楊云皓 李發(fā)菊 許望東 何成松

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科,四川 瀘州 646000)

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種受多種內(nèi)源性和外源性因素影響的慢性炎癥性自身免疫性疾病,病理表現(xiàn)主要為滑膜炎,逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終導致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙。該病發(fā)病率高,致殘率高,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,是造成人類喪失勞動力和致殘的主要原因之一,亦給家庭和社會帶來沉重負擔。目前臨床上以非甾體抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、糖皮質(zhì)激素、改善病情抗風濕藥(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs)、生物制劑及外科手術(shù)治療為主,但上述治療手段因副作用或價格昂貴仍不能完全滿足臨床訴求[1-2]。中醫(yī)運用桂類藥材治療痹癥歷史悠久、方便有效且廉價,RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇。研究發(fā)現(xiàn),肉桂具有抗關(guān)節(jié)炎作用,但具體有效成分尚不清楚。肉桂樹皮揮發(fā)油的主要成分是桂皮醛(Cinnamaldehyde,Cin),其具有藥理活性強、毒性低、成本低等特點,具有抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[3-4]。骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種多功能的細胞外基質(zhì)蛋白,被認為是一種在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用的促炎因子[5]。本研究擬采用Ⅱ型膠原誘導的關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,探究Cin對Ⅱ型CIA大鼠的作用及對OPN水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠20只,6～8周齡,體重(200±20)g,購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2018-017,動物使用許可證號:SYXK(川)2018-065。實驗由西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(倫理批準號:SWMU20220023)。

1.2 主要試劑和儀器 桂皮醛(上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司,純度>98%),牛Ⅱ型膠原蛋白(上海金穗生物科技有限公司),OPN、白介素-6(IL-6)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒和定量PCR試劑(武漢科鹿生物科技有限責任公司),中性樹膠、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒、PMSF、脫脂奶粉、羊抗兔二抗(艾斯本技術(shù)有限公司),GAPDH兔源單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),OPN兔源單克隆抗體(上海abcam公司);RM2016切片機(上海徠卡儀器有限公司),IX51顯微鏡(日本奧林巴斯),熒光定量PCR儀:StepOneTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國生命技術(shù)公司),TGL-16冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),DR-200Bs酶標儀(Diatek公司),DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 造模、分組及給藥 20只大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量Cin組、高劑量Cin組,每組5只。除對照組外,其余3組均按以下方法建立CIA大鼠模型,將牛Ⅱ型膠原與乙酸溶液混合,并在4 ℃下持續(xù)搖擺12 h,以獲得8 mg/mL膠原蛋白溶液。將膠原蛋白溶液與完全弗氏佐劑(體積比為1∶1)混合,以獲得終濃度為4 mg/mL膠原蛋白乳劑,按0.3 mL/只于造模大鼠足跖部及尾根部多點皮下注射,7 d后再進行1次加強免疫,對照組以同樣的方法注射等量0.9%氯化鈉溶液,造模14 d[6]。造模后根據(jù)足趾腫脹、變形情況進行關(guān)節(jié)炎評分:0分為無足趾腫脹;1分為輕微腫脹;2分為中度腫脹;3分為嚴重腫脹;4分為嚴重腫脹伴有變形。每個足趾最高評分為4分,總分最大為16分,總分大于4分的大鼠表示造模成功[7]。造模第14 d后開始給藥,低、高劑量Cin組按照100、200 mg/kg灌胃,1次/d,持續(xù)3周;對照組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,1次/d,持續(xù)3周。

1.3.2 ELISA法檢測大鼠血清中OPN及炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平 最后一次給藥24 h后,通過腹腔注射戊巴比妥將大鼠麻醉,采集腹主動脈血,置于4 ℃冰箱中靜置2 h,然后2 000 r/min離心10 min,收集上層血清。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清OPN、IL-6、IL-17和TNF-α含量,嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 免疫組織化學法(IHC)檢測大鼠滑膜組織中OPN表達 將石蠟組織切片脫蠟至水,切片置于0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(PH 6.0)中,加熱進行抗原修復,冷卻至室溫,用組化筆在組織周圍畫圈,3% H2O2室溫孵育20 min,封閉內(nèi)源性的過氧化物酶。用5% BSA稀釋抗體,滴加適量OPN兔源一抗稀釋液,一抗稀釋比例1∶150,4 ℃過夜。復溫,滴加山羊抗兔二抗稀釋液,二抗稀釋比例為1∶200,37 ℃水浴鍋孵育30 min。配制DAB工作液,顯微鏡下控制顯色,陽性為棕黃色。進行顯色后,蘇木素復染,鹽酸乙醇分化,氨水泛藍,脫水、透明、中性樹膠封片。顯色結(jié)果進行半定量分析,光鏡下胞質(zhì)及胞膜呈棕色為陽性細胞,用光學顯微鏡放大400倍拍照,每張切片隨機選取3個視野,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析,表達水平以平均光密度計算。

1.3.4 Western blot法檢測大鼠滑膜組織中OPN的蛋白表達 取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,組織塊用預冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,剪成小塊置于勻漿器中,加入200 μL蛋白裂解液,冰浴徹底勻漿;將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,冰浴30 min,期間用移液器反復吹打,12000 r/min離心5 min,吸取上清液,BCA法測定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳,上樣后先80 V電泳30 min,再調(diào)整為120 V電泳30 min,按300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min,加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,隨后將條帶加入OPN兔源一抗蛋白稀釋液中,一抗稀釋比例為1∶1 000,4 ℃過夜,第2天回收已稀釋的一抗,用TBST洗三次,每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗,二抗稀釋比例為1∶10 000,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下?lián)u床上洗四次,每次5 min,后滴加ECL發(fā)光液,反應1 min后置于暗室中曝光,隨后顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白,用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.3.5 RT-QPCR方法檢測大鼠軟骨中OPN mRNA水平 取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織,每個組織稱取50 mg。采用TRIpure法提取SD大鼠軟骨總RNA,取總RNA 15 μL反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒) ,取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進行內(nèi)參基因GAPDH及目的基因OPN的擴增。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司完成引物合成,引物序列:GAPDH(164bp)引物序列上游:5’-AACAGCAACTCCCATTCTTCC-3’,下游:5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’;OPN(206bp)引物序列上游:5’-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3’,下游:5’-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3’。反應條件:預變性95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 45 s,40次循環(huán)。采用2-△△CT公式計算和比較相關(guān)基因表達水平的CT值。

1.3.6 HE染色觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理學改變 將大鼠膝關(guān)節(jié)標本置于4%多聚甲醛中固定,隨后進行脫鈣、徹底脫去鈣鹽后進行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度為2～3 μm)。組織切片置于載玻片上,二甲苯脫蠟,乙醇溶液復水,HE染色,最后脫水封片,顯微鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)組織的病理改變。

2 結(jié)果

2.1 Cin對CIA大鼠關(guān)節(jié)情況和關(guān)節(jié)炎評分影響 造模第14天,與對照組比較,各組大鼠足跖出現(xiàn)明顯腫脹,關(guān)節(jié)炎評分顯著升高(P<0.05);造模第21、28、35天,與模型組比較,低、高劑量Cin組足跖腫脹緩解,大鼠關(guān)節(jié)炎評分顯著降低(P<0.05);造模第35天,與低劑量Cin組比較,高劑量Cin組大鼠關(guān)節(jié)炎評分顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 Cin對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評分的影響

2.2 Cin對CIA大鼠血清中OPN及炎癥因子水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α表達水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α的表達水平均顯著減少(P<0.05);與低劑量Cin組比較,高劑量Cin組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α的表達水平顯著減少(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清OPN、IL-6、IL-17、TNF-α含量比較

2.3 IHC法檢測Cin對CIA大鼠滑膜組織OPN蛋白表達的影響 IHC結(jié)果顯示棕黃色的陽性產(chǎn)物主要分布于胞膜及胞質(zhì)。IHC圖像表明對照組滑膜組織可見OPN少量表達,與對照組相比,模型組大鼠滑膜的OPN蛋白表達更高,低劑量Cin和高劑量Cin治療可降低CIA滑膜OPN蛋白表達(圖1)。半定量分析結(jié)果表明,與對照組比較,模型組滑膜組織OPN表達明顯增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組滑膜組織OPN表達均明顯減少(P<0.05);高劑量Cin組滑膜組織OPN表達減少更顯著(P<0.05),見圖2。

圖1 各組大鼠滑膜組織免疫組織化學變化(IHC 400×)

圖2 各組大鼠滑膜OPN表達的平均光密度值

2.4 Western blot法檢測Cin對CIA大鼠滑膜組織OPN蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組滑膜組織中OPN蛋白相對表達水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組中OPN蛋白相對表達水平顯著減少(P<0.05),表明Cin抑制了滑膜組織中OPN蛋白的表達,且具有劑量依賴性,見圖3。

2.5 Cin對CIA大鼠軟骨中OPN mRNA表達的影響 各組大鼠軟骨中OPN mRNA的相對定量分析結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠軟骨OPN mRNA表達顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組大鼠軟骨OPN mRNA表達顯著減少(P<0.05),其中高劑量Cin組大鼠軟骨中OPN mRNA表達較低劑量Cin組減少(P<0.05),見圖4。

圖4 各組大鼠OPN mRNA在軟骨中的表達

2.6 Cin對CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)的影響 各組大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果顯示,對照組滑膜組織無炎癥細胞浸潤和滑膜增生,模型組滑膜組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤和滑膜增生,低劑量Cin組以及高劑量Cin組經(jīng)過Cin治療后都可減輕大鼠關(guān)節(jié)炎誘導的滑膜組織炎性細胞浸潤和滑膜增生,見圖5。

圖5 各組大鼠滑膜病理組織變化(HE 400×)

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性關(guān)節(jié)炎,其特征是關(guān)節(jié)腫痛、晨僵、關(guān)節(jié)畸形和殘疾。目前,RA主要通過藥物治療,其中NSAIDs和糖皮質(zhì)激素能有效緩解RA患者的疼痛,但對病情的改善無明顯作用,其嚴重的胃腸反應、肝腎毒性、心血管事件等副作用限制了其臨床應用。DMARDs治療對RA病情控制至關(guān)重要,但長期使用也有較明顯副作用,同時DMARDs對部分患者治療效果不佳。生物制劑常用于對傳統(tǒng)DMARDs無反應的中重度RA患者。雖然有效,但由于其副作用(易受嚴重感染和癌癥風險)和高昂價格,這些靶向藥物的使用受到限制。 RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇。在過去的數(shù)千年里,中醫(yī)為RA的治療提供了許多有用且廉價的方法和藥物[8]。肉桂是樟科樟屬植物,習稱“桂類藥材”,藥食用途廣泛,具有補火助陽、溫里散寒的功效;Cin是從肉桂樹皮中分離得到的一種活性化合物,是肉桂的代表性成分,具有積極的抗菌、抗炎、抗腫瘤和降糖等作用,可用于治療血液循環(huán)障礙、消化不良和炎癥等[3-4]。

RA的發(fā)病機制涉及多種細胞因子和細胞組成的復雜網(wǎng)絡(luò),這些細胞釋放細胞因子會觸發(fā)滑膜細胞增殖,并對軟骨和骨骼造成損傷。細胞因子TNF-α和IL-6的參與是RA發(fā)病機制的核心,其他細胞因子如IL-17也在其中發(fā)揮重要作用[9]。在RA中,TNF-α可以通過激活NF-κB信號通路發(fā)揮促炎作用,TNF-α能夠誘導白細胞和內(nèi)皮細胞的激活,細胞因子和趨化因子的級聯(lián)反應以及血管生成,此外,TNF-α還能夠調(diào)控破骨細胞的生成,抑制成骨細胞的分化,從而打破骨代謝平衡,產(chǎn)生骨質(zhì)損傷[10]。IL-6是一種急性期蛋白,可增強機體的炎癥反應,RA患者急性期C反應蛋白生成、血管翳形成和貧血等典型表現(xiàn)可以用IL-6的許多生物學活性來解釋[11]。有研究表明,IL-6可調(diào)節(jié)Th17細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cell,Treg)的分化。Th17細胞發(fā)育也需要IL-6-STAT3通路,IL-6-SATA3信號軸的增強會導致大鼠出現(xiàn)IL-17A介導的自身免疫性關(guān)節(jié)炎[12]。此外,IL-6可以調(diào)節(jié)Treg與Th17細胞的平衡。Treg細胞轉(zhuǎn)化為Th17細胞是由滑膜成纖維細胞衍生的IL-6誘導的,轉(zhuǎn)化的Th17細胞具有更強破骨作用[13]。IL-6還與TNF-α、IL-17聯(lián)合調(diào)節(jié)破骨細胞生成,進而導致骨質(zhì)破壞與骨侵蝕[11]。IL-17參與RA疾病發(fā)生發(fā)展進程,它主要可促進成纖維樣滑膜細胞的激活、破骨細胞的生成、中性粒細胞、巨噬細胞和B細胞的招募和激活。IL-17和TNF-α之間的協(xié)同作用可激活促炎介質(zhì)的產(chǎn)生,如IL-1β、IL-6、IL-8、前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶,從而促進早期炎癥向慢性關(guān)節(jié)炎進展[14-15]。TNF-α、IL-17和IL-6在RA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著協(xié)同作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組大鼠足跖明顯腫脹,關(guān)節(jié)炎評分顯著升高,關(guān)節(jié)組織病理切片出現(xiàn)炎性細胞浸潤和滑膜增生,血清中炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α水平亦顯著升高,與模型組比較,桂皮醛治療組大鼠足跖腫脹明顯減輕,關(guān)節(jié)炎評分顯著降低,血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平亦顯著降低,表明Cin可減少關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的釋放,降低大鼠關(guān)節(jié)炎評分,減輕滑膜炎癥反應,進一步緩解大鼠關(guān)節(jié)組織損傷。

OPN是一種分布廣泛的細胞外基質(zhì)蛋白,被認為是參與RA發(fā)病中的一種重要促炎因子。CD4+ T細胞分泌的OPN可通過IL-18促進Th1細胞因子在局部炎癥中的作用,Th1細胞因子在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[5]。OPN還參與白細胞、淋巴細胞和單核細胞聚集、遷移的過程,并促進相關(guān)炎癥因子分泌,進而推動滑膜炎的發(fā)展[18]。OPN與骨代謝過程密切相關(guān),OPN影響Th1/Th2細胞的平衡以及通過T細胞表面受體誘導Th17細胞分化均可調(diào)節(jié)IL-17水平,進而通過Syk/PI3K/Akt信號通路和NF-kB信號通路增強破骨細胞活性,最終導致骨和軟骨破壞[19]。OPN還通過與細胞表面avb3整合素和CD44相互作用促進破骨細胞與骨基質(zhì)的附著。OPN與整合素和CD44等受體相互作用,調(diào)節(jié)軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化、炎癥、代謝的生理和病理過程[20]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)OPN缺乏可防止關(guān)節(jié)軟骨破壞,抑制OPN表達可改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥反應和骨破壞,這支持OPN在RA的骨代謝過程中發(fā)揮重要作用[21]。本研究中,OPN在CIA大鼠血清、滑膜、軟骨中顯著升高,并且這一趨勢被Cin逆轉(zhuǎn)。OPN改變趨勢與CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評分、HE病理改變一致,提示Cin可能通過下調(diào)OPN表達水平來減少炎癥因子釋放和恢復骨代謝的平衡改善Ⅱ型膠原誘導的大鼠關(guān)節(jié)炎。同時實驗發(fā)現(xiàn)高劑量組關(guān)節(jié)炎的緩解和OPN及炎癥因子的表達下調(diào)均較低劑量組更顯著,表明較高劑量Cin對RA可能具有更強的治療作用。因此,本研究未來將進一步探索Cin治療RA的更佳適用劑量,OPN在RA發(fā)生發(fā)展中起重要作用,未來需深入探索其在RA發(fā)病機制中的作用以及能否成為一種新的RA治療靶點。Cin可能為RA患者帶來更多治療選擇。但尚需進一步大樣本量動物試驗及臨床試驗予以證實。

4 結(jié)論

桂皮醛可改善大鼠II型膠原誘導性關(guān)節(jié)炎誘發(fā)的炎癥反應和關(guān)節(jié)損傷,其作用可能與下調(diào)OPN表達水平、降低IL-6、IL-17和TNF-α等炎癥因子水平、減輕骨與軟骨的破壞有關(guān)。