黃 瑩 婁格格 劉軒宇 滿 洲 姜能座 郭雅哲 朱曉鳴 葛汝祥劉昊昆 陳新華 童夢琪

(1.福建農(nóng)林大學(xué)海洋學(xué)院,福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;2.福建省測試技術(shù)研究所,福州 350003;3.中國科學(xué)院水生生物研究所,淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072)

魚粉是一種昂貴的優(yōu)質(zhì)蛋白源,為魚類和甲殼類動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)的主要來源[1]。然而,由于野生漁業(yè)種群減少,魚粉產(chǎn)量下降,導(dǎo)致供應(yīng)短缺和價(jià)格上漲[2]。在過去的幾十年里,隨著水產(chǎn)飼料工業(yè)的迅速發(fā)展,尋找優(yōu)質(zhì)且低成本的魚粉替代蛋白源得到了廣泛的研究。為了降低飼料成本,促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,水產(chǎn)商業(yè)飼料中植物蛋白源的添加比例逐漸增加。

菜粕在全球油粕產(chǎn)量中僅次于豆粕[3]。因其價(jià)格低廉、資源豐富和加工方便而被廣泛用于水產(chǎn)飼料[4]。菜粕的蛋白質(zhì)含量高,且擁有較高水平的必需氨基酸,如蛋氨酸和半胱氨酸[5]。在眾多的植物蛋白源中,菜粕具有較好的氨基酸平衡模式[6]。已有研究表明,菜粕可以一定比例添加到甲殼動(dòng)物飼料中而不會(huì)降低其生長性能,如紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)[7]、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[8]和南美藍(lán)對(duì)蝦(Litopenaeus stylirostris)[9]等。然而,與其他植物蛋白源一樣,菜粕含有許多抗?fàn)I養(yǎng)因子,包括低聚糖、酚類化合物、單寧、植酸、硫代葡萄糖苷及其衍生物等,這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長性能和健康狀況產(chǎn)生負(fù)面影響,應(yīng)限制其在飼料中的添加量[10,11]。高水平菜粕會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物飼料利用率低下[12—14],消化酶活性降低[15],肝腸組織結(jié)構(gòu)受損[16,17],代謝抑制[18],免疫功能減退[19,20]。雙低菜粕是雙低油菜籽產(chǎn)油后的副產(chǎn)物,其常規(guī)營養(yǎng)成分與普通菜粕無顯著差異[21],但其芥酸和硫代葡糖苷含量大幅降低且賴氨酸、蛋氨酸及精氨酸的含量較高[22,23]。雙低菜粕作為優(yōu)質(zhì)飼料蛋白源,目前已應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖方面[24]。

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)的環(huán)境適應(yīng)性好,繁殖能力強(qiáng)[25],是我國當(dāng)前養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的淡水甲殼類動(dòng)物。該蝦因口感美味,營養(yǎng)價(jià)值高,深受消費(fèi)者歡迎。目前,在克氏原螯蝦的養(yǎng)殖過程中人工配合飼料應(yīng)用較為廣泛,但由于沒有統(tǒng)一的營養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn),克氏原螯蝦飼料市場良莠不齊[26,27]?？耸显r為雜食性動(dòng)物,多種蛋白源均可應(yīng)用于其飼料中[28],包括魚粉、肉粉、蝦粉、豆粕、菜粕和昆蟲粉等[29],目前鮮有關(guān)于雙低菜粕在其飼料中適宜添加比例的研究。本試驗(yàn)研究不同雙低菜粕替代比例對(duì)克氏原螯蝦生長性能、體成分、消化酶活性、抗氧化能力、抗氧化和攝食相關(guān)基因表達(dá)等方面的影響,旨在為該蝦配合飼料中添加適宜比例的雙低菜粕提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料與試驗(yàn)分組

試驗(yàn)飼料的配方和常規(guī)化學(xué)成分如表1所示,氨基酸組成如表2所示。用雙低菜粕替代基礎(chǔ)飼料中0(R0)、25%(R25)、50%(R50)、75%(R75)和100%(R100)的魚粉蛋白,配置成雙低菜粕含量分別為0、21.25%、42.50%、63.75%和85%的5種等氮等能飼料。飼料原料由福建大昌生物科技實(shí)業(yè)有限公司提供。將所有飼料原料粉碎過后過40目篩,按照配方比例從小到大的順序逐次添加并混合均勻,之后使用飼料機(jī)(SLP-45,上海華夏漁業(yè)機(jī)械儀器工貿(mào)公司)制作成直徑1 mm大小的顆粒,60℃烘干后密封,放置在-20℃冰箱備用。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及化學(xué)組成(%干物質(zhì))Tab.1 Diet formulation and chemical composition of experimental diets (% in dry matter)

表2 試驗(yàn)飼料氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of experimental diets (% in dry matter)

表3 本試驗(yàn)所用引物Tab.3 Primer pairs used for RT-qPCR analysis of related genes in this study

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與養(yǎng)殖管理

克氏原螯蝦蝦苗選自湖北省萊克集團(tuán)小龍蝦良種選育中心。在正式試驗(yàn)開始前,克氏原螯蝦蝦苗放到室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)3周,對(duì)其進(jìn)行馴化,暫養(yǎng)期間投喂5組飼料構(gòu)成的混合飼料。試驗(yàn)開始時(shí),對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行24h的饑餓處理,挑取體質(zhì)健康、體格相近的克氏原螯蝦幼蝦[平均體重(2.49±0.01) g]隨機(jī)放入15個(gè)養(yǎng)殖水箱,每箱16尾。共設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組,每組3個(gè)重復(fù)。在試驗(yàn)期間,每天定時(shí)投喂飼料3次(9:00、17:00和22:00),投喂結(jié)束后清除缸內(nèi)殘餌和排泄物,換水量為1/3。發(fā)現(xiàn)死蝦后撈出,每天記錄攝食量及死蝦數(shù)量,一共持續(xù)42d。

克氏原螯蝦采用靜水養(yǎng)殖的方式,試驗(yàn)養(yǎng)殖系統(tǒng)由15個(gè)矩形塑料養(yǎng)殖箱(100 cm×50 cm×50 cm)組成,養(yǎng)殖箱水深保持在15 cm。每天測兩次(8:30和16:00)水溫和室溫,每周測一次水體DO值和氨氮水平。在整個(gè)養(yǎng)殖過程,養(yǎng)殖水體維持以下參數(shù): 水溫(21±2)℃,DO值≥6 mg/L,氨氮含量＜0.4 mg/L。光照周期為12L∶12D (8:30到20:30)。

1.3 試驗(yàn)取樣

在養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束禁食24h后,對(duì)每缸蝦進(jìn)行計(jì)數(shù)、稱重并記錄。每個(gè)缸中隨機(jī)選3尾蝦稱取體重,解剖后稱取肝胰腺重量,用于計(jì)算肝體比,并測量去殼后蝦肉的重量計(jì)算出肉率。此3尾蝦取肝胰腺和中腸,用中性甲醛固定后進(jìn)行組織切片制作。另取3尾蝦在冰盤上解剖后取肝胰腺和腸道,肝臟和腸道分別混合后部分用作酶活性的測定,剩余部分用于基因表達(dá)的分析,均迅速放入凍存管中經(jīng)液氮急凍,稍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存。再取3尾蝦用于體成分分析。

1.4 樣品的測定

參照文獻(xiàn)[30]的方法對(duì)本試驗(yàn)飼料及樣品蝦進(jìn)行水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量測定。樣品在105℃下烘干至恒重,通過失重法測定水分。粗蛋白含量使用凱氏定氮儀(Kjeltec8400,FOSS)測定。粗脂肪含量使用索氏抽提儀(ST243,FOSS)進(jìn)行測定。樣品在馬福爐中550℃燃燒3h,以失重法測定灰分。

肝胰腺中堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性及丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定,測定方法按說明書進(jìn)行。

從各組蝦的肝胰腺組織中分離出總RNA。分離出的RNA濃度由超痕量核酸蛋白測定儀(Scandrop 100,Analytik Jena,Germany)按照說明書進(jìn)行確認(rèn),按A260/A280的比例計(jì)算?；虻囊?正向和反向)序列、解鏈溫度、產(chǎn)物大小見表 3。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作,引物的擴(kuò)增效率在有效范圍(0,1)之內(nèi)。將cDNA保存在-80℃下,直至進(jìn)行qPCR分析。所有qPCR反應(yīng)均在analytickjenaqtower 2.2熒光定量PCR儀(德國)中進(jìn)行。qPCR系統(tǒng)由cDNA模板9 μL,10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix,10 μmol/L正/反定量引物各0.5 μL組成。qPCR反應(yīng)條件如下: 95℃ 15s,60℃ 1min,40個(gè)循環(huán)。根據(jù)上述qPCR反應(yīng)系統(tǒng)配置所有組分,并在PCR平板離心機(jī)中以4℃和6000 r/min的速度離心30s。然后將其置于定量PCR儀中,根據(jù)該程序進(jìn)行擴(kuò)增。分析熔融曲線以確認(rèn)這些反應(yīng)中存在單一產(chǎn)物。為了使基因表達(dá)數(shù)據(jù)正?；?使用18S基因作為管家基因。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組的基因表達(dá)水平。

1.5 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算公式: 存活率(SR,%)=100×Nt/N0;特定生長率(SGR,%/d)=100×(LnWt-LnW0)/t;飼料效率(FE,%)=100×(Wt-W0)/F;蛋白質(zhì)效率比(PER)=100×(Wt-W0)/F×P;肝體比(HSI)=100×(Wz/W);出肉率(FY,%)=100×(Wf/W)。式中,N0為試驗(yàn)開始時(shí)試驗(yàn)蝦的尾數(shù),Nt為試驗(yàn)結(jié)束后試驗(yàn)蝦的存活尾數(shù),W0為平均初始體重(g),Wt為平均終末體重(g),t為試驗(yàn)時(shí)長(d),F為飼料攝入干重(g),P為飼料中粗蛋白質(zhì)含量(%),W為蝦體質(zhì)量(g),Wz為肝胰臟質(zhì)量(g),Wf為去殼蝦肉質(zhì)量(g)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)一元方差(One-way ANOVA)分析后,用Duncan’s 進(jìn)行多重比較,當(dāng)P＜0.05時(shí),為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長性能的影響

如表4所示,當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦平均終末體重、特定生長率、飼料效率和蛋白質(zhì)效率與R0組相比顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦存活率顯著低于R0組(P＜0.05)。與R0組相比,R50和R100組克氏原螯蝦幼蝦肝體比顯著增高(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),顯著降低了克氏原螯蝦幼蝦出肉率(P＜0.05)。

2.2 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦體成分的影響

如表5所示,與R0組相比,當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦的水分顯著提高(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦的粗蛋白和粗脂肪均顯著低于R0組(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦的灰分顯著下降(P＜0.05)。

2.3 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦消化酶活性的影響

如表6所示,與R0組相比,當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺胰蛋白酶、肝胰腺脂肪酶和腸道胰蛋白酶活性顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例為100%時(shí),顯著降低了克氏原螯蝦幼蝦腸道脂肪酶活性(P＜0.05)。飼料中雙低菜粕的添加對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺淀粉酶和腸道淀粉酶活性無顯著影響(P＞0.05)。

表6 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦消化酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.6 Effects of replacing fish meal with rapeseed meal on digestive enzyme in juvenile P.clarkii (mean±SE)

2.4 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化指標(biāo)的影響

如表7所示,與R0組相比,當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺AKP活性顯著升高(P＜0.05)。R100組克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺GPT活性顯著上升(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥25%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺GOT活性顯著上升(P＜0.05),CAT和GST活性顯著下降(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),SOD和GPX活性顯著下降(P＜0.05)?？耸显r幼蝦肝胰腺M(fèi)DA含量隨著飼料中雙低菜粕替代比例的增高而上升,當(dāng)雙低菜粕替代比例為100%時(shí)顯著高于R0組(P＜0.05)。

表7 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺生化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Tab.7 Effects of replacing fish meal with rapeseed meal on biochemical indexes in hepatopancreas of juvenile P.clarkii (mean±SE)

2.5 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺和腸道組織學(xué)的影響

如圖1所示,R0組克氏原螯蝦幼蝦的肝胰腺組織結(jié)構(gòu)完整,肝小管排列緊密,界限明顯清晰,管腔呈星形,細(xì)胞分布均勻飽滿,形態(tài)正常。R25組和R0組相比肝胰腺組織結(jié)構(gòu)無顯著差異,無明顯病變。R50組肝小管排列松散,部分肝小管管腔擴(kuò)張,上皮細(xì)胞腫脹、空泡化,部分基膜溶解。R75組肝小管和管腔擴(kuò)張更加明顯,部分上皮細(xì)胞壞死解體、空泡化,B細(xì)胞腫大,數(shù)量增多,R細(xì)胞萎縮變小,數(shù)量明顯減少;肝小管退化,基膜界限不清晰,部分基膜破裂分離。R100組肝小管完全退化,結(jié)構(gòu)紊亂,受損嚴(yán)重,上皮細(xì)胞大量壞死,R細(xì)胞進(jìn)一步萎縮消失,無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu),部分破裂組織落入管腔和肝小管間隙。

圖1 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺組織學(xué)的影響Fig.1 Effects of replacing fish meal with rapeseed meal on hepatopancreas histology of juvenile P. clarkii

如圖2所示,R0組正?？耸显r幼蝦的腸道組織結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞排列緊密,呈規(guī)則柵欄狀排列,固有層緊密。R25組和R0組的腸道組織結(jié)構(gòu)相比并無顯著差異,無明顯病變。R50組固有層萎縮,出現(xiàn)腸細(xì)胞脫落和空泡化現(xiàn)象。R75組上皮層紊亂,上皮細(xì)胞形狀不規(guī)則,呈異常排列。R100組上皮細(xì)胞與結(jié)締組織分離,上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損,肌層細(xì)胞壞死,腸道結(jié)構(gòu)不完整,腸絨毛明顯變短。

圖2 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦中腸組織學(xué)的影響Fig.2 Effects of replacing fish meal with rapeseed meal on midgut histology of juvenile P. clarkii

2.6 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺和腸道相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖3所示,所有雙低菜粕替代組肝胰腺的AKP基因表達(dá)量均顯著高于R0組(P＜0.05)。隨著雙低菜粕替代比例的提高,克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺CAT基因表達(dá)量逐漸降低,均顯著低于R0組(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí),與R0組相比,克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺SOD和GPX基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺NPY和TRY基因表達(dá)量顯著低于R0組(P＜0.05)。R100組克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺M(fèi)SNP基因表達(dá)量顯著高于R0組(P＜0.05)。

圖3 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of replacing fish meal with rapeseed meal on gene expression in hepatopancreas of juvenile P. clarkii

如圖4所示,當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí),與R0組相比,克氏原螯蝦幼蝦腸道AKP基因表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)。所有雙低菜粕替代組腸道的CAT基因表達(dá)量均顯著低于R0組(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦腸道SOD基因表達(dá)量顯著低于R0組(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),與R0組相比,克氏原螯蝦幼蝦腸道GPX基因表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)?？耸显r幼蝦腸道NPY基因表達(dá)量隨著雙低菜粕替代比例的提高而降低,當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí)顯著低于R0組(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥75%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦腸道TRY基因表達(dá)量顯著低于R0組(P＜0.05)。當(dāng)雙低菜粕替代比例≥50%時(shí),克氏原螯蝦幼蝦腸道MSNP基因表達(dá)量顯著高于R0組(P＜0.05)。

圖4 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦腸道基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of replacing fish meal with rapeseed meal on gene expression in intestines of juvenile P. clarkii

3 討論

3.1 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦生長性能和體成分的影響

菜粕通常被作為重要的植物蛋白源添加到部分水產(chǎn)動(dòng)物的飼料中[18]。與本試驗(yàn)結(jié)果相同,飼料中高水平的菜粕可顯著降低日本鱸(Lateolabrax japonicus)[31]和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)[32]的存活率。存活率的降低可能和菜粕中的有毒物質(zhì)有關(guān),如: 單寧被認(rèn)為是動(dòng)物中毒致死的原因[33]。另有研究表明,菜粕替代魚粉比例達(dá)到60%時(shí),顯著降低了大黃魚(Larimichthys crocea)的終末體重和特定生長率[34]。當(dāng)菜粕替代飼料中40%魚粉的蛋白質(zhì)時(shí),顯著降低了日本鱸的飼料效率[31]。當(dāng)飼料中雙低菜粕含量達(dá)到8.2%時(shí),顯著提高了日本沼蝦的飼料系數(shù)[35]。在本試驗(yàn)中,飼料中雙低菜粕替代魚粉比例≥75%時(shí),對(duì)克氏原螯蝦幼蝦終末體重和特定生長率產(chǎn)生了不良影響,顯著降低了飼料效率,與以上結(jié)論相似。生長性能的降低是由于菜粕中含有抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì),如硫代葡萄糖苷、植酸和單寧等[36],這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的高攝入量會(huì)導(dǎo)致代謝抑制[37]。硫代葡萄糖苷和其分解產(chǎn)物如: 異硫氰酸鹽(ITC)、惡唑烷硫酮(OZT)、硫氰酸酯(TC)和腈(RCN),可通過刺激消化道黏膜而影響飼料利用,嚴(yán)重危害動(dòng)物的健康[15,38]。此外,菜粕中氨基酸不平衡和必需氨基酸的缺乏[39],以及菜粕含有高水平粗纖維而影響飼料的消化率,從而導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物的生長性能不佳[40]。當(dāng)菜粕替代豆粕比例達(dá)到60%時(shí),可顯著降低奧尼羅非魚(Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus)的蛋白質(zhì)效率[41]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述試驗(yàn)相同,克氏原螯蝦幼蝦飼料中雙低菜粕替代魚粉比例≥75%時(shí)蛋白質(zhì)效率顯著降低,可能是菜粕中的植酸會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成不溶性復(fù)合物,大大降低蛋白質(zhì)的生物效力和消化率[38]。

肝體比是評(píng)價(jià)生物體健康、營養(yǎng)狀況、能量儲(chǔ)備的指標(biāo)[42]。有毒物質(zhì)可導(dǎo)致肝臟腫大從而影響肝體比[43]。出肉率作為衡量水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物肌肉品質(zhì)、經(jīng)濟(jì)性狀和生產(chǎn)性能的重要指標(biāo),反映了水生生物的生長情況,是評(píng)價(jià)甲殼動(dòng)物食用價(jià)值的重要指標(biāo)[44,45]。與本試驗(yàn)結(jié)果相同,高菜粕替代水平(34.8%、45%和100%)可顯著提高吉富羅非魚(Oreochromis niloticus,GIFT)[46]、奧尼羅非魚和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[41,47]的肝體比?？赡苁侵参镄燥暳现匈嚢彼岬娜狈?限制了蛋白質(zhì)的合成,導(dǎo)致未用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸部分轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)或糖原并沉積在肝臟中,從而增加動(dòng)物的內(nèi)臟質(zhì)量,提高了肝體比[48]?；旌现参锏鞍?玉米蛋白粉、小麥面筋、擠壓豌豆、菜粕和擠壓全麥)高水平替代飼料中魚粉后,顯著降低金頭鯛(Sparus aurata)的出肉率[49]。在本試驗(yàn)中,飼料中雙低菜粕的添加顯著降低了克氏原螯蝦幼蝦的出肉率,這可能是因?yàn)轱暳现腥狈Φ鞍彼岷唾嚢彼釋?duì)肌肉細(xì)胞的生長和增殖產(chǎn)生了不利影響[14]。

菜粕可顯著提高鱖(Siniperca chuatsi)的魚體水分,降低粗脂肪含量[18]。凡納濱對(duì)蝦飼料中雙低菜粕替代魚粉后,全蝦脂肪有下降的趨勢[50]。當(dāng)飼料中菜粕添加比例達(dá)到32%時(shí),顯著降低了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的魚體粗蛋白含量,不同菜粕替代水平對(duì)虹鱒魚體粗脂肪含量無顯著影響[51]。張明明等[52]以吉富羅非魚為研究對(duì)象,在飼料中添加60%的雙低菜粕,可顯著降低魚體粗脂肪含量。在本試驗(yàn)中,當(dāng)雙低菜粕替代魚粉比例≥50%,克氏原螯蝦幼蝦的全蝦粗蛋白和粗脂肪均顯著低于R0組,表明蛋白質(zhì)和脂肪合成受到抑制[16]。菜粕中的單寧和植酸可抑制動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,減少克氏原螯蝦幼蝦體蛋白質(zhì)和脂肪的沉積[53]。

3.2 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦攝食和消化的影響

水生動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)素的消化和利用在很大程度上取決于腸道中消化酶活性的水平,消化酶活性可受外源和內(nèi)源因素的影響,餌料是主要的外源因素之一[54]。使用菜粕替代飼料中50%的魚粉時(shí),顯著降低了紅螯螯蝦肝胰腺胰蛋白酶和脂肪酶活性[7]。飼料中菜粕含量對(duì)黃顙魚(Pseudobagrus ussuriensis)腸道內(nèi)α-淀粉酶和脂肪酶活性沒有顯著影響,當(dāng)替代魚粉水平為≥20%時(shí),黃顙魚胃蛋白酶活性顯著降低[20]。日本鱸的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性隨著飼料中菜粕水平的增加而顯著降低[31]。在本試驗(yàn)中,飼料中雙低菜粕替代比例達(dá)到75%時(shí),可顯著降低克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺胰蛋白酶、脂肪酶和腸道胰蛋白酶活性。消化酶活性的降低和菜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子相關(guān)[7],例如植酸在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)影響一系列的消化酶活性,抑制消化和營養(yǎng)吸收[55],而單寧可以和消化酶結(jié)合從而降低消化酶的活性[53]。

神經(jīng)肽Y(NPY)是中樞系統(tǒng)中強(qiáng)大的食欲刺激劑,是食欲調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中主要的基因,主要起促進(jìn)機(jī)體攝食的作用[56,57]。在同一飼料蛋白水平下以植物蛋白(豆粕、菜粕和棉粕)為蛋白源的試驗(yàn)組斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)大腦中npy基因表達(dá)量顯著低于以魚粉為蛋白源的試驗(yàn)組[58]。在雜交石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)幼魚飼料中,以大豆蛋白替代部分魚粉顯著降低了其npy基因表達(dá)量[59]。胰蛋白酶(TRY)是一種重要的消化酶,TRY基因表達(dá)的下調(diào)會(huì)影響消化功能,從而影響?zhàn)B殖動(dòng)物的生長[60]。與魚粉組相比,高菜粕組顯著降低了草魚肝胰腺try基因表達(dá)量[61]。Myosuppressin屬于一組神經(jīng)肽,僅在昆蟲或甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)[62],具有抑制腸道收縮[63]、拒食特性[64]和抑制神經(jīng)肽分泌[65]等多種特性。在本試驗(yàn)中,雙低菜粕替代組肝胰腺和腸道NPY和TRY基因表達(dá)量下降,MSNP基因表達(dá)量上升,表明飼料內(nèi)雙低菜粕的添加會(huì)抑制克氏原螯蝦幼蝦的食欲,導(dǎo)致食物攝入量減少,并降低其腸道消化能力。這可能是菜粕中的單寧、芥子堿及硫代葡萄糖苷水解產(chǎn)生的異硫氰酸酯等都會(huì)降低飼料的適口性,進(jìn)而影響?zhàn)B殖動(dòng)物的攝食。另有研究表明,NPY基因表達(dá)量下降可能是因?yàn)椴似芍匈嚢彼岬娜狈?賴氨酸可通過味覺受體T1R1增加鈣離子的釋放調(diào)節(jié)NPY[66]。

3.3 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦抗氧化性能的影響

AKP是溶酶體系統(tǒng)的主要組成部分,可消除和水解微生物[67],參與細(xì)胞的吞噬作用和細(xì)胞內(nèi)解毒[68,69]。在本試驗(yàn)中,雙低菜粕高比例替代魚粉顯著提高了克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺AKP活性,有研究表明,當(dāng)有毒物質(zhì)進(jìn)入肝胰臟時(shí),AKP活性升高發(fā)揮其解毒功能[70]。GPT和GOT是重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶,在蛋白質(zhì)代謝中起重要作用,其活性直接反映了蛋白質(zhì)代謝的效率,也是反映肝細(xì)胞生理狀態(tài)的主要敏感指標(biāo)[71,72]。與本試驗(yàn)結(jié)果相同,飼料中添加菜粕顯著提高了亞洲紅尾鯰肝臟GPT和GOT活性,激活了蛋白質(zhì)的降解[15]。CAT、SOD、GPX和GST作為主要的抗氧化酶在體液免疫系統(tǒng)中起著重要作用[73,74]。CAT能夠保護(hù)細(xì)胞免受抗氧化系統(tǒng)中H2O2引起的損傷[75]。甲殼類動(dòng)物的SOD是主要的抗氧化指標(biāo),它可以清除生物體中過量的自由基和防御其他氧化損傷[76]。GPX可以催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O或?qū)⑦^氧化脂質(zhì)還原為正常狀態(tài),以防止細(xì)胞膜和其他生物組織的破壞[77]。GST是一種參與宿主細(xì)胞解毒的關(guān)鍵酶[78]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其含量間接反映了體內(nèi)活性氧自由基的含量和組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度[19]。飼料中菜粕和棉粕的添加量增加20%可顯著降低草魚(Ctenopharyngodon idellus)血清中SOD和GPX的活性[4]。黃顙魚血清中SOD和CAT活性隨著飼料中菜粕水平的增加而降低,血清MDA含量則隨著飼料中菜粕水平的增加而提高[20]。芥酸是菜粕中天然存在的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一,隨著草魚飼料中芥酸含量的增加,其腸道GPX、GST、CAT、CuZnSOD和MnSOD活性逐漸降低,MDA含量逐漸上升[79]。使用植物蛋白替代魚粉,會(huì)顯著降低水產(chǎn)動(dòng)物的抗氧化能力[80,81]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述相同,雙低菜粕替代75%的魚粉時(shí)可顯著降低克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺GPX、GST、CAT和SOD活性,提高幼蝦MDA含量,表明高比例的雙低菜粕替代可降低克氏原螯蝦幼蝦的抗氧化能力。

在本試驗(yàn)中,克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺和腸道AKP基因表達(dá)量隨著雙低菜粕添加比例的增多而升高,可能是為了維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)而采取的主動(dòng)防御措施,機(jī)體試圖通過免疫反應(yīng)來適應(yīng)不利情況,同時(shí)這也是一種被動(dòng)的病理顯示[82,83]。高水平棉粕和菜粕飼料飼喂的草魚腸道cuznsod、mnsod、cat基因表達(dá)量均顯著低于魚粉組[19]。投喂高水平豆粕飼料的大菱鲆(Psetta maximaL.)sod和gpx基因表達(dá)量顯著低于魚粉組[84]。飼料中植物蛋白(豆粕、花生粕和菜粕)水平從50%提高到70%時(shí),顯著降低中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)肝胰腺cytmnsod和mtmnsod基因表達(dá)量[85]。在本試驗(yàn)中,克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺和腸道CAT、SOD和GPX基因表達(dá)量均隨著雙低菜粕替代比例的增高而降低,雙低菜粕可能通過下調(diào)CAT、SOD和GPX基因表達(dá)量來降低腸道和肝胰腺抗氧化酶的活性,從而降低克氏原螯蝦幼蝦機(jī)體抗氧化能力。這可能是由于菜粕所含的抗?fàn)I養(yǎng)因子和有毒物質(zhì)的負(fù)面影響。

3.4 雙低菜粕替代魚粉對(duì)克氏原螯蝦幼蝦肝臟和腸道組織學(xué)的影響

肝胰腺是甲殼動(dòng)物消化、吸收、儲(chǔ)存、排泄和代謝中心[86,87],也是主要的解毒器官[78]。隨著飼料中雙低菜粕替代水平的增高,大黃魚肝臟細(xì)胞空泡化程度逐漸加深,細(xì)胞核濃縮變小,菜粕替代比例為100%時(shí),肝臟細(xì)胞幾乎完全空泡化,細(xì)胞核消失[88]。使用雙零菜粕替代尼羅羅非魚飼料中37.5%以上的魚粉時(shí),其肝細(xì)胞被嚴(yán)重破壞,排列紊亂[5]。在本試驗(yàn)中,隨著飼料中雙低菜粕替代比例的提高,克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺受損程度逐步加深,R75和R100組肝小管完全退化,結(jié)構(gòu)紊亂,受損嚴(yán)重,R細(xì)胞萎縮和消失。R細(xì)胞是營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存的主要場所,可用于監(jiān)測甲殼動(dòng)物的營養(yǎng)狀況,R細(xì)胞的萎縮和消失可能意味著攝入的飼料不能滿足克氏原螯蝦幼蝦營養(yǎng)需求[89]。高比例的雙低菜粕替代可引起克氏原螯蝦幼蝦B細(xì)胞腫大,這可能是由氧化應(yīng)激造成的,相似的結(jié)果在低魚粉飼料對(duì)南美白對(duì)蝦的研究中也有報(bào)道[90]。肝胰腺病理損傷將會(huì)導(dǎo)致其功能的改變和對(duì)分泌、吸收、儲(chǔ)存和解毒等基本過程的干擾[91]。這些損傷推測是由菜粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子導(dǎo)致的,如菜粕中的腈會(huì)對(duì)動(dòng)物的肝臟產(chǎn)生巨大的毒性損害作用[92]。

由于腸道是營養(yǎng)吸收的主要場所,因此可以用腸道組織學(xué)來評(píng)估營養(yǎng)吸收的效率,而腸道結(jié)構(gòu)的損壞會(huì)降低其吸收功能[93]。投喂含41%菜粕的飼料會(huì)造成紅螯螯蝦的圍食膜與黏膜皺褶完全分離[7]。菜粕替代飼料中37.5%魚粉顯著降低了翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)腸道的絨毛高度、絨毛寬度和絨毛密度,增加了腸壁厚度和杯狀細(xì)胞數(shù)目,且造成腸絨毛大量脫落[94]。用菜粕替代魚粉和豆粕對(duì)尼羅羅非魚的腸道形態(tài)有顯著影響,75%替代組腸絨毛黏膜皺襞嚴(yán)重空泡化;100%替代組腸道出現(xiàn)死亡細(xì)胞數(shù)量增多、炎癥及組織壁和絨毛完全變性等現(xiàn)象[17]。在本試驗(yàn)中,隨著飼料中雙低菜粕替代比例的提高,克氏原螯蝦幼蝦腸道受損程度逐步加深。腸道組織學(xué)的變化可能與菜粕中所含抗?fàn)I養(yǎng)因子的水解產(chǎn)物(如異硫氰酸酯、植酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物)[17]和不可利用的碳水化合物(包括非淀粉多糖、抗性淀粉和某些低聚糖)[13]相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,飼料中雙低菜粕替代克氏原螯蝦幼蝦飼料中魚粉蛋白的比例≥50%時(shí),會(huì)對(duì)克氏原螯蝦的消化酶活力和抗氧化能力,損壞其肝胰腺和腸道組織結(jié)構(gòu),對(duì)其攝食、消化和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。克氏原螯蝦幼蝦飼料中雙低菜粕含量以不超過21.25%為宜。