徐文靜，梁建榮，曲萌菲，王藝璇，侯冰娜，趙琳琳，張杭*，李征征，3*

（1 天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457；2 天津理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3 復(fù)旦大學(xué) 聚合物分子工程國家重點實驗室，上海 200433）

水凝膠是由親水聚合物制成的交聯(lián)聚合物網(wǎng)絡(luò)，能夠吸收并保留高含量的水，同時保持其三維結(jié)構(gòu)完整性［1-2］。傳統(tǒng)水凝膠材料在使用過程易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化或機(jī)械損傷，且損傷后性能大大降低，無法繼續(xù)滿足使用要求。自愈合水凝膠是指水凝膠體系承受外界應(yīng)力而被部分破壞后，能自發(fā)地或在一定外界刺激下恢復(fù)體系原有的部分力學(xué)性能和形態(tài)的一類水凝膠，是一類重要的新型耐久性材料，常通過物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)兩種策略制備［3-4］。然而某些自我修復(fù)過程需要在非生理條件下進(jìn)行刺激［5］，對細(xì)胞或組織可能造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。目前關(guān)于自愈合水凝膠的研究集中在自主修復(fù)上［6］，即在沒有任何外部刺激的情況下恢復(fù)其原始結(jié)構(gòu)和功能、延長使用壽命并提高安全性。

殼聚糖是一類具有良好的生物相容性和生物降解性的天然堿性多糖［7-8］。與殼聚糖相比，乙二醇?xì)ぞ厶牵℅C）是一種水溶性殼聚糖衍生物。GC 含有氨基（─NH2）和羧基（─COOH），使其易于進(jìn)行化學(xué)改性，因此研究人員在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如藥物傳遞載體、抗菌材料、基因傳遞系統(tǒng)和組織工程等領(lǐng)域?qū)C 進(jìn)行了大量研究［9-10］。Zhao 等［11］利用1，6-二異氰酸根合己烷和聚乙二醇形成交聯(lián)劑，以乙二醇?xì)ぞ厶牵℅C）為原料，制備一種能夠應(yīng)用于軟骨治療的殼聚糖水凝膠。將該殼聚糖水凝膠構(gòu)建的組織工程化軟骨移植到有缺陷的兔關(guān)節(jié)軟骨中，術(shù)后的形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，再生組織與正常組織緊密相連且邊界模糊，二者軟骨腔極為相似，達(dá)到修復(fù)缺損關(guān)節(jié)軟骨的目的。Huang 等［12］通過全原子模擬研究了由乙二醇?xì)ぞ厶牵℅C）和遙爪雙功能聚乙二醇（DF-PEG）合成的GC-DP 自愈合水凝膠用于遞送抗癌藥物吉西他濱。在不同藥物濃度下構(gòu)建了兩種藥物遞送系統(tǒng)的全原子模型，證實GCDP 水凝膠和吉西他濱之間的主要相互作用機(jī)制為范德華吸附，并確定不同濃度（10%，40%，80%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的GC-DP 水凝膠對吉西他濱表現(xiàn)出1.76×10-5～2.34×10-5cm2/s 的藥物擴(kuò)散速率。

海藻酸鈉（SA）具有良好的生物相容性和生物降解性，在藥物載體領(lǐng)域引起了關(guān)注［13］。SA 在一定條件下會被氧化引入醛基，從而增強(qiáng)自身的功能性。醛基（─CHO）和氨基（─NH2）之間形成的希夫堿鍵是一種動態(tài)共價鍵，在中性條件中，亞胺鍵可以不斷地斷裂與重組，快速達(dá)到化學(xué)平衡。侯冰娜等［14］利用羧甲基殼聚糖與氧化海藻酸鈉（OSA）為原料，通過席夫堿反應(yīng)形成動態(tài)亞胺交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使得水凝膠在損傷后6 h 內(nèi)完成自愈合。Qiao 等［15］采用二苯甲醛改性的聚乙二醇（PEG-CHO）交聯(lián)己二酸二肼改性的海藻酸鈉（ALG-ADH），在不破壞吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的前提下制備PEG-CHO/ALG-ADH 自愈合高強(qiáng)度水凝膠。當(dāng)交聯(lián)劑濃度為5%時，基于動態(tài)酰腙共價鍵和多重氫鍵的天然海藻酸鹽水凝膠的剪切模量可達(dá)0.234 MPa。

本工作以通過NaIO4為氧化劑制得的氧化海藻酸鈉（OSA）與乙二醇?xì)ぞ厶牵℅C）為原料，制備了一種基于亞胺鍵交聯(lián)的OSA-GC 自愈合水凝膠，并探究OSA 與GC 的質(zhì)量比對OSA-GC 自愈合水凝膠的微觀形貌、溶脹性能、降解速率等理化性質(zhì)的影響。此外，本研究以吉西他濱為模型藥物，考察了OSA-GC自愈合水凝膠的體外藥物釋放性能。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑

乙二醇?xì)ぞ厶琴徲诤凸庵扑幑I(yè)株式會社，純度為60%，聚合度＞400；吉西他濱，純度＞99%，購于上海阿拉丁生物科技有限公司；海藻酸鈉、高碘酸鈉均購于天津市大茂化學(xué)廠，分析純；乙二醇購于天津市晶鑫化學(xué)試劑廠，分析純；雞蛋清溶菌酶購于上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 OSA-GC 水凝膠的制備

在室溫避光條件下將2.0 g 海藻酸鈉和2.5 g 高碘酸鈉添加到200 mL 去離子水中。6 h后，添加5 mL乙二醇以中和過量高碘鹽。然后，將產(chǎn)物在透析管（MWCO，3500）中用蒸餾水滲析3天，經(jīng)FD-1型冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥后，得到白色絮狀的氧化海藻酸鈉（OSA）。

根據(jù)一定的質(zhì)量比移取GC 和OSA 于燒杯中，加入1 mL 去離子水，用TDZ4-WS 型磁力攪拌器，攪拌5～10 s，倒入圓柱形模具中后放置成型，制得OSAGC 水凝膠樣品。

1.3 測試與性能表征

1.3.1 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）

普通詞匯重復(fù)表達(dá)專門詞匯的已有之義也會導(dǎo)致一詞多譯,如“擔(dān)保責(zé)任”的一個譯名“guarantee liability”,從《元照英美法詞典》中查證得知“guarantee”一詞本身已經(jīng)含有“保證人的責(zé)任”的含義,“l(fā)iability”在此就顯得有些多余,降低了術(shù)語翻譯的簡潔性。

采用MAGNA560型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）對OSA，OSA-GC 進(jìn)行表征。樣品用KBr壓片，測試波數(shù)范圍為400～4000 cm－1，在4 cm－1分辨率下掃描32 次。

1.3.2 流變學(xué)測量

通過RS6000 旋轉(zhuǎn)流變儀測試OSA-GC 水凝膠的動態(tài)黏彈性。將厚度為1.0 mm 的水凝膠樣品放置于直徑為20 mm 旋轉(zhuǎn)流變儀的平行板之間，測試37 ℃時OSA-GC 水凝膠的儲能模量（G'）與損耗模量（G''）隨應(yīng)變（γ）的變化曲線，測試條件為頻率1 Hz；應(yīng)變1%。

1.3.3 微觀形貌

采用JSM-7000F 型場致發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察OSA-GC 水凝膠的微觀形貌。將冷凍干燥的樣品放入液氮中淬斷，進(jìn)行噴金處理，用場致掃描電子顯微鏡觀察OSA-GC 水凝膠樣品的微觀形貌。

1.3.4 自愈合性能

使用刀片將水凝膠（直徑20 mm，厚3 mm）切成兩段，分別用亞甲基藍(lán)和羅丹明B 染色。將水凝膠碎片重新組裝，并使其在沒有其他處理的情況下，在環(huán)境條件下自愈合2 h，然后進(jìn)行手動拉伸。將自愈合的OSA-GC 水凝膠浸入PBS 溶液（pH＝7.4）中以觀察水凝膠的完整狀態(tài)。

1.3.5 溶脹特征

式中：Wt和Wd分別表示在時間為t時，溶脹和干燥的水凝膠的質(zhì)量。

1.3.6 體外降解性能

將冷凍干燥的OSA-GC 水凝膠樣品使用分析天平稱重（M），浸于含有雞蛋清溶菌酶（10 mg/mL）的pH 值為7.4 的PBS 中培養(yǎng)，通過質(zhì)量變化來計算水凝膠的體外酶降解情況。在固定時間點取出OSA-GC水凝膠樣品，用去離子水沖洗后吸干表面水分，并冷凍干燥稱重（m），根據(jù)下式（2）計算水凝膠的質(zhì)量損失率Ma：

1.3.7 體外藥物釋放

以吉西他濱為藥物模型，采用Mini-1024 型紫外光-可見分光光度計測試OSA-GC 水凝膠對抗癌藥物吉西他濱的體外藥物釋放性能。將負(fù)載吉西他濱（0.01 %）的OSA-GC 水凝膠在低溫條件下溶于PBS溶液中。在5 mL 的試管中配制濃度為10 mg/mL 吉西他濱溶液。將OSA-GC 載藥水凝膠放置在裝有10 mL PBS 緩沖液的試管中，然后在37 ℃的水浴搖床中以60 r/min 的振蕩速度培養(yǎng)。在一定時間后，取出1 mL PBS，加入等量新鮮PBS 以補(bǔ)償釋放介質(zhì)。每個樣品測量3 次，取平均值進(jìn)行藥物釋放研究［16］。通過Mini-1024 型紫外光-可見分光光度計繪制關(guān)于釋放介質(zhì)中藥物濃度和累積釋放量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。累積的藥物釋放速率Ar可以通過式（3）計算［17］。

式中：V0為釋放介質(zhì)的總體積；ct是在某個時間點測量的吉西他濱在PBS 中的濃度；V是每次采集的PBS 體積；b是開始采集的次數(shù)；t是結(jié)束采集的次數(shù)；c是每次PBS 濃度的求和；m是OSA-GC 水凝膠的載藥量。

2 結(jié)果與分析

2.1 OSA 及OSA-GC 水凝膠的制備與表征

在室溫條件下，先將海藻酸鈉（SA）通過高碘酸鈉進(jìn)行氧化得到氧化海藻酸鈉（OSA），再以GC 與OSA為原料，通過GC 的氨基與OSA 的醛基進(jìn)行席夫堿反應(yīng)，得到以亞胺鍵交聯(lián)的OSA-GC 水凝膠，反應(yīng)式如圖1 所示。如表1 所示，通過改變OSA 與GC 的質(zhì)量比（3∶3，3∶4 及3∶5）調(diào)節(jié)OSA-GC 水凝膠體系中的亞胺鍵含量，從而調(diào)節(jié)OSA-GC 水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)。

圖1 OSA-GC 合成路線示意圖Fig.1 Synthetic route of OSA-GC hydrogels

通過1H NMR 和FT-IR 表征OSA 和OSA-GC 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。OSA 的核磁共振氫譜圖如圖2（a）所示，D2O 峰（δ=4.65）作為參考峰，δ=3.2～4.0 處的重疊峰是糖醛酸上H2～H5 的質(zhì)子峰。與SA 相比，δ=4.1～5.2 處的重疊峰是氧化糖醛酸上H6～H7 的質(zhì)子吸收峰，而δ=5.37 和δ=5.64 處是醛基與羥基結(jié)合形成的半縮醛的質(zhì)子吸收峰，表明成功制備了OSA。

OSA 和OSA-GC 的FT-IR 光譜如圖2（b）所示，與SA 譜圖相比，OSA 譜圖在1730 cm－1處出現(xiàn)了新的特征峰，為醛基的伸縮振動吸收峰，證實通過氧化反應(yīng)成功制備OSA。與GC 相比，OSA-GC 在1675 cm－1處出現(xiàn)了亞胺基的伸縮振動吸收峰，1425 cm－1處的氨基吸收峰減弱，而與OSA 相比，OSA-GC 在1735 cm－1處的醛基吸收峰消失，表明GC 分子鏈上的氨基與OSA 的醛基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，成功制備了OSAGC 水凝膠。

2.2 OSA-GC 水凝膠的微觀形貌

通過掃描電子顯微鏡觀察到OSA-GC 水凝膠微觀形貌。圖3 為不同配比的OSA-GC 水凝膠的SEM圖。OSA-GC 水凝膠具有孔隙之間相互連通的結(jié)構(gòu)特點。OSA-GC1，OSA-GC2 和OSA-GC3 水凝膠樣品的孔徑分別為150～280，120～210 μm 和50～120 μm。隨著GC 濃度的增加，OSA-GC 水凝膠體系中亞胺鍵的數(shù)量不斷增加，從而使得OSA-GC 水凝膠交聯(lián)密度增加，孔隙逐漸縮小，孔隙結(jié)構(gòu)更為致密。結(jié)果表明，通過改變OSA/GC 的質(zhì)量比能夠調(diào)節(jié)OSAGC 水凝膠的孔徑。OSA-GC 水凝膠在藥物釋放及組織工程領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

圖3 OSA-GC1（a），OSA-GC2（b）和OSA-GC3（c）水凝膠的SEM 圖Fig.3 SEM images of surface morphology of lyophilized OSA-GC1（a），OSA-GC2（b）and OSA-GC3（c）hydrogels

2.3 OSA-GC 水凝膠自愈合性能

圖4 展示了OSA-GC 水凝膠的自愈合性能。如圖4（a）所示，將使用亞甲基藍(lán)和羅丹明B 染料染色的兩部分OSA-GC 水凝膠放置在室溫條件下，OSA-GC水凝膠在無外界刺激時2 h 實現(xiàn)自愈合。如圖4（b）所示，兩部分OSA-GC 水凝膠被完全染色，并且當(dāng)手動拉伸修復(fù)的水凝膠時，OSA-GC 水凝膠不會從中間的拼接處分離。將自愈合的OSA-GC 水凝膠浸入PBS 溶液中后，未觀察到OSA-GC 水凝膠發(fā)生分離，其形態(tài)結(jié)構(gòu)仍保持完整狀態(tài)。實驗結(jié)果表明，OSA-GC 水凝膠能夠在無外界刺激2 h 實現(xiàn)自愈合，從而證明了亞胺鍵的動力學(xué)特性及OSA-GC 水凝膠的自愈合性能。

圖4 OSA-GC2 水凝膠的自愈合示意圖（a）羅丹明B 和亞甲基藍(lán)染色水凝膠；（b）2 h 后拉伸OSA-GC2 水凝膠；（c）將自愈合OSA-GC2 水凝膠浸入PBS 溶液中Fig.4 Self-healing schematic diagram of OSA-GC2 hydrogel（a）rhodamine B and methylene blue stained hydrogel；（b）stretched self-healing hydrogel after 2 h；（c）immersed self-healing hydrogel in PBS solution

2.4 OSA-GC 水凝膠的力學(xué)性能

通過流變學(xué)實驗研究了OSA-GC 自愈合水凝膠的力學(xué)性能。圖5 顯示了不同配比的OSA-GC 水凝膠的儲能模量（G'）和損耗模量（G''）隨應(yīng)變的變化曲線。在整個應(yīng)變范圍內(nèi)，OSA-GC 水凝膠的G'值大于G''值，表明OSA-GC 始終處于凝膠狀態(tài)。隨著GC 含量的增加，OSA-GC 水凝膠的G'值逐漸升高，OSAGC3 水凝膠的彈性明顯高于其他水凝膠，而這些水凝膠的G''相似，這是由OSA-GC 水凝膠的交聯(lián)密度所決定的。GC 濃度的增加使得體系中氨基與醛基形成的亞胺鍵數(shù)量增多，交聯(lián)密度增大，因此在OSA-GC水凝膠中形成了更具彈性的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明通過增加OSA-GC 水凝膠的交聯(lián)密度能夠增強(qiáng)OSAGC 水凝膠的力學(xué)性能。

圖5 OSA-GC 水凝膠的應(yīng)變依賴性流變行為Fig.5 Strain-dependent rheological behavior of OSA-GC hydrogel

2.5 OSA-GC 水凝膠的溶脹性能

OSA-GC 水凝膠的溶脹性能如圖6 所示。在37 ℃下，OSA-GC 水凝膠的溶脹率隨時間延長逐漸增加，并在120 h 達(dá)到溶脹平衡。OSA-GC 水凝膠的平衡溶脹率分別為112.1，89.2 和71.3。隨著GC 濃度的增大，OSA-GC 水凝膠的平衡溶脹率降低。OSA 的醛基與GC 的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成OSA-GC 水凝膠，較高的GC 含量使OSA-GC 水凝膠的交聯(lián)密度增加，孔隙率增加，孔徑減小，從而使得OSA-GC 水凝膠的溶脹率隨交聯(lián)密度增大而減小［18］。

圖6 OSA-GC 水凝膠的溶脹性能Fig.6 Swelling property of OSA-CMCS hydrogels in PBS

2.6 OSA-GC 水凝膠的體外生物降解性能

為研究OSA-GC 自愈合水凝膠的體外生物降解性能，在37 ℃的條件下，將OSA-GC 水凝膠在含有溶菌酶（10 mg/mL）的PBS 中培育。如圖7 所示，隨降解時間的延長，OSA-GC 水凝膠的質(zhì)量損失逐漸增大，降解速率逐漸減慢。在降解12 天后，OSA-GC 水凝膠的質(zhì)量損失分別達(dá)到51.9%，47.2%和43.1%。結(jié)果表明，OSA-GC 水凝膠的交聯(lián)度增大使OSA-GC 水凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的空間位阻效應(yīng)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致OSA-GC水凝膠的酶促降解反應(yīng)速率降低。OSA-GC 水凝膠的生物降解性能夠使其應(yīng)用于藥物載體或組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

圖7 OSA-GC 水凝膠的體外降解速率曲線Fig.7 In vitro degradation rate of OSA-GC hydrogel

2.7 OSA-GC 水凝膠的體外藥物釋放性能

將抗癌藥物吉西他濱作為模型藥物載入OSAGC 水凝膠中，并進(jìn)行了體外藥物釋放性能研究。圖8顯示了負(fù)載吉西他濱的OSA-GC 水凝膠的累積釋放曲線。在初始階段，OSA-GC 水凝膠負(fù)載的吉西他濱釋放速率較快。隨著釋放時間的延長，吉西他濱的釋放速率逐漸減慢，曲線斜率接近零，表明OSA-GC 載藥凝膠的藥物釋放達(dá)到平衡。在釋放初期，吉西他濱在OSA-GC 水凝膠表面和釋放介質(zhì)之間的濃度梯度較大，從而導(dǎo)致突釋現(xiàn)象的出現(xiàn)，有利于初期控制腫瘤的生長，隨著時間的延長，OSA-GC 水凝膠內(nèi)部的吉西他濱向介質(zhì)中不斷擴(kuò)散，OSA-GC 水凝膠表面和釋放介質(zhì)中吉西他濱的濃度梯度逐漸降低，使得吉西他濱的釋放速率減緩。負(fù)載吉西他濱的OSA-GC 水凝膠的藥物釋放量達(dá)到72.6%～89.5%，藥物釋放時間達(dá)到48 h。OSA-GC 水凝膠對吉西他濱的藥物釋放具有一定的緩釋作用，在可注射藥物載體領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景［19-21］。

圖8 OSA-GC 水凝膠的藥物釋放性能Fig.8 Drug release property of OSA-GC hydrogel

3 結(jié)論

（1）利用氧化海藻酸鈉（OSA）與乙二醇?xì)ぞ厶牵℅C）發(fā)生席夫堿反應(yīng)，制備具有自愈合性能的OSAGC 水凝膠。在室溫條件下，OSA-GC 水凝膠能夠在2 h 后實現(xiàn)自愈合，且該過程無需外界刺激。

（2）OSA-GC 水凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)狀微孔結(jié)構(gòu)。通過控制OSA 與GC 的質(zhì)量比，OSA-GC 水凝膠的孔徑處于50～280 μm。OSA-GC 水凝膠在120 h 達(dá)到溶脹平衡，溶脹率達(dá)到71.3～112.1。OSA-GC 水凝膠在含有溶菌酶（10 mg/mL）的PBS中發(fā)生降解，在12天后OSA-GC水凝膠的質(zhì)量損失達(dá)到43.1%～51.9%。

（3）OSA-GC 自愈合水凝膠對抗癌藥物吉西他濱具有緩釋作用，藥物釋放時間可達(dá)48 h，藥物釋放量達(dá)到72.6%～89.5%。OSA-GC 自愈合水凝膠在藥物遞送領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。