＜0.05),由圖 1可知隨著饑餓時間的延長,BW、CF、VSI和HSI都呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(P＜0.05),但下降程度不一。其中BW在饑餓3d、9d和12d時出現(xiàn)顯著性下降,CF在饑餓9d時出現(xiàn)顯著性下降,HSI和VSI都在饑餓6d時顯著性下降(P＜0.05)。

2.2 低水溫下短期饑餓對鱖肌肉組成的影響

由表 1可知,在低溫和短期饑餓的脅迫下,鱖肌肉組成有顯著性差異(P＜0.05),肌肉粗脂肪含量則在饑餓3d時顯著下降(P＜0.05),比初始下降44.22%,而3—15d保持穩(wěn)定,無顯著變化(P＞0.05)。肌肉蛋白質(zhì)含量分別在饑餓6d、9d、12d和15d 時下降4.00%、4.10%、4.63%和6.71% (P＜0.05)。肌肉粗灰分含量在饑餓15d內(nèi)相對穩(wěn)定(P＞0.05)。

2.3 低水溫下短期饑餓對鱖血液生化指標的影響

由表 2可知,低水溫短期饑餓15d內(nèi),鱖血漿ALT、AST活性隨饑餓時間的延長呈先下降后上升的趨勢,而AKP活性、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量呈整體下降趨勢。其中血漿ALT、AST活性都在饑餓3d時降到最小值,AKP活性和TG含量逐漸下降,TC、LDL-C含量分別在饑餓9d、12d時降到最小值,HDL-C含量在饑餓6d時顯著下降(P＜0.05),之后保持穩(wěn)定,直到15d時再次降低。GLU在饑餓6d時顯著上升(P＜0.05),然后維持在一定的水平范圍。

2.4 低水溫下短期饑餓對鱖消化能力的影響

由圖 2可知,鱖胃H+-K+-ATP酶活性隨饑餓時間的延長前3d上升,但與初始無顯著差異(P＞0.05),3d后呈持續(xù)下降的趨勢,15d時顯著性下降到最小值(P＜0.05);胃蛋白酶活性在3d、6d時出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05),并在15d時顯著性下降到最小值(P＜0.05),兩者分別比初始下降88%和39%。在圖 3和圖 4 中,鱖腸道和幽門盲囊的胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性都隨饑餓時間的延長呈整體下降趨勢,這些消化酶的酶活性都在饑餓15d時達到最小值。其中腸道和幽門盲囊的胰蛋白酶活性都在饑餓前3d無顯著性差異(P＞0.05),腸道和幽門盲囊的淀粉酶活性分別在饑餓前9d、6d無顯著差異(P＞0.05),腸道和幽門盲囊脂肪酶活性在饑餓6—12d無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 低水溫下短期饑餓對鱖胃H+-K+-ATPase(a)和胃蛋白酶(b)的影響Fig.2 The effects of short-term starvation on H+-K+-ATPase (a)and pepsin (b) in mandarin fish at low water temperature

圖3 低水溫下短期饑餓對鱖腸道胰蛋白酶(a)脂肪酶(b)和淀粉酶(c)的影響Fig.3 The effects of short-term starvation at low water temperature on intestinal trypsin (a) lipase (b) and amylase (c) of mandarin fish

圖4 低水溫下短期饑餓對鱖幽門盲囊胰蛋白酶(a)、脂肪酶(b)和淀粉酶(c)的影響Fig.4 The effects of short-term starvation on trypsin (a),lipase(b) and amylase (c) in the pyloric blind sac of Mandarinfish at low water temperature

2.5 低水溫下短期饑餓對鱖肝臟和鰓抗氧化能力的影響

由表 3可知,在低水溫下,短期饑餓對鱖肝臟和鰓抗氧化能力及鰓Na+-K+-ATP酶活性有顯著影響(P＜0.05),隨饑餓時間的延長,鱖肝臟T-AOC含量、T-SOD活性出現(xiàn)先上升后下降趨勢,分別在饑餓6d和3d時達到最大值,兩者都在饑餓15d時達到最小值。肝臟MDA含量、鰓T-AOC含量和T-SOD活性都在饑餓前期無顯著性變化(P＞0.05),并維持在一定的水平范圍,饑餓后期肝臟MDA含量顯著性升高(P＜0.05),到15d時達到最大值,比初始0d上升44.30%,而鱖鰓T-AOC含量和T-SOD活性則顯著性下降(P＜0.05),到15d時下降到最小值。此外,鰓MDA含量在饑餓期間逐漸上升,到15d時顯著性上升到最大值(P＜0.05),而Na+-K+-ATP酶活性則在饑餓3d時顯著性下降(P＜0.05),之后到饑餓前12d都無顯著性差異(P＞0.05),直到饑餓15d時,Na+-K+-ATP酶活性顯著性下降到最小值(P＜0.05)。

2.6 低水溫下短期饑餓對鱖肝臟脂質(zhì)代謝的影響

由表 4可知,在低溫條件下,15d短期饑餓對鱖肝臟脂質(zhì)代謝有顯著性影響(P＜0.05)。隨著饑餓時間的延長,鱖肝臟肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶呈整體下降趨勢,在饑餓3d時顯著性下降(P＜0.05),在15d時顯著性降低到最小值(P＜0.05)。乙酰輔酶A羧化酶活性呈整體上升趨勢,在饑餓6d時顯著性上升(P＜0.05),在15d時顯著性上升到最大值(P＜0.05;表 5)。

3 討論

3.1 低水溫下短期饑餓對鱖形體指標及肌肉組成的影響

魚類在饑餓條件下,由于沒有外源能量的補充,只能不斷消化自身含有的營養(yǎng)物質(zhì)來維持生命活動所需的能量代謝,從而造成魚體外部形態(tài)特征和內(nèi)部解剖性狀產(chǎn)生某些特定變化,如魚體質(zhì)量出現(xiàn)負增長、腸管變細、肝胰臟縮小等[5],魚體通過改變自身的形體指標來適應(yīng)這種環(huán)境的變化,以保證形體結(jié)構(gòu)和機能相協(xié)調(diào)[6]。在本實驗中,當饑餓15d時,鱖體質(zhì)量較初始時顯著下降,這與羅非魚(Oreochromis niloticus)[6]、彭澤鯽(Carassius auratusvar Pengze)[7]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[8]上的研究結(jié)果類似。內(nèi)臟和肝臟都是魚類存儲營養(yǎng)物質(zhì)的部位,在饑餓脅迫時,動用肝臟和內(nèi)臟中的脂肪、蛋白和糖原,導(dǎo)致相應(yīng)形態(tài)指標的下降。鐘金香等[9]在斑點叉尾鮰(Ietalurus punetaus)和鹿王成志等[10]在俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedti)上的研究表明,隨著饑餓程度的加深,水產(chǎn)動物的肥滿度、肝體比和臟體比會顯著下降,本實驗得到相近的實驗結(jié)果,鱖的臟體比在饑餓6d時顯著下降,而肝體比在饑餓9d時才顯著下降,推測可能是鱖饑餓過程中先動用非肝臟的其他內(nèi)臟,如腸系膜脂等儲備的能量,當消耗到一定程度后,才開始動用肝臟的能量儲備。

魚類體內(nèi)的三種主要營養(yǎng)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物),在饑餓或食物不足時,魚體代謝內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)以維持生命活動[11]。一般魚類的主要貯能物質(zhì)為脂肪和糖原,只有當長期饑餓狀態(tài)下才會將蛋白質(zhì)作為能量代謝[12]。在本實驗中,肌肉的水分隨饑餓天數(shù)的增加顯著性上升,而肌肉粗脂肪和粗蛋白則隨饑餓時間延長顯著下降,在瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[13]上有相同的結(jié)果,本研究中鱖肌肉粗蛋白隨饑餓時間延長逐漸下降,而肌肉粗脂肪在饑餓3d時即下降44.22%,說明在饑餓過程中,脂肪首先被鱖動用來維持基本生命活動,當脂肪含量過低時就開始消耗肌肉蛋白供能。

3.2 低水溫下短期饑餓對鱖血液生化指標的影響

本實驗中鱖血糖含量升高之后保持著高水平血糖,與草魚(Ctenopharyngodon idellus)在饑餓狀態(tài)下血糖降低后維持在較低水平不同[14],其中血糖的上升幅度和甘油三酯下降幅度幾乎一致,推測原因是鱖血液的糖脂代謝轉(zhuǎn)換,血液中甘油三酯轉(zhuǎn)換成血糖。血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化可以反映魚體內(nèi)肝細胞損傷的程度,肝細胞損傷后,細胞膜的通透性增加,這兩種酶能從肝細胞進入血液,導(dǎo)致這兩種酶在血液中的活性增加[15]。本實驗中的谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶隨饑餓時間延長先下降后上升,說明短時間的饑餓能改善鱖肝功能,但饑餓時間過長,會加劇肝損傷,同時堿性磷酸酶活性也會不斷下降,免疫力減弱。

魚體饑餓期間脂肪大量分解供能,主要通過提高脂肪分解酶活性、加速脂肪在體內(nèi)的氧化和釋放脂肪酸三種途徑來實現(xiàn)[14]。在本實驗中,血漿中甘油三酯、總膽固醇和高、低密度脂蛋白膽固醇含量在饑餓前3d上升,之后開始明顯下降,說明鱖在面臨饑餓脅迫時,前3d并不會分解血液中的酯類,主要是消耗肌肉中的粗脂肪,3d后鱖開始分解血液中的總膽固醇和甘油三酯,而高、低密度脂蛋白膽固醇作為總膽固醇和甘油三酯的在機體內(nèi)的運載工具,也隨它們含量的改變發(fā)生相應(yīng)的改變。此外,可以發(fā)現(xiàn),較甘油三酯含量的下降幅度,總膽固醇含量下降并不多。這是因為血漿中甘油三酯含量主要依賴于外源性甘油三酯的吸收,但動物體的幾乎所有組織都能合成總膽固醇,饑餓或禁食使肝臟中膽固醇合成大幅度下降,但肝外組織中的合成量減少不多[16]。

3.3 低水溫下短期饑餓對鱖胃腸消化能力的影響

鱖胃由黏膜層、黏膜下層、固有層和肌層組成,其中在黏膜層基部中的胃腺細胞,能夠同時分泌胃蛋白酶原和胃酸,屬于泌酸胃酶細胞。胃蛋白酶原是胃蛋白酶的無活性前體物質(zhì),需要在胃酸的作用下激活為有活性的胃蛋白酶。胃H+-K+-ATP酶,也稱胃質(zhì)子泵,是胃蛋白酶原激活過程中分泌胃酸的關(guān)鍵性酶[17]。胃蛋白酶和胃H+-K+-ATP酶對于魚體的胃部消化起著重要的作用。在本實驗中,鱖隨著饑餓時間的延長,胃蛋白酶和胃H+-K+-ATP酶分別比初始時下降39%和88%,饑餓使胃的泌酸和泌酶的能力降低,其中胃H+-K+-ATP酶相較于胃蛋白酶下降幅度較大,推測可能是由于饑餓的反饋性抑制,從而也對胃黏膜起到一定的保護作用。

魚類在遭遇饑餓脅迫過程中,通過調(diào)節(jié)魚體各種酶的活性來提高機體儲能物質(zhì)的利用效率,根據(jù)魚體各種酶的活力變化可分析魚體自身代謝情況和營養(yǎng)狀況,但饑餓對魚體消化酶活性的影響會隨魚的種類、饑餓程度、規(guī)格大小不同而存在一定的差異[18]。在本實驗中,隨著饑餓時間的延長,鱖腸和幽門盲囊消化器官的各類消化酶活性均呈不同程度的下降,其中胰蛋白酶和脂肪酶比淀粉酶下降迅速,可能是鱖作為肉食性魚類主要利用動物蛋白,對碳水化合物利用能力較差。此外,幽門盲囊的脂肪酶、消化酶和淀粉酶活性等條件下均高于腸道,說明幽門盲囊也是鱖非常重要的消化器官,其地位不亞于腸道。

3.4 低水溫下短期饑餓對鱖抗氧化能力的影響

外界環(huán)境的變化,例如饑餓會引起水產(chǎn)動物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)生變化,從而產(chǎn)生大量的自由基,這些自由基能夠加速老化,加大局部缺血性損傷,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]。而SOD和T-AOC是動物體酶類抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,能夠清除體內(nèi)多余自由基,保護自身免受氧化損傷。在生物體內(nèi),脂質(zhì)和自由基發(fā)生過氧化反應(yīng),其最終產(chǎn)物便是丙二醛,具有很強的毒性[20]。在本實驗中,鱖SOD活性在饑餓3d時達到最大值,然后逐漸下降,T-AOC在饑餓6d時達到最大值,然后逐漸下降,而MDA含量在饑餓6d時下降到最小值,然后逐漸上升。本課題組在大口黑鱸(Micropterus salmoides)的饑餓實驗當中發(fā)現(xiàn)了相似的趨勢,而董學(xué)興等[21]在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)中發(fā)現(xiàn)饑餓8d后SOD活性顯著下降,可見饑餓對不同條件,不同魚種的魚類的肝臟抗氧化能力影響不同。另外,在本實驗中,鱖鰓的抗氧化酶隨饑餓時間延長有一定下降,但總體上看,下降不明顯,說明饑餓對鱖鰓抗氧化能力影響較弱。此外,Na+-K+-ATP 酶是鰓組織泌氯細胞及細胞器的膜上存在的一種蛋白酶,在魚體滲透調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用[22]。在本實驗中,鱖鰓Na+-K+-ATP酶隨饑餓時間延長有下降趨勢,這與在虹鱒[23]上的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

在本實驗條件下,鱖15d的短期饑餓會出現(xiàn)體質(zhì)量下降、體型變瘦和肝臟相對變小現(xiàn)象;饑餓過程中前3d優(yōu)先利用肌肉脂肪供能,后期優(yōu)先利用肌肉蛋白質(zhì)供能;適宜饑餓時間(6d)能改善鱖抗氧化能力,但饑餓時間過長時,會嚴重影響鱖的消化和抗氧化能力。