蔡偉杰 張存芳 李柯懋 郝佳慧 覃敏欣 關(guān)弘弢 高 強(qiáng)劉 丹 聶苗苗 賈軍梅 祁得林

(1.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,西寧 810016;2.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,西寧 810016;3.青海省漁業(yè)技術(shù)推廣中心(青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測中心),西寧 810012)

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)作為青海湖特有的土著四倍體硬骨魚類[1],也是青海湖唯一的商業(yè)魚類,屬于國家二級保護(hù)動物,于2004年被列入《中國瀕危動物紅皮書》和《中國生物多樣性保護(hù)行動計劃》。作為青海湖特有的洄游魚類,成年魚每年春末和夏季會遷徙到連通河流的淡水環(huán)境中進(jìn)行產(chǎn)卵,并在初秋和冬季又返回到青海湖[2]。青海湖裸鯉作為青海湖鳥島及其鄰近淡水河候鳥的主要食物來源,每年大約有3000噸被鳥類捕食[3],說明它在維持青海湖生物多樣性以及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性中處于極其重要的地位。但由于其生活在高鹽、強(qiáng)紫外、低溫和食物極度匱乏的極端環(huán)境中,其生長緩慢、性成熟晚和生命周期長等特點[4],也是其資源保護(hù)的制約因素。在20世紀(jì)50年代到90年代,一度由于過度捕撈和水質(zhì)污染[5]等人類活動導(dǎo)致野生青海湖裸鯉數(shù)量急劇下降,種質(zhì)資源嚴(yán)重衰退,青海省人民政府于1994年正式禁止商業(yè)捕撈[6]。除此之外,湖泊鹽度升高和水位下降等自然原因給青海湖裸鯉的生存也帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[7,8]。青海湖裸鯉直至今天依然是當(dāng)?shù)刂饕臐O業(yè)保護(hù)和發(fā)展資源,為了保護(hù)和挖掘特色資源,許多學(xué)者從生理、生化、分子遺傳基礎(chǔ)等方面進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其生長速度緩慢、繁殖能力低,具有耐低溫、耐鹽堿、耐低氧和耐貧養(yǎng)等特性[7,9],是研究物種進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)的理想模式生物[10,11]。

魚類腸道由內(nèi)胚層和中胚層發(fā)育而來,前端接于食道或胃,后止于肛門處,是魚類與外界環(huán)境接觸面積最大的器官,起著免疫、消化吸收和新陳代謝[12]等眾多功能的重要器官,腸道功能的正常與否直接關(guān)系著魚類整體的健康。在組織學(xué)上,大多數(shù)魚類腸道的組織結(jié)構(gòu)比較相似,許多魚類的腸道壁組織由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層構(gòu)成[13],且根據(jù)已有的研究結(jié)果,魚類的食性[14]和年齡[15]等都是影響腸道組織結(jié)構(gòu)的重要因素。除了對腸道的基本組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究外,不同魚類消化道黏液組織化學(xué)的研究也是相關(guān)的熱點[16,17],魚類消化道中的黏液細(xì)胞包括杯狀細(xì)胞、胃腸道上皮細(xì)胞和腺體中的一些細(xì)胞[18],魚的種類不同消化道黏膜細(xì)胞分泌的黏液蛋白分布也不相同[19],從而發(fā)揮的功能也不相同。另外,前、中和后腸的腸絨毛形態(tài)、柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等的分布及數(shù)量主要在黏膜層上體現(xiàn)出結(jié)構(gòu)差異性[20]。

魚類的腸道結(jié)構(gòu)特點主要與食性相關(guān)從而直接影響魚類的生長發(fā)育,如肉食性魚類擁有更大的腸道直徑和更發(fā)達(dá)的腸道結(jié)構(gòu)能容納和吸收更多食物[21];雜食性魚類前腸容量不大,但黏膜皺褶高且密,極大地增加了前腸的消化功能[22];草食性魚類腸絨毛發(fā)達(dá),對水生植物中含量低的營養(yǎng)物質(zhì)有極強(qiáng)的吸收作用[23]。隨著第二代測序技術(shù)的飛速發(fā)展,DNA宏條形碼(Metabarcoding)技術(shù)以成本低、通量大和能快速鑒定大量物種等優(yōu)勢,被廣泛應(yīng)用于浮游植物群落的監(jiān)測[24]、浮游動物的鑒定[25]和食性分析[26]等生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的眾多方面,在魚類食性鑒定[27]方面也逐漸成為了有利的工具。

無胃魚的消化道一直是一些超微結(jié)構(gòu)研究的熱點,青海湖裸鯉作為典型的無胃魚,有關(guān)其腸道結(jié)構(gòu)的研究報道較早,史建全等[28]從形態(tài)學(xué)到組織結(jié)構(gòu)的異同等方面對青海湖裸鯉腸道組織學(xué)進(jìn)行分析,并討論了其腸道組織學(xué)和食性之間的相關(guān)關(guān)系;陳付菊等[15,29]的研究中表示青海湖裸鯉的前腸是消化和吸收的主要功能部位,并對不同發(fā)育時期青海湖裸鯉腸道的杯狀細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞做了比較分析。但經(jīng)過幾十年的封湖禁漁,對青海湖裸鯉的保護(hù)取得了明顯的成效,其數(shù)量得到了有效提升,保護(hù)級別由瀕危降為易危,隨著魚類數(shù)量的提升魚類的生長發(fā)育又有了新的變化。因此,盡管對于青海湖裸鯉腸道結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)相對清楚,但相關(guān)的報道都比較早,缺乏較新的研究結(jié)果與之進(jìn)行比較分析,在此基礎(chǔ)上,本研究通過掃描電鏡、HE染色和DNA宏條形碼等技術(shù)手段來分析青海湖裸鯉腸道結(jié)構(gòu)及食性的特點,進(jìn)一步揭示青海湖裸鯉腸道自身生理結(jié)構(gòu)的差異性和特殊性,為青海湖裸鯉的研究和保護(hù)工作提供基礎(chǔ)的科學(xué)依據(jù),同時也為青海湖裸鯉的人工增殖工作提供參考和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚采自青海省海南藏族自治州共和縣西北部的青海湖附屬河流—黑馬河(E99°46＇53″,N36°43＇20″),pH為8.0—8.2,海拔為3110.8 m,采樣時間為7月上旬,在河道中隨機(jī)捕撈20尾青海湖裸鯉,裝入供氧容器,保持存活帶回臨時采樣點進(jìn)行取樣,將活魚麻醉后,進(jìn)行常規(guī)的生物學(xué)測量,然后使用無菌的剪刀和鑷子進(jìn)行解剖,快速將腸道從其體腔中分離出來并測量長度,再選取體長體重相近的8尾魚,收集腸道內(nèi)容物于2 mL凍存管中置于液氮中用于測定食性,最后取其中3尾魚的腸道樣品用于掃描電鏡和HE染色切片的制備。

1.2 腸道掃描電鏡樣品的制備

分別取新鮮的前、中和后腸1 cm×1 cm大小的腸道組織1—2塊(前腸在第1個彎曲前取材,中腸在第1個彎曲到最后一個彎曲之間取材,后腸在最后一個彎曲到肛門之間取材),用PBS磷酸緩沖液沖洗3次,迅速固定于4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中保存24h,再依次用濃度為30%、50%、70%、80%、95%和100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水,叔丁醇置換酒精后再次脫水,放入-80℃冰箱中冷凍4h,再置于冷凍干燥儀中干燥6—8h。在干燥完畢之后進(jìn)行鍍金,最后在掃描電鏡下(FESEM)觀察并攝片。

1.3 腸道HE染色樣品的制備

制備方法如下: (1)70℃下烤片5min,置于二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中各脫蠟10min,再用100%乙醇(Ⅰ)、100%乙醇(Ⅱ)各5min洗去二甲苯;(2)經(jīng)過在不同濃度梯度(95%、85%和75%)的乙醇中水化后,置于蒸餾水中待用;(3)蘇木素染色10min,流水沖洗2min,1%鹽酸酒精分化2s,用流水沖洗切片15min,蒸餾水過洗1—2s,伊紅染色10min;(4)根據(jù)顏色深淺用80%的乙醇分化,用乙醇(85%和95%)脫水5min,再用無水乙醇脫水(10min,兩次);(5)二甲苯(Ⅰ)透明10min,二甲苯(Ⅱ)再次透明10min;(6)在石蠟切片中央滴加1滴中性樹膠,蓋上蓋玻片封固,顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 腸道內(nèi)容物的DNA提取和PCR擴(kuò)增

按照DNeasy?PowerSoil?Pro Kit Handbook DNA提取試劑盒的步驟對青海湖裸鯉腸道內(nèi)容物的總DNA進(jìn)行提取,選擇ITS、18S rDNA、cox-1、18SV9、rbcL、ITS和COI等7個基因片段進(jìn)行食性分析(表1),引物篩選只有18S rDNA和rbcL引物擴(kuò)增得到了比較好的產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增體系為: 5×TransStart Fast-Pfu緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL,模板DNA10 ng,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序為: 95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,設(shè)定27個循環(huán);72℃延伸10min后4℃保存。

表1 標(biāo)記基因及引物序列Tab.1 Marker gene and primer sequence

1.5 Illumina Miseq測序及生信分析

2%瓊脂糖凝膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)試劑盒進(jìn)行回收產(chǎn)物純化,并用Quantus Fluorometer(Promega,USA)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用TruSeqIM DNA Sample Prep Kit進(jìn)行建庫,并在Illumina的Miseq PE300平臺上進(jìn)行測序。所得測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接、質(zhì)量控制和過濾,在Uparse7.0(http://drive5.com/uparse/)軟件上進(jìn)行OTU聚類分析,采用RDP Classifier(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行基于Silva(http://www.arb-silva.de)、Unite(http://unite.ut.ee/index.php)數(shù)據(jù)庫的分類學(xué)分析,并分別在Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)和Species(種)六個分類學(xué)水平下統(tǒng)計各樣本的群落物種組成。以上分析過程在美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com)上完成。

2 結(jié)果

2.1 體重、體長和腸長之間的變化關(guān)系

對20尾繁殖期性成熟的青海湖裸鯉的體重、體長及腸長進(jìn)行了測量,并按照體長大小對測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析(表2),結(jié)果顯示各相鄰體長階段之間裸鯉的平均體重、頭長和體高差異均不顯著(P＞0.05),而在體長差異相對較大的兩個不相鄰階段之間均體現(xiàn)出了顯著差異性(P＜0.05),且體長為20—21 cm的裸鯉與18—19 cm的裸鯉相比其腸長差異較顯著(P＜0.05)。根據(jù)青海湖裸鯉體重、體長和腸長的實測數(shù)據(jù),用冪函數(shù)模型,擬合出體重-腸長的關(guān)系(WGR)、體長-腸長(BGR)的關(guān)系分別為:

表3 青海湖裸鯉腸道皺褶高度、寬度和肌層厚度Tab.3 Fold height,fold width and Muscularis thickness in G.przewalskii (μm)

表4 基于18S rDNA和rbcL宏條形碼分析的青海湖裸鯉主要食物組成Tab.4 Main food composition of G.przewalskii based on 18S rDNA and rbcL macro barcode analysis

上述兩個方程存在顯著差異,但均體現(xiàn)出了體重與體長、腸長之間的擬合關(guān)系,且根據(jù)所測20組數(shù)據(jù)計算均值可以粗略得出,體重在32—68 g、體長在18—22 cm內(nèi)的青海湖裸鯉其體重和腸長是1.4倍的變化關(guān)系,而腸長約為體長的1.7倍。

2.2 腸道掃描電鏡結(jié)果分析

對不同放大倍數(shù)下青海湖裸鯉各腸段掃描電鏡的結(jié)果進(jìn)行分析,總體來說,前腸黏膜皺褶(腸絨毛)明顯且發(fā)達(dá),數(shù)量最多,褶層很深寬度較窄呈波浪狀排列,大皺褶中又包含了許多小皺褶,增加了皺褶的總長度和表面積,褶與褶之間相互交聯(lián)形成較無序的網(wǎng)狀排布(圖1a),前腸黏膜層由數(shù)量眾多的單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成,且黏膜層表面可見大量的分泌孔、分泌顆粒及杯狀細(xì)胞散布其間(圖1b和1c)。中腸和后腸黏膜表層仍由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成,但相比于前腸,中腸和后腸的腸道黏膜皺褶深度逐漸變淺,寬度逐漸增加,皺褶分支的數(shù)量相對減少,但皺褶之間排列相對較整齊,呈較規(guī)律的“V”“M”等字型排列(圖1d和1g)。中腸和后腸黏膜表面的杯狀細(xì)胞的數(shù)量較前腸相對減少,分泌孔及周圍黏附分泌物顆粒的數(shù)量也逐漸減少,其中后腸的數(shù)量最少(圖1b、1e和1h),但后腸黏膜表面的微絨毛的密度和數(shù)量較多,高度相近且排列整齊,尤其是腸黏膜上的呈六邊形分布的短簇狀微絨毛,細(xì)胞之間的界限也很清晰(圖1h和1i),這些腸道黏膜皺褶和微絨毛都極大地增加了腸道的內(nèi)表面積,能促進(jìn)對食物的消化和吸收。

圖1 青海湖裸鯉腸道掃描電鏡結(jié)果Fig.1 Results of intestinal SEM of G.przewalskii

2.3 腸道HE染色結(jié)果分析

腸道組織經(jīng)HE染色處理后在光鏡下進(jìn)行觀察,可見前腸腸絨毛頂部呈尖圓狀,排列最為緊密(圖2a),中腸腸絨毛紋狀緣清晰,絨毛之間的排列逐漸稀疏(圖2b),后腸腸絨毛頂部呈鈍圓狀,紋狀緣較模糊,數(shù)量最少排列較整齊(圖2c),從前腸到中腸再到后腸皺褶高度顯著減小(P＜0.05),皺褶寬度顯著增加(P＜0.05),后腸肌層厚度最小與中腸差異不顯著(P＞0.05),前腸肌層厚度最大與中腸和后腸相比差異均顯著(P＜0.05;表 3),且從前腸到后腸腸腔逐漸變小,腸道直徑也逐漸變小;青海湖裸鯉的腸道組織經(jīng)HE染色處理后,質(zhì)核區(qū)分顯著(圖2d),腸道組織邊緣清晰且結(jié)構(gòu)完整,腸壁組織結(jié)構(gòu)層次分明,從內(nèi)向外依次由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層四層組成,但因其缺乏黏膜層中的黏膜肌致使固有膜與黏膜下層間的區(qū)分不明顯,故光鏡下只有三層膜結(jié)構(gòu)清晰可見(圖2e),前腸黏膜上皮密布柱狀上皮細(xì)胞,并有許多杯狀細(xì)胞散布其間,而中腸至后腸黏膜層向腸腔內(nèi)褶形成的皺褶高度較前腸逐漸減小,且柱狀細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少(圖2f),故前、中和后腸的黏膜層結(jié)構(gòu)差異較為明顯(P＜0.05),而這三個腸段的黏膜下層、肌層和漿膜層結(jié)構(gòu)基本相似,并無明顯的結(jié)構(gòu)差異。

圖2 青海湖裸鯉腸道HE染色結(jié)果Fig.2 HE intestinal staining results of G.przewalskii

2.4 DNA宏條形碼食性結(jié)果分析

對青海湖裸鯉8份腸道內(nèi)容物樣本進(jìn)行18S rDNA和rbcL序列高通量測序,共獲得443024條有效序列,有效序列平均長度為261 bp,剔除青海湖裸鯉自身序列、細(xì)菌、古菌及真菌的序列后,按照97%相似水平對所有序列進(jìn)行OTU劃分及物種注釋,共得到39031個OTU,分為43個門、114個綱、282個目、435個科、599個屬、817個種。圖 3分別為門、綱、目、科、屬、種水平相對豐度前十的物種,其他物種則合并為Others項,在門水平上主要以鏈型植物門(Streptophyta,53.73%)、硅藻門(Bacillariophyta,23.19%)、絲足蟲門(Cercozoa,6.67%)、輪蟲動物門(Rotifera,0.67%)和綠藻門(Chlorophyta,0.67%)等為主(圖3a);在綱水平上主要以真蘚綱(Bryopsida,35.79%)、硅藻綱(Bacillariophyceae,23.05%)、雙子葉植物綱(Magnoliopsida,18.03%)、金藻綱(Chrysophyceae,3.36%)和Bdelloidea(0.45%)等為主(圖3b);在目水平上主要以橋彎藻目(Cymbellales,22.60%)、灰蘚目(Hypnales,17.97%)、薔薇目(Rosales,17.97%)、叢蘚目(Pottiales,17.92%)和Glissomonadida(3.39%)等為主(圖3c);在科水平上主要以薔薇科(Rosaceae,18.03%)、叢蘚科(Pottiaceae,17.99%)、柳葉蘚科(Amblystegiaceae,17.63%)、金囊藻科(Chrysocapsaceae,2.91%)和Heteromitidae(0.57%)等為主(圖3d);在屬水平上主要以叢蘚屬(Pottia,18.03%)、中國毛莓草屬(Sibbaldianthe,17.86%)、擬細(xì)濕蘚屬(Campyliadelphus,17.68%)、Chrysochaete(2.93%)和Heteromita(0.57%)等為主;在種水平上主要以Cymbellalessp.TF-2014(22.61%)、Pottia intermedia(18.02%)、Sibbaldianthe sericea(17.85%)、Campyliadelphus chrysophyllus(17.67%)和Chrysochaete britannica(2.93%)等為主。

圖3 豐度前十的各水平生物分類單元Fig.3 Taxa of the top ten levels of abundance

為進(jìn)一步探討豐度占比較大的各食物類群之間的從屬關(guān)系,我們對幾個優(yōu)勢門下屬的各分類水平的食物組成又做了詳細(xì)分析,DNA宏條形碼食性測序結(jié)果顯示門水平上豐度前四的食物組成,在綱、目、科和屬水平上占比較大的物種與前面所述結(jié)果一致,四個優(yōu)勢門包含著豐富的食物類群,且主要以鏈型植物門和硅藻門種類居多、占比較大(圖4),其中鏈型植物門中主要包括真蘚綱、雙子葉植物綱;真蘚綱主要包括灰蘚目和叢蘚目,雙子葉植物綱主要包括薔薇目和傘形目;灰蘚目主要包括柳葉蘚科和絹蘚科,叢蘚目包括叢蘚科,薔薇目包括薔薇科,傘形目主要包括傘形科和五加科;柳葉蘚科主要包括擬細(xì)濕蘚屬和牛角蘚屬,絹蘚科包括絹蘚屬,叢蘚科主要包括叢蘚屬和花櫛蘚屬,薔薇科主要包括中國毛莓草屬和沼委陵菜屬,傘形科包括當(dāng)歸屬,五加科包括人參屬;擬細(xì)濕蘚屬包括Campyliadelphus chrysophyllus,牛角蘚屬包括牛角蘚,絹蘚屬主要包括廣葉絹蘚和Entodon rubicundus,叢蘚屬包括Pottia intermedia,花櫛蘚屬包括Pseudocrossidium replicatum,中國毛莓草屬包括Sibbaldianthe sericea,沼委陵菜屬包括西北沼委陵菜,當(dāng)歸屬和人參屬主要是當(dāng)歸和人參。硅藻門主要包括硅藻綱和圓篩藻綱;硅藻綱主要包括橋彎藻目和硅藻目,圓篩藻綱主要包括角毛藻目和Thalassiosirales;橋彎藻目主要包括橋彎藻科和f_unclassified_o_Cymbellales,硅藻目包括桿狀藻科,角毛藻目主要包括角毛藻科,Thalassiosirales主要包括Stephanodiscaceae和Skeletonemataceae;橋彎藻科主要包括內(nèi)絲藻屬和橋彎藻屬,f_unclassified_o_Cymbellales包括g_unclassified_o_Cymbellales,桿狀藻科主要包括Denticula和Nitzschia,角毛藻科包括角刺藻屬,Stephanodiscaceae包括Discostella,Skeletonemataceae包括骨條藻屬;內(nèi)絲藻屬主要包括西里西亞內(nèi)絲藻和默利內(nèi)絲藻,橋彎藻屬包括近緣橋彎藻,g_unclassified_o_Cymbellales包括Cymbellalessp.TF-2014,Denticula包括庫津細(xì)齒藻,Nitzschia主要包括兩棲菱形藻和Nitzschia pusilla,角刺藻屬主要包括Chaetoceros peruvianus,Discostella主要包括Discostellasp.HYK0210-A2和Discostella stelligera,骨條藻屬主要包括骨條藻(圖4和表 4;其中“unclassified”為無分類信息的標(biāo)記)。

圖4 四個優(yōu)勢門所包含綱、目、科和屬水平主要組成的桑基圖Fig.4 The four dominant phyla consist of class,order,family and genus level mainly composed of Sankey chart

3 討論

3.1 青海湖裸鯉腸長與體長、體重之間的關(guān)系

青海湖裸鯉屬于鯉科裂腹魚亞科的雜食性魚類,食性范圍廣,無胃,食道之后便是腸道,從形態(tài)學(xué)方面,其腸道包裹在腹膜中盤旋復(fù)雜,腸道長度介于肉食性魚類和草食性魚類之間,吳強(qiáng)等[30]的研究也表明肉食性魚類腸道最短,草食性魚類腸道最長,雜食性魚類則介于中間。青海湖裸鯉腸道的長度除了和食性有關(guān)之外,還和其體重、體長等相關(guān),朱奕龍[31]在青海裸鯉生長特征的研究中,通過擬合體重和體長的關(guān)系,也發(fā)現(xiàn)雌雄性魚的體長與體重都接近等速生長。而本研究的統(tǒng)計結(jié)果顯示,體長相近的各生長階段之間,體重變化也較相近,且通過分別擬合體重和腸長、體長和腸長之間的相互關(guān)系,結(jié)果表明青海湖裸鯉不僅在體重和體長之間存在相應(yīng)的變化關(guān)系,腸道長度也會隨著體重的不同、體長的變化而變化,并表現(xiàn)出一定的正向倍數(shù)變化關(guān)系,而體長與腸長的變化關(guān)系會有較大的差異性,王基琳[32]在青海湖裸鯉食物的研究中也表明其體長與腸長之比變化幅度較大。

3.2 青海湖裸鯉腸道組織特點與功能之間的關(guān)系

以腸道上兩個彎曲部分的位置加以區(qū)分,可以將青海湖裸鯉的腸道劃分為前、中和后三部分腸段,前腸長度最短腸腔最大,掃描電鏡下可見腸道黏膜皺褶數(shù)量最多且凸起高度最大,腸壁內(nèi)表面積最大,黏膜表面分泌孔及分泌物顆粒數(shù)量最多,而中腸和后腸部分占比較長,腸腔逐漸變小,腸絨毛逐漸變短變粗,這與其他魚類相似,主要是因為前腸承擔(dān)著大多數(shù)的消化吸收功能,其次是中腸和后腸。房慧伶等[33]對雜食性尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)腸道組織結(jié)構(gòu)的研究表明,前腸和中腸的柱狀細(xì)胞頂端有密而長的微絨毛,后腸柱狀細(xì)胞頂端的微絨毛稀而短,并且前、中和后腸的組織結(jié)構(gòu)差異也主要表現(xiàn)在黏膜層;范瑞青等[34]在對藍(lán)非鯽(Oreochromis aureusSteindachner)腸道結(jié)構(gòu)的研究中表明前腸是消化和吸收的主要功能區(qū),中腸和后腸的微絨毛不及前腸發(fā)達(dá),主要起對碳水化合物及剩余食物的吸收、消化和運輸?shù)淖饔?何敏等[35]在重口裂腹魚[Schizothorax(Racoma)davidi]的腸道組織結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn),從前腸至后腸其腸道腸壁內(nèi)黏膜褶高度和黏膜上皮高度逐漸遞減,腸道消化吸收能力逐漸降低,再一次表明魚類消化道形態(tài)學(xué)組織結(jié)構(gòu)與生理功能之間的密切關(guān)系。

HE染色處理下青海湖裸鯉的腸道結(jié)構(gòu)組織,與其他大多數(shù)魚類相似,由內(nèi)向外依次由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層構(gòu)成,前、中和后腸腸道結(jié)構(gòu)基本相似,前腸腸壁和肌層都較中腸和后腸厚,可以提供更多的腸道蠕動力,促進(jìn)消化和剩余食團(tuán)向后繼續(xù)的運送。黏膜層的差異主要體現(xiàn)在腸絨毛的排列、數(shù)量、長短、寬窄及前腸黏膜上皮分布的更多數(shù)量的柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等方面,柱狀細(xì)胞的數(shù)量與腸道的吸收功能直接相關(guān),杯狀細(xì)胞除了能分泌消化酶促進(jìn)對食物的消化以外,還能分泌腸道內(nèi)的黏蛋白,在抵御外源細(xì)菌和腸道固有微生物侵襲、維持腸黏膜動態(tài)平衡、調(diào)控微生物-宿主免疫應(yīng)答中起重要作用[36]。這兩類細(xì)胞都極大地增加了腸道對食物的消化和吸收功能,中腸和后腸黏膜上皮分布的柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量則相對減少。除此之外,陳付菊等[15]對不同年齡青海湖裸鯉的腸道組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析,研究表明腸道中絨毛長度、黏膜厚度、肌層厚度和腸壁厚度還會隨著年齡的增長而逐漸增大。

3.3 青海湖裸鯉的食性特點及相對變化

利用DNA宏條形碼技術(shù)對青海湖裸鯉的腸道內(nèi)容物進(jìn)行檢測,依據(jù)檢測結(jié)果,按照物種序列的門、綱、目、科、屬、種及所占比例,可以初步判斷本次研究采集到的青海湖裸鯉其采食食物中種類最豐富的有鏈型植物、硅藻、絲足蟲類、輪蟲類及目前還未被分類但占比較大的一些物種等。相比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定其食性的研究方式[37],硅藻、綠藻、搖蚊幼蟲、鉤蝦、輪蟲類和介形類等均也在本次研究中被檢出,而藍(lán)藻、裸藻、枝角類和橈足類等未被檢測出。另外本研究還檢測到紅藻、金藻、黃藻、脊索動物、節(jié)肢動物、軟體動物、扁形動物、環(huán)節(jié)動物、緩步動物、變形蟲類、纖毛蟲類和眼蟲類等傳統(tǒng)鏡檢法未檢測到的類群。從檢出食物的豐度上,鏈型植物和硅藻的數(shù)量最多豐度最大,絲足蟲類和輪蟲類等也在其各分類學(xué)水平上較傳統(tǒng)鏡檢法檢出食物的類別和數(shù)量更加系統(tǒng)和全面。此外,本研究檢測到占比較大的鏈型植物(53.73%)在之前的研究中未見詳細(xì)報道,季強(qiáng)[22]在拉薩裸裂尻魚、巨須裂腹魚和拉薩裂腹魚的腸道內(nèi)含物中均發(fā)現(xiàn)了高等植物碎片及種子,我們推測鏈型植物也可能是青海湖裸鯉的主要食物類別之一。在本研究中植物性食物占比為77.59%,因此我們推測青海湖裸鯉為雜食性偏植食的魚類。而對于未檢測到的食物及食物組成占比大小的問題,對比前面所參考的研究及有關(guān)文獻(xiàn)[32],我們推測這可能與青海湖不同月份食物組成及所檢測魚的數(shù)量相關(guān),也可能是由于氣候變化及湖泊水環(huán)境質(zhì)量的變化導(dǎo)致青海湖中浮游植物、浮游動物、底棲動物種類及豐度發(fā)生了變化[38,39],從而使得青海湖裸鯉的食性也發(fā)生了變化。除此之外,結(jié)合青海湖裸鯉腸道內(nèi)容物DNA宏條形碼食性分析的結(jié)果,可以在一定程度上對作為雜食性魚類的青海湖裸鯉腸道組織結(jié)構(gòu)的特異性做出進(jìn)一步的解釋,同時也能說明魚類食性與其腸道結(jié)構(gòu)之間存在相互適應(yīng)關(guān)系。

青海湖裸鯉野生種群數(shù)量較少,生長緩慢,繁殖率低,對青海湖裸鯉腸道顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)和組織學(xué)、生長特性、食性的研究,在青藏高原魚類適應(yīng)極端環(huán)境的研究及闡明魚類食性與其腸道結(jié)構(gòu)之間的密切關(guān)系中具有重要的價值和地位,填補(bǔ)了利用高通量測序技術(shù)探究其食物類別的空缺,提供更新的數(shù)據(jù)參考,同時給青海湖裸鯉的人工增殖工作提供一定的科學(xué)基礎(chǔ)。