趙劍鋒，宋宗華*，劉靜

1.國(guó)家藥典委員會(huì)，北京 100061；

2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

2021 年4 月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布首批160 個(gè)中藥配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1]，其中包括菊花配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。菊花配方顆粒為菊花經(jīng)炮制并按標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要質(zhì)量指標(biāo)加工制成的配方顆粒。菊花為菊科菊屬多年生草本植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功能，臨床上用于治療風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒[2]?，F(xiàn)代研究表明，菊花中主要有黃酮類、揮發(fā)油、苯丙素類、萜類、氨基酸等化學(xué)成分，其中黃酮和苯丙素類化合物為菊花的主要藥效成分[3]。目前，菊花及其配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均以木犀草苷、綠原酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩嶙鳛橘|(zhì)量控制指標(biāo)。除了上述3 個(gè)成分，其他黃酮類和苯丙素類成分也是菊花配方顆粒發(fā)揮作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來(lái)，一測(cè)多評(píng)法（QAMS）在中藥整體質(zhì)量控制領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，在中藥同類化學(xué)成分含量測(cè)定方面日漸成熟[4-10]。本研究采用QAMS，以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)建立其與綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡?；鼘幩?、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的相對(duì)校正因子（RCF），同時(shí)計(jì)算出其他待測(cè)成分的含量，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步含量測(cè)定，用于菊花配方顆粒的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

LC-30AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；H-Class 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；AE-240 型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-202119，純度：96.3%）、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號(hào)：111782-201807，純度：94.3%）、4,5-O-二咖啡?；鼘幩幔ㄅ?hào)：111894-202104，純度：95.1%）、木犀草苷（批號(hào)：111720-201807，純度：96.6%）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（批號(hào)：111968-201602，純度：97.7%）、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸（批號(hào)：111717-201402，純度：94.5%）、蘆丁（批號(hào)：100080-202012，純度：91.6%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；3,4-O-二咖啡?；鼘幩幔ǔ啥既鸱宜忌锟萍加邢薰?，批號(hào)：Y-069-170516，純度＞98.0%）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為純化水。

7批菊花配方顆粒樣品信息見表1。

表1 7批菊花配方顆粒樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩帷⑻J丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡?；鼘幩?、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、4,5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品適量，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.070、1.114、1.080、1.088、1.019、0.378、1.177、1.310 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量至20 mL量瓶中，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為53.50、55.70、54.00、54.40、50.95、37.80、58.85、65.50 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（300 W，40 kHz）40 min，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0～10 min，10%～20%A；10～36 min，20%A；36～40 min，20%～90%A）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品及菊花配方顆粒樣品高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密吸取系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照2.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見表2。結(jié)果表明8個(gè)成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 菊花配方顆粒中8個(gè)成分的線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液2 μL，按2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡?；鼘幩?、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、4,5-O-二咖啡?；鼘幩岱迕娣e的RSD 分別為0.30%、0.80%、0.19%、0.18%、0.15%、0.12%、0.32%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取按2.1.2 項(xiàng)下方法制備的供試品（JHPF-1）溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，結(jié)果綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡?；鼘幩?、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD 分別為1.17%、1.24%、0.96%、1.12%、0.98%、1.32%、1.08%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（JHPF-1）6份，每份約0.2 g，研細(xì)，精密稱定，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果樣品中綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩崞骄|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.457%、0.143%、0.461%、0.918%、0.332%、0.492%、0.721%、0.712%，含量的RSD分別為1.85%、1.43%、2.18%、1.25%、2.28%、1.05%、2.09%、1.49%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的菊花配方顆粒（JHPF-1）6 份，每份約0.1 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.1.1 項(xiàng)下單一對(duì)照品綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡?；鼘幩帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩醿?chǔ)備液適量，按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試溶液，按2.2 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算回收率。8 個(gè)成分平均加樣回收率分別為98.4%、97.1%、96.7%、99.4%、102.1%、97.2%、98.2%、98.2%，回收率的RSD分別為2.9%、2.9%、2.7%、1.9%、1.8%、2.6%、1.8%、2.4%。

2.4 RCF計(jì)算

精密吸取2.1.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按2.2 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以木犀草苷為內(nèi)標(biāo)物，按公式（1）計(jì)算其他7 個(gè)成分的相對(duì)校正因子（f）。

式中Ai為待測(cè)成分峰面積，Ci為待測(cè)成分質(zhì)量濃度；As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。

表3 菊花配方顆粒7個(gè)待測(cè)成分RCF

2.5 RCF耐用性考察

2.5.1 高效液相色譜儀和色譜柱 在Waters HClass、LC-30AD 2 種高效液相色譜儀考察了Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 根不同色譜柱對(duì)RCF 的影響，各成分在不同色譜儀和不同色譜柱上的RCF 的RSD 均小于5%，表明不同色譜儀和不同色譜柱所得的RCF 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 不同儀器和色譜柱對(duì)菊花配方顆粒7個(gè)待測(cè)成分RCF的影響

2.5.2 柱溫 采用島津LC_30AD 高效液相色譜儀、Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）?？疾觳煌鶞兀?5、30、35 ℃）對(duì)RCF 影響，結(jié)果顯示，RCF差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RSD＜5%，見表5。

表5 不同柱溫對(duì)菊花配方顆粒7個(gè)待測(cè)成分RCF的影響

2.5.3 流動(dòng)相流速 考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）對(duì)RCF 的影響，精密吸取混合對(duì)照品溶液2 μL 注入液相色譜儀中，記錄峰面積。各成分RCF 的RSD 均小于5%，表明不同流速對(duì)各成分RCF影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表6。

表6 不同流動(dòng)相流速對(duì)菊花配方顆粒7個(gè)待測(cè)成分RCF的影響

2.6 色譜峰定位

采用相對(duì)保留時(shí)間法，以木犀草苷為基準(zhǔn)峰，在不同色譜柱下對(duì)該參數(shù)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，不同色譜柱下各成分間的相對(duì)保留值波動(dòng)較小，RSD均小于5%，見表7。

表7 不同色譜柱下菊花配方顆粒7個(gè)待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間

2.7 QAMS與外標(biāo)法（ESM）的結(jié)果比較

分別取7批樣品，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用ESM和QAMS計(jì)算菊花配方顆粒中綠原酸、1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、3,4-O-二咖啡?；鼘幩帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩帷?,5-O-二咖啡?；鼘幩岷浚姳?。2種方法所得到的8個(gè)成分含量基本一致，RSD＜5%，QAMS可以代替ESM進(jìn)行多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)。

表8 ESM和QAMS測(cè)定菊花配方顆粒8個(gè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）mg·g-1

3 討論

本研究參考了菊花配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定方法，采用70%甲醇對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為348 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液。參考已報(bào)道的菊花藥材多成分含量測(cè)定方法[11-13]，選擇Agilent TC-C18色譜柱，在此基礎(chǔ)上對(duì)梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明本方法的8 個(gè)成分得到基線分離。

QAMS 可以通過(guò)單個(gè)成分實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定，木犀草苷對(duì)照品保留時(shí)間處于中間位置，比較容易獲取，并且在配方顆粒中的含量相對(duì)穩(wěn)定，因此選擇其作為參照物。通過(guò)測(cè)定，其他7 個(gè)成分的相對(duì)保留時(shí)間和RCF 重復(fù)性良好。采用ESM 和QAMS對(duì)7批菊花配方顆粒中8個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，采用RSD 比較2種方法的準(zhǔn)確性。2 種方法對(duì)同一樣品的測(cè)定結(jié)果之間的RSD 均在3%以內(nèi)，表明2 種測(cè)定方法所得結(jié)果具有較好的重復(fù)性。

通過(guò)比較4家企業(yè)生產(chǎn)的7批菊花配方顆粒中8個(gè)成分的含量，發(fā)現(xiàn)綠原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸3 個(gè)成分含量均在法定標(biāo)準(zhǔn)限度內(nèi)，并且重復(fù)性較好。但是不同企業(yè)生產(chǎn)的配方顆粒中1,3-O-二咖啡?；鼘幩?、蘆丁、3,4-O-二咖啡酰基奎寧酸、4,5-O-二咖啡?；鼘幩岷坎町愝^為明顯，可能為生產(chǎn)原料和工藝所致。

4 結(jié)論

本研究所建立的QAMS 同時(shí)測(cè)定了菊花配方顆粒中8 個(gè)成分的含量的方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好，在降低分析檢測(cè)成本的同時(shí)，可以更全面地反映菊花配方顆粒內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)于完善菊花配方顆粒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)具有一定參考價(jià)值。