楊雅婧,徐琳,楊須躍,楊須強(qiáng),王超,陳振家*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西 晉中 030801;2.江蘇香道食品有限公司,江蘇 徐州 221600)

雞蛋是一種具有獨(dú)特成分的高營(yíng)養(yǎng)食品,在人類(lèi)飲食中發(fā)揮著重要作用,根據(jù)1973年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WTO)提出的氨基酸模式,雞蛋屬于理想蛋白質(zhì)的范疇,構(gòu)成雞蛋蛋白質(zhì)的必需氨基酸的比例與人體接近,有“完全蛋白質(zhì)模式”的稱(chēng)號(hào)[1]。雞蛋不僅是人體營(yíng)養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源,而且是食品加工中具有優(yōu)良功能特性的重要食品成分,蛋清中含有多種蛋白質(zhì),包括卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶等[2]。這些蛋白具有多樣的理化性質(zhì)和生物活性,極大地豐富了蛋清的應(yīng)用,熱誘導(dǎo)形成凝膠是蛋清的重要應(yīng)用之一,且在蛋類(lèi)產(chǎn)品的流變和質(zhì)構(gòu)特性方面起著關(guān)鍵作用[3]。

雞蛋蛋清的凝膠過(guò)程可以分為兩步:第一步是蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化或者部分變性;第二步是變性蛋白質(zhì)的進(jìn)一步聚集進(jìn)而形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在加熱時(shí)被破壞,會(huì)通過(guò)暴露其內(nèi)部疏水區(qū)域轉(zhuǎn)化為變性形式,凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成是變性后的蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵和共價(jià)鍵的共同作用,致使多肽的未折疊鏈有序聚集[5]。

為明確不同加熱溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠的影響,將蛋清于不同溫度(80,90,100 ℃)下加熱20 min,測(cè)定凝膠的質(zhì)構(gòu)特性、可溶性蛋白含量、微觀(guān)結(jié)構(gòu)等,研究加熱溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠的影響,為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋:購(gòu)自市場(chǎng),于4 ℃保存,于1周內(nèi)使用完畢。

1.2 試劑

十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、牛血清蛋白、低分子量蛋白質(zhì)Marker:北京索萊寶科技有限公司;甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)G-250:生工生物工程(上海)股份有限公司;二硫代二硝基苯甲酸:阿拉丁試劑有限公司。以上所用試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;大容量低速離心機(jī)、HC-2064高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;TMS-Pro質(zhì)構(gòu)儀 Food Technology Corporation;Scienntz-19N冷凍干燥機(jī)、DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)尼高力儀器公司;JSM-7500F冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社(JEOL);MCR102流變儀、DSC 3差示掃描量熱儀 梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-1100分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Malvern Zetasizer Nano ZS90電位分析儀 英國(guó)馬爾文公司。

1.4 方法

1.4.1 蛋清蛋白凝膠樣品的制備

選取新鮮無(wú)損壞的雞蛋,分離蛋清、蛋黃,于上下直徑分別為3,4 cm、高2.5 cm的模具中注入約25 mL蛋清液,于80,90,100 ℃下分別加熱10,20,30 min后,用自來(lái)水冷卻10 min至室溫,置于4 ℃冰箱中冷藏過(guò)夜后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.2 質(zhì)構(gòu)特性

樣品在模具中進(jìn)行測(cè)定[6],采用P-0.5探頭,設(shè)置探頭回升到樣品表面的高度為30 mm,擠壓距離12 mm,測(cè)試速度60 mm/s,起始力0.1 N,兩次壓縮之間停隔5 s,測(cè)試后速度100 mm/s,重復(fù)試驗(yàn)10次。

1.4.3 持水力(WHC)

采用離心法[7]測(cè)定蛋清蛋白凝膠的持水力。將蛋清蛋白凝膠切成大小均一的形狀,準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g,將其放入鋪有一層濾紙的50 mL離心管中,于離心機(jī)中以3 000 r/min離心15 min,稱(chēng)重,按照以下公式計(jì)算蛋清蛋白凝膠的持水力:

式中:W1為離心管和離心除水后的凝膠質(zhì)量(g),W2為離心前離心管和凝膠質(zhì)量(g),W為離心管質(zhì)量(g)。每個(gè)處理有2個(gè)重復(fù),3個(gè)平行。

1.4.4 可溶性蛋白含量

將蛋清凝膠研磨均勻,稀釋后攪拌10 min至溶解,離心,取上清液,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中可溶性蛋白含量,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算可溶性蛋白含量。

1.4.5 SDS-PAGE

參考Lars等[8]的方法,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%,上樣量為6 μL。

1.4.6 凝膠作用力

參考Gómez-Guillén等[9]的方法并略作修改,通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.4.7 總巰基含量

取蛋清蛋白凝膠1 g溶于50 mL磷酸鈉緩沖溶液中(含8 mol/L尿素),室溫混合攪拌60 min后以10 000 r/min離心15 min,取0.5 mL上清液加入到5 mL緩沖液中,同時(shí)加入0.1 mL DTNB試劑,混合均勻后室溫放置15 min,在412 nm處測(cè)量吸光度。根據(jù)半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總巰基含量。

1.4.8 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉紅外光譜測(cè)定采用KBr壓片法[10],準(zhǔn)確稱(chēng)取冷凍干燥后的樣品3 mg,加入KBr 300 mg,充分研磨后進(jìn)行壓片處理,在室溫條件下進(jìn)行,掃描波數(shù)譜段設(shè)定為400～4 000 cm-1,設(shè)定分辨率為4 cm-1,掃描32次,重復(fù)3次。利用PeakFit Version軟件處理譜圖。

1.4.9 掃描電鏡分析

將制備的蛋清蛋白凝膠樣品冷凍干燥,干燥后的樣品用導(dǎo)電雙面膠固定到樣品臺(tái)上,經(jīng)濺射儀噴金后,置于掃描電鏡下觀(guān)察。

1.4.10 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并進(jìn)行繪圖,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析,Duncan進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)構(gòu)特性

由表1可知,不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性造成了影響,在煮制過(guò)程中,隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng),蛋清蛋白凝膠的硬度、膠黏性和咀嚼性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì),而黏附性、內(nèi)聚性和彈性的變化無(wú)顯著性差異,硬度在90 ℃ 20 min時(shí)達(dá)到最大值,而后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這是因?yàn)榧訜岢跗诘鞍踪|(zhì)未達(dá)到變性,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),蛋清的變性程度增大,但當(dāng)加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),已經(jīng)凝結(jié)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)易分解為小分子的氨基酸,進(jìn)而降低了凝膠強(qiáng)度,與何立超等探究的不同加熱時(shí)間對(duì)雞蛋蛋白質(zhì)特性的研究結(jié)果一致[11]。

表1 蛋清蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性Table 1 Texture characteristics of egg white protein gel

在煮制過(guò)程中,黏附性、內(nèi)聚性和彈性的變化無(wú)顯著性差異,對(duì)于彈性指標(biāo),100 ℃加熱20,30 min與其他組的差異顯著,說(shuō)明相較于加熱時(shí)間,加熱溫度對(duì)蛋清蛋白凝膠的影響更大,這與李俐鑫等[12]的研究結(jié)果相一致。

蛋清蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性主要與蛋白質(zhì)含量、蛋白變性凝膠及降解程度有關(guān),在蛋白質(zhì)還未達(dá)到完全變性時(shí),隨著煮制溫度的升高和煮制時(shí)間的延長(zhǎng),蛋清的變性程度加大,剛性增加,造成硬度、咀嚼性和膠黏性增加;但是當(dāng)在90 ℃下加熱20 min時(shí),繼續(xù)煮制,蛋白的硬度降低,這可能是因?yàn)榈扒宓鞍字械穆亚宓鞍缀吐艳D(zhuǎn)鐵蛋白二者對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成起主要作用,其中卵清蛋白的熱變性溫度為84 ℃[13]。隨著凝膠溫度的升高,蛋清凝膠的形成速度加快,低溫時(shí)蛋清蛋白溶液中的部分氣體會(huì)在凝膠完全成型前逸出,而高溫時(shí),由于凝膠迅速形成不利于氣體的逸出,從而在凝膠體內(nèi)形成氣孔,降低了凝膠的硬度[14]。

2.2 持水力

持水力是熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)凝膠的一個(gè)重要特征,它反映了蛋白質(zhì)與水相互作用的狀態(tài)[15]。由圖1可知,在80 ℃和90 ℃加熱時(shí),隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),持水力下降,同時(shí)間下90 ℃的凝膠持水力小于80 ℃的持水力;100 ℃加熱時(shí),隨著時(shí)間的增加,凝膠的持水力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),100 ℃ 20 min時(shí)的持水力最差,可能是由于在此條件下凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更疏松,對(duì)水的束縛力變小。

圖1 加熱溫度和時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠持水力的影響Fig.1 Effect of heating temperature and time on water holding capacity of egg white protein gel

持續(xù)加熱導(dǎo)致凝膠的結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,重排的過(guò)程中伴隨著變性程度和疏水作用的增強(qiáng),凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中部分可溶性蛋白會(huì)繼續(xù)參與凝膠鏈狀結(jié)構(gòu)的形成,同時(shí)鏈與鏈之間也會(huì)彼此靠近,從而壓縮凝膠的三維空間,可溶性蛋白的減少降低了對(duì)水分的化學(xué)束縛,而空間的壓縮降低了水分的物理束縛,最終導(dǎo)致凝膠持水力的下降[16]。

2.3 可溶性蛋白含量和

SDS-PAGE蛋清蛋白的熱誘導(dǎo)變性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,可溶性蛋白質(zhì)含量在一定程度上反映了蛋白質(zhì)在凝膠中的參與程度,一般而言,凝膠中的可溶性蛋白含量越低,參與蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)越多[17]。由圖2可知,蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白含量隨著溫度的升高先降低后升高,在90 ℃溫度下凝膠可溶性蛋白含量最小,這可能是導(dǎo)致蛋清在90 ℃時(shí)凝膠硬度最大的原因。

圖2 加熱溫度和時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of heating temperature and time on soluble protein content of egg white protein gel

由圖3可知,凝膠可溶性蛋白非還原電泳圖譜的部分電泳條帶在還原電泳圖譜中消失,這是加入β-巰基乙醇后打斷二硫鍵所致,表明蛋清凝膠中大部分可溶性蛋白含有二硫鍵。80 ℃時(shí)蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白電泳圖譜與90 ℃和100 ℃時(shí)有較大區(qū)別,表明80 ℃時(shí)蛋清凝膠形成過(guò)程中蛋白參與方式有別于90 ℃和100 ℃時(shí)。其中,還原電泳圖譜中80 ℃時(shí)蛋清蛋白凝膠可溶性蛋白含有較少的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,而含有較多的卵清蛋白,說(shuō)明相比90 ℃和100 ℃,蛋清在80 ℃條件下,卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的參與數(shù)量較多而卵清蛋白的參與數(shù)量較少。

圖3 蛋清蛋白凝膠上清液亞基分布Fig.3 Subunit distribution of egg white protein gel supernatant

結(jié)合圖2推測(cè),隨著溫度升高,卵清蛋白參與蛋清蛋白凝膠的數(shù)量有增加的趨勢(shì)。在90 ℃和100 ℃條件下,凝膠可溶性蛋白與電泳圖譜相似,說(shuō)明蛋清凝膠形成過(guò)程中蛋白參與方式相似,而參與數(shù)量不同。根據(jù)Donovan等[18]的研究報(bào)道,卵清蛋白的變性溫度為84 ℃,因此80 ℃條件下未完全發(fā)生變性,這可能是其未能形成較多參與凝膠的原因,而隨著溫度的增加,變性后的卵清蛋白更多地參與凝膠形成,所以其可溶性蛋白含量減少,在100 ℃條件下凝膠形成過(guò)程中可能升溫較快驅(qū)使蛋白聚集的疏水作用快速增加,造成有序凝膠鏈狀結(jié)構(gòu)的形成不充分,致使部分蛋白未能參與凝膠形成而保持可溶狀態(tài),造成100 ℃條件下凝膠可溶性蛋白含量高于90 ℃時(shí);也可能是已形成凝膠結(jié)構(gòu)在高溫下部分鏈狀結(jié)構(gòu)解離重排形成簇狀或團(tuán)狀聚集體,從而導(dǎo)致可溶性蛋白增加。

2.4 凝膠作用力

蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成是蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)、水分子平衡的結(jié)果,一般認(rèn)為,疏水作用、氫鍵、離子鍵和二硫鍵是凝膠形成和維持的主要作用力[19]。由圖4可知,蛋清凝膠作用力中疏水作用和二硫鍵占比最大,占80%以上,隨著溫度的升高,疏水作用比例呈上升趨勢(shì),二硫鍵含量所占比例明顯下降。

圖4 加熱溫度和時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.4 Effect of heating temperature and time on chemical force of egg white protein gel

凝膠形成初期,二硫鍵的交聯(lián)會(huì)增加蛋白質(zhì)分子的平均分子量,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)凝膠的形成并增強(qiáng)其凝膠強(qiáng)度,隨著加熱溫度的升高,凝膠逐漸形成,二硫鍵的比例下降;離子鍵作為一種很強(qiáng)的化學(xué)鍵,在90 ℃ 20 min下的比例最高,在100 ℃ 20 min時(shí)所占比例最低,推測(cè)可能與蛋白質(zhì)分子聚合高溫脅迫有關(guān)[20]。

2.5 總巰基含量

巰基是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的主要鍵,作為蛋白質(zhì)分子中最活躍的官能團(tuán),加熱能夠促進(jìn)巰基和二硫鍵的相互轉(zhuǎn)化,暴露蛋白質(zhì)分子內(nèi)部隱藏的巰基、二硫鍵和疏水基團(tuán),從而增強(qiáng)分子間的相互作用,為凝膠的形成提供驅(qū)動(dòng)力[21]。

由圖5可知,隨著溫度的升高,總巰基含量逐漸下降,這是巰基氧化或巰基之間重新結(jié)合形成二硫鍵導(dǎo)致的。加熱可以打斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵,使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹€基,而巰基含量的降低,推測(cè)其原因一方面是蛋清蛋白的重新聚集[22],另一方面是加熱溫度過(guò)高,氧化已經(jīng)暴露的游離巰基,從而引起其含量的下降[23]。

圖5 加熱溫度和時(shí)間對(duì)蛋清蛋白凝膠總巰基含量的影響Fig.5 Effect of heating temperature and time on total sulfhydryl content of egg white protein gel

2.6 傅里葉變換紅外光譜

由表2可知,β-折疊的相對(duì)含量在90 ℃ 20 min條件下最大,在80 ℃ 20 min條件下最小;無(wú)規(guī)則卷曲的相對(duì)含量差異不顯著;蛋清的β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量最大,在90 ℃ 20 min條件下最小;α-螺旋的相對(duì)含量在90 ℃加熱20 min后的變化不顯著,這表明高溫影響了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象,加熱溫度90 ℃和時(shí)間20 min后凝膠結(jié)構(gòu)更緊密。

表2 加熱溫度對(duì)蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of heating temperature on secondary structure of egg white protein

2.7 掃描電鏡分析

通過(guò)掃描電鏡可以觀(guān)察到樣品的微觀(guān)結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖6),包括三維結(jié)構(gòu)、空間排列和凝膠鏈狀分布等[25]。80 ℃加熱形成的蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為規(guī)則,凝膠鏈較細(xì),但孔徑不均勻,結(jié)構(gòu)不完整,表明在80 ℃條件下部分蛋清還未變性,凝膠作用力中疏水作用不占主導(dǎo)而使凝膠驅(qū)動(dòng)力不足,結(jié)構(gòu)形成尚不充分;90 ℃加熱20 min的蛋清蛋白凝膠呈現(xiàn)的凝膠結(jié)構(gòu)完整,孔隙均勻,凝膠鏈形成有序,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成充分,這充分說(shuō)明90 ℃條件下蛋清蛋白變性充分,此時(shí)疏水作用和靜電斥力適當(dāng)平衡,為建立凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有序形成創(chuàng)造了有利的條件;100 ℃加熱20 min時(shí),凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密,孔隙不均勻,部分區(qū)域出現(xiàn)了聚結(jié)現(xiàn)象,這表明100 ℃條件下高溫增強(qiáng)了變性蛋白的疏水作用,以致于未能形成有序凝膠結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)而形成無(wú)序簇狀結(jié)構(gòu),此外,已形成凝膠鏈狀結(jié)構(gòu)在長(zhǎng)時(shí)間高溫條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,部分有序可溶凝膠鏈聚結(jié)成團(tuán),進(jìn)一步導(dǎo)致凝膠形成無(wú)序化。

圖6 不同加熱溫度蛋清蛋白凝膠掃描電鏡圖Fig.6 SEM images of egg white protein gel at different heating temperatures

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同加熱溫度和加熱時(shí)間的蛋清蛋白的凝膠特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),加熱溫度和加熱時(shí)間均對(duì)凝膠產(chǎn)生影響,隨著加熱溫度的升高或者加熱時(shí)間的延長(zhǎng),蛋清的變性程度均增大,但是加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng),反而會(huì)降低凝膠強(qiáng)度。隨著加熱時(shí)間和加熱溫度的增加,蛋清蛋白凝膠的硬度、膠黏性和咀嚼性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì),在90 ℃ 20 min時(shí)達(dá)到最大值,而黏附性、內(nèi)聚性和彈性的變化無(wú)顯著性差異,高溫使二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;可溶性蛋白含量在90 ℃ 20 min時(shí)最小,表明此時(shí)較多的蛋白質(zhì)參與了凝膠的形成,90 ℃時(shí)蛋清蛋白充分變性,疏水作用適當(dāng)平衡,為建立凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有序形成創(chuàng)造了有利的條件。