張心愿,王輝,陳向東,李沖偉*

(1.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150080;2.黑龍江省寶泉嶺農(nóng)墾寶泉醬業(yè)有限公司,黑龍江 鶴崗 154211)

醬油是我們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｊ秤玫膫鹘y(tǒng)調(diào)味品之一,其在我國(guó)已有幾千年的歷史[1],“蕪荑鹽豉醯(xī)酢(cù)醬”出現(xiàn)于西漢時(shí)期史游編著的《急就篇》,是我國(guó)歷史上以大豆為原料制醬的最早記載[2]。在東漢時(shí)期,王充在《論衡》中寫(xiě)到:“世諱作豆醬惡聞雷”,從側(cè)面闡明了當(dāng)時(shí)人們對(duì)豆醬制作工藝已無(wú)比熟悉的事實(shí)[3]。醬油是將蛋白質(zhì)原料與淀粉質(zhì)原料混合,然后經(jīng)過(guò)微生物的分解及催化作用,原料被水解成短肽、氨基酸、還原糖和有機(jī)酸等小分子化合物,以這些小分子化合物為基礎(chǔ)發(fā)生一系列復(fù)合反應(yīng),形成色、香、味、形俱全的調(diào)味液[4-6]。醬油中富含礦物質(zhì)、維生素及生理活性物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)豐富,具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、促進(jìn)消化、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗腫瘤及殺菌等保健作用[7]。近年來(lái),隨著大健康時(shí)代的到來(lái),人們的生活水平提高,消費(fèi)者對(duì)醬油品質(zhì)有了更高的要求,減鹽發(fā)酵醬油、有機(jī)醬油、大蒜醬油及元素強(qiáng)化醬油應(yīng)運(yùn)而生,這些醬油得到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。

紫蘇因可以在食品中起到去腥、增味等效果,常被用作調(diào)味品[8]。紫蘇的藥用價(jià)值在《本草綱目》等諸多醫(yī)學(xué)論著中均有相關(guān)詳細(xì)記載[9]。紫蘇中含有的多種生物活性物質(zhì)(如揮發(fā)油類、酚酸化合物、多糖類等)具有鎮(zhèn)靜、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等功效[10-15],同時(shí)具有抗抑郁、免疫調(diào)節(jié)和保肝、護(hù)肝[16-18]等重要的生理功能。

紫蘇能夠榨油[19],也可入藥,是我國(guó)最早的藥食兩用植物之一[20]。目前,科學(xué)家們對(duì)紫蘇的研究主要集中在利用價(jià)值較高的紫蘇油上,而脫脂后的紫蘇餅粕含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白,長(zhǎng)期以來(lái)都沒(méi)有被很好地利用[21-23]。作為一種新興的植物蛋白資源,田海娟等[24]對(duì)紫蘇粕進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)紫蘇餅粕發(fā)酵能顯著提高粗蛋白的含量,蛋白質(zhì)可被有效降解,從而提高了其可消化蛋白的含量。朱艷等[25]通過(guò)建立小鼠模型探究紫蘇籽粕蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用,研究發(fā)現(xiàn),紫蘇籽粕蛋白可遏制環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官衰退,提高固有免疫中相關(guān)免疫細(xì)胞的功能,表明紫蘇籽粕蛋白可發(fā)揮較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。Hana等[26]以紫蘇餅粕為原料,提取得到不皂化物(USM),發(fā)現(xiàn)USM可以顯著降低紫外線誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧數(shù)量,緩解紫外線引起的皮膚損傷。尹賀[27]對(duì)紫蘇籽粕中含有的多糖進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)紫蘇粕多糖可提高小鼠免疫活性物質(zhì)的表達(dá),間接抑制腫瘤生長(zhǎng),具有一定的抗腫瘤功效。劉子坤[28]從紫蘇粕中提取紫蘇粕多糖,并通過(guò)對(duì)紫蘇多糖硫酸化修飾進(jìn)一步驗(yàn)證了紫蘇粕多糖具有較好的抗腫瘤和抗氧化作用。

由于紫蘇粕價(jià)格低廉,且含有豐富的蛋白質(zhì),可以作為一種蛋白質(zhì)原料替代黃豆,不僅可以增加醬油的營(yíng)養(yǎng)成分和醬油產(chǎn)品的功能性,而且可以提高紫蘇粕的利用效率,提高紫蘇產(chǎn)品的附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫蘇粕:由黑龍江大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供;黃豆、面粉、食鹽、白砂糖、小蘇打:均購(gòu)自黑龍江大學(xué)中央紅超市。

試驗(yàn)菌種:米曲霉As3.042(AspergillusoryzaeHuniang 3.042)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),均由黑龍江大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

甲醛(分析純):遼寧泉瑞試劑有限公司;氫氧化鈉、硼酸、硫酸、碳酸氫鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀、氧化鎂(均為分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

DK-420S恒溫水浴鍋、DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;MLS-3781-PC高壓蒸汽滅菌鍋、JA5003分析天平 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;PHS-3C酸度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;DF-101T集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 醬油生產(chǎn)工藝

黃豆經(jīng)過(guò)挑揀清洗后,使用0.2%的碳酸氫鈉浸泡4 h,高溫(121 ℃)蒸煮20 min,面粉熟制75 ℃烘干20 min,黃豆與面粉的質(zhì)量比為8∶2(試驗(yàn)組添加紫蘇粕來(lái)代替部分黃豆),將面粉、黃豆、紫蘇粕混合均勻,加入0.3%米曲霉,置于恒溫培養(yǎng)箱中,在制曲過(guò)程中適當(dāng)噴灑補(bǔ)加蒸餾水,保證曲料水分較恒定,有利于米曲霉的生長(zhǎng)繁殖,培養(yǎng)溫度30 ℃,培養(yǎng)1～2 d后,曲面長(zhǎng)出黃綠色的曲毛(長(zhǎng)度為1～2 mm)。將成曲和一定濃度的鹽水倒入發(fā)酵瓶后放入培養(yǎng)箱中發(fā)酵,溫度為42～45 ℃,每日攪拌2次(時(shí)間間隔為12 h),發(fā)酵7 d后,將發(fā)酵溫度降到32～34 ℃,繼續(xù)發(fā)酵23 d,經(jīng)過(guò)3次不同溫度淋油后進(jìn)行滅菌包裝。紫蘇醬油生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖1。

圖1 紫蘇醬油生產(chǎn)工藝Fig.1 Production process of perilla soy sauce

1.4.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)方法,分別將紫蘇粕替代量(0%、10%、20%、30%、40%)、鹽水濃度(9%、10%、11%、12%、13%)及酵母添加量(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%)3個(gè)因素作為變量,每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平,按照生產(chǎn)工藝制曲及發(fā)酵,考察不同因素對(duì)紫蘇醬油樣品中氨基酸態(tài)氮含量的影響,每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)重復(fù),結(jié)果取數(shù)據(jù)平均值。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量的較優(yōu)選擇區(qū)間,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),其因素與水平見(jiàn)表1。通過(guò)測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量,得到最佳工藝配方及用量。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4.4 醬油總酸含量的測(cè)定

總酸是指食品中所有酸性成分的總量,對(duì)總酸含量進(jìn)行測(cè)定,可以對(duì)比食品的風(fēng)味,確定食品的穩(wěn)定性,避免腐敗等。醬油中總酸含量的測(cè)定參考GB 12456—2021中的方法[29]。

1.4.5 總氮含量的測(cè)定

食品中總氮含量的測(cè)定主要用于監(jiān)測(cè)食品安全,防止不良食品流入市場(chǎng)。醬油中總氮含量的測(cè)定參考GB 18186—2000中的方法[30]。

1.4.6 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮是以氨基酸形式存在的氮元素含量。醬油中的氨基酸態(tài)氮主要來(lái)源于原料的蛋白質(zhì)經(jīng)微生物代謝分泌產(chǎn)生的蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶等多酶系作用生成的各種氨基酸,是醬油產(chǎn)品主要的鮮味物質(zhì)。醬油中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定參考GB 5009.235—2016中的方法[31]。

1.4.7 固形物含量的測(cè)定

醬油中固形物含量表明醬油中糖類、有機(jī)酸和氨基酸等含量的多少,是判斷醬油質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。醬油中固形物含量的測(cè)定參考GB 18186—2000中的方法[30]。

1.4.8 銨鹽含量的測(cè)定

銨鹽是醬油中存在的非營(yíng)養(yǎng)成分,體內(nèi)過(guò)高的銨鹽在一定條件下可對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用,影響肝、腎功能,降低銨鹽含量對(duì)于提升醬油風(fēng)味具有重要意義。醬油中銨鹽含量的測(cè)定參考GB 5009.234—2016中的方法[32]。

1.4.9 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)采用暗碼品評(píng)方式進(jìn)行,對(duì)10名品評(píng)人員的評(píng)分進(jìn)行匯總,計(jì)算同一樣品的平均得分,以分值的高低來(lái)評(píng)價(jià)醬油的質(zhì)量。按色澤、香氣、滋味和體態(tài)分別占不同分值權(quán)重對(duì)所有樣品進(jìn)行評(píng)分。醬油評(píng)分項(xiàng)目權(quán)重分配及感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 醬油評(píng)分項(xiàng)目權(quán)重分配及感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Weight distribution of soy sauce scoring items and sensory scoring standards

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紫蘇粕替代量的確定

不同紫蘇粕替代量對(duì)醬油中氨基酸態(tài)氮的影響見(jiàn)圖2。

圖2 紫蘇粕替代量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of perilla meal replacement amount on amino acid nitrogen content

由圖2可知,隨著紫蘇粕替代量的增加,氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),紫蘇粕替代量為30%時(shí),醬油中氨基酸態(tài)氮含量最高,達(dá)到0.701 g/100 g,與對(duì)照組相比,提高了11.5%。適量加入紫蘇粕可以提高醬油中氨基酸態(tài)氮含量,但過(guò)量加入紫蘇粕,醬油中氨基酸態(tài)氮含量降低,因此,最佳紫蘇粕替代量為30%。

2.1.2 鹽水濃度的確定

不同鹽水濃度對(duì)醬油中氨基酸態(tài)氮的影響見(jiàn)圖3。

圖3 鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of brine concentration on amino acid nitrogen content

由圖3可知,鹽水濃度為11%時(shí),醬油中氨基酸態(tài)氮含量最大,達(dá)到0.667 g/100 g,鹽水濃度大于11%時(shí),醬油中氨基酸態(tài)氮含量開(kāi)始降低,因此,最佳鹽水濃度為11%。

2.1.3 酵母添加量的確定

不同酵母添加量對(duì)醬油中氨基酸態(tài)氮的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酵母添加量對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of yeast addition amount on amino acid nitrogen content

由圖4可知,酵母添加量為0.5%時(shí),醬油中氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大,為0.673 g/100 g,酵母添加量大于0.5%時(shí),醬油中氨基酸態(tài)氮含量開(kāi)始降低,因此,最佳酵母添加量為0.5%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)是根據(jù)Box-Behnken原理進(jìn)行設(shè)計(jì),以紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量3個(gè)因素為自變量,以醬油中的氨基酸態(tài)氮含量為響應(yīng)值,試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 Table 3 Design scheme and results of response surface optimization process test

使用Design Expert 8.0.6軟件,通過(guò)其中Box-Behnken Design模型處理表3中數(shù)據(jù),二次響應(yīng)面回歸擬合得到醬油中氨基酸態(tài)氮含量(Y)對(duì)紫蘇粕替代量(A)、鹽水濃度(B)和酵母添加量(C)因素之間的回歸方程:Y=-8.341 40+0.016 948A+1.512 22B+1.254 71C-0.258AB+0.002 405AC+0.084 275BC-0.000 244A2-0.069 338B2-2.131 55C2。

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件得到表4和圖5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model of response surface test

圖5 功率變換的Box-Cox圖(a)、氨基酸態(tài)氮的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值(b)、氨基酸態(tài)氮的有效參數(shù)順序(c)Fig.5 Box-Cox diagram of power conversion (a),actual and predicted values of amino acid nitrogen (b),effective parameter order of amino acid nitrogen (c)

由表4可知,模型極顯著(P<0.000 1),說(shuō)明醬油中氨基酸態(tài)氮含量與紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量的關(guān)系顯著;失擬項(xiàng)的P值為0.391 9>0.05,不顯著,說(shuō)明構(gòu)建的回歸模型成功,不失擬;離散系數(shù)為1.43%,說(shuō)明試驗(yàn)的精確度高且可靠性強(qiáng);紫蘇醬油釀造工藝相關(guān)系數(shù)R2=0.981 7,說(shuō)明該模型試驗(yàn)誤差小,調(diào)整系數(shù)RAdj2=0.958 1,說(shuō)明該模型能夠解釋95.81%響應(yīng)值的變化;信噪比=17.501>4,說(shuō)明該模型適用于紫蘇醬油釀造工藝試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

結(jié)果表明,響應(yīng)面分析法能很好地描述試驗(yàn)數(shù)據(jù)。根據(jù)表4和圖5中c,比較F值,FA=3.90,FB=42.04,FC=14.03,說(shuō)明各因素對(duì)醬油品質(zhì)的影響程度存在差異,按照影響程度大小排序?yàn)辂}水濃度(B)>酵母添加量(C)>紫蘇粕替代量(A)。根據(jù)顯著性結(jié)果可知,回歸方程一次項(xiàng)B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果的影響極顯著(P<0.01),其他因素對(duì)結(jié)果的影響均不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面各因素間的交互作用

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件,根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù),作出響應(yīng)面分析圖,從而分析紫蘇粕替代量、鹽水濃度和酵母添加量的交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響。

由圖6可知,當(dāng)酵母添加量一定時(shí),隨著鹽水濃度的增加,氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降,且曲面陡峭,鹽水濃度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響較大;等高線呈橢圓形,表明紫蘇粕替代量和鹽水濃度之間的交互作用極顯著。

圖6 紫蘇粕替代量與鹽水濃度的交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface diagram and contour line of the effect of interaction of replacement amount of perilla meal and brine concentration on amino acid nitrogen content

由圖7可知,當(dāng)鹽水濃度一定時(shí),隨著酵母添加量和紫蘇粕替代量的增加,氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降,曲面相對(duì)平緩,等高線比較接近于圓形,說(shuō)明紫蘇粕替代量和酵母添加量之間的交互作用不顯著。

由圖8可知,當(dāng)紫蘇粕替代量一定時(shí),隨著酵母添加量和鹽水濃度的增加,氨基酸態(tài)氮含量先上升后下降,曲面較陡峭,等高線比較接近于橢圓,說(shuō)明鹽水濃度和酵母添加量之間的交互作用顯著。

圖8 鹽水濃度與酵母添加量的交互作用對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface diagram and contour line of the effect of interaction of brine concentration and yeast addition amount on amino acid nitrogen content

2.3 紫蘇醬油理化指標(biāo)

測(cè)定了試驗(yàn)組紫蘇醬油和對(duì)照組大豆醬油的總酸、總氮、氨基酸態(tài)氮、可溶性固形物和銨鹽含量,結(jié)果見(jiàn)表5,醬油感官評(píng)定得分表見(jiàn)表6。

表6 醬油感官評(píng)定得分表Table 6 Sensory evaluation scores of soy sauce

由表5和表6可知,試驗(yàn)組總分高于對(duì)照組,色澤更深,香氣與滋味更好,體態(tài)略差。紫蘇醬油的色澤與香氣均可達(dá)到一級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn),滋味達(dá)到二級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn),體態(tài)澄清,感官評(píng)定特性整體上已達(dá)到二級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)。

將4個(gè)因素的評(píng)分分別進(jìn)行百分制化,作出感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖,見(jiàn)圖9。

圖9 醬油感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.9 Radar chart of soy sauce sensory evaluation

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了紫蘇醬油的最優(yōu)工藝區(qū)間, 應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化,得到最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件:紫蘇粕替代量31%、鹽水濃度11%和酵母添加量0.5%。在該條件下,紫蘇醬油的總氮含量為1.42 g/dL,氨基酸態(tài)氮含量為0.708 g/100 g,達(dá)到國(guó)家一級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn);可溶性固形物含量為16.20 g/dL,銨鹽含量為0.327 g/dL,總酸含量為1.875 g/100 g,均達(dá)到了國(guó)家二級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)。

紫蘇醬油相較于普通黃豆醬油,其色澤更深,香氣與滋味更好,體態(tài)良好,綜合評(píng)價(jià)比普通黃豆醬油好,感官特性整體上達(dá)到二級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)。從營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味方面綜合評(píng)價(jià),其品質(zhì)介于一級(jí)與二級(jí)醬油之間,與普通黃豆醬油相比,紫蘇醬油品質(zhì)更好,證明以紫蘇替代部分黃豆制作醬油是可行的。