劉芬，楊樂(lè)，董玲，陳建波

北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水加熱提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒[1]。服用方便、調(diào)配靈活等優(yōu)勢(shì)賦予中藥配方顆粒廣闊的發(fā)展前景[2]，而可靠的質(zhì)量保證是必備前提。因?yàn)槭チ酥兴庯嬈男誀詈惋@微特征，化學(xué)成分檢測(cè)是中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的關(guān)鍵手段[3]。中藥配方顆粒制備時(shí)需以水為溶媒加熱提取[1]，但是現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要使用色譜方法檢測(cè)其中可溶于有機(jī)溶劑的小分子化合物[4-6]，缺少針對(duì)其他類(lèi)型成分的化學(xué)表征，不能全面整體地評(píng)價(jià)中藥配方顆粒的物質(zhì)組成。

中藥配方顆粒制備時(shí)可以使用必要的輔料[1]。輔料種類(lèi)和用量可能影響服藥劑量、藥物溶出和吸收等[3,7]，是中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)考慮的因素。中藥顆粒劑常用輔料多為高分子和無(wú)機(jī)物，難以直接體現(xiàn)在基于液相色譜或氣相色譜的指紋圖譜或特征圖譜中。中藥飲片水提物可能含有多糖、蛋白質(zhì)等高分子化合物，有些情況下這些成分是重要藥效物質(zhì)。因此，高分子化合物檢測(cè)對(duì)于中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)是很有必要的。中藥配方顆粒沖服時(shí)可能存在難溶性物質(zhì)[3]。這些難溶性物質(zhì)可能是沒(méi)有除凈的飲片殘?jiān)?，或者是人為添加的難溶性輔料，還可能是因?yàn)楹罄m(xù)生產(chǎn)過(guò)程降低了某些成分的溶解性。因此，難溶性物質(zhì)檢測(cè)對(duì)于中藥配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)很有必要。

波數(shù)為4000～400 cm-1的中紅外光譜（《中華人民共和國(guó)藥典》稱(chēng)為“紅外分光光度法”，以下簡(jiǎn)稱(chēng)紅外光譜）是固體樣品、高分子樣品的經(jīng)典分析方法之一，可用于中藥配方顆粒的難溶性物質(zhì)與高分子化合物檢測(cè)。紅外光譜可以直接檢測(cè)固體、液體、氣體等各種形態(tài)物質(zhì)，能夠同時(shí)獲得有機(jī)小分子、有機(jī)大分子、無(wú)機(jī)成分等各類(lèi)成分信號(hào)，從而快速且整體地表征中藥配方顆粒的物質(zhì)組成[8-12]。但是，樣品未經(jīng)分離而直接進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)時(shí)，不同成分的光譜信號(hào)相互疊加，降低了靈敏度和專(zhuān)屬性。因此，本研究嘗試先對(duì)樣品進(jìn)行溶劑分離，然后用紅外光譜檢測(cè)不同溶劑分離部位，獲得中藥配方顆粒所含難溶性物質(zhì)和高分子化合物的化學(xué)組成信息。

1 材料

1.1 樣品

中藥配方顆粒樣品由生產(chǎn)廠家A、B、C、D 提供（表1）。茯苓飲片（批號(hào)：20200409，北京上醫(yī)仁家中醫(yī)診所有限公司）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。

表1 中藥配方顆粒樣品信息

1.2 試藥

硬脂酸鈣（批號(hào)：C12785783，鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.6%～7.4%）、干法云母粉（批號(hào)：C13718326，1250 目）購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；硅膠（批號(hào)：C2204266，分析純，300～400 目）、聚氧化乙烯（PEO，批號(hào)：C2211203，黏度平均分子質(zhì)量約100 萬(wàn)）、草酸鈣水合物（批號(hào)：J1816073，純度98%）均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麥芽糊精[葡萄糖當(dāng)量（DE）≤18]購(gòu)自山東西王糖業(yè)有限公司。

1.3 儀器

VERTEX 70 型傅里葉變換紅外光譜儀（德國(guó)Bruker 公司），配有Platinum ATR 衰減全反射附件；Milli-Q? Integral 5型純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck Millipore公司）；BT25S 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；KH7200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；3-18N 型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 中藥配方顆粒溶劑分離

如圖1 所示，使用溶劑分離法獲得各配方顆粒樣品的難溶部位、三氯甲烷部位、乙醇部位、水溶部位，揮干或凍干除去溶劑后進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。

2.2 紅外光譜測(cè)試與數(shù)據(jù)處理

適量水或乙醇清潔ATR 附件的內(nèi)反射晶體表面，溶劑揮干后測(cè)量背景光譜；然后取樣品適量，置于內(nèi)反射晶體表面，用ATR 附件自帶壓桿保證樣品與內(nèi)反射晶體表面緊密接觸，測(cè)量樣品光譜。背景光譜與樣品光譜測(cè)量范圍4000～400 cm-1，光譜分辨率4 cm-1，單張光譜累積掃描32 次。以透過(guò)率（T）為縱坐標(biāo)記錄樣品光譜測(cè)量結(jié)果，然后進(jìn)行如下處理：1）使用光譜儀配套軟件的插值功能將所有光譜橫坐標(biāo)間隔調(diào)整為1 cm-1；2）光譜縱坐標(biāo)由T轉(zhuǎn)為吸光度[A，A=lg(1/T)]；3）對(duì)光譜進(jìn)行ATR 校正；4）對(duì)光譜進(jìn)行自動(dòng)基線(xiàn)校正；5）光譜縱坐標(biāo)歸一化，使2000～800 cm-1區(qū)域內(nèi)最高吸光度為1、最低吸光度為0。

3 結(jié)果與討論

3.1 中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜分析

當(dāng)歸-A、黨參-A、黨參-C、黃芪-C 4個(gè)配方顆粒樣品的難溶部位與硅膠（SiO2·xH2O）的紅外光譜見(jiàn)圖2。硅膠的紅外光譜中1068、456 cm-1分別為Si-O 伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰，3385、1628 cm-1分別為O-H 伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)吸收峰。結(jié)合水的影響使硅膠Si-O 吸收峰與無(wú)水二氧化硅有明顯差異。廠家A 當(dāng)歸和黨參配方顆粒、廠家C 黨參和黃芩配方顆粒的難溶部位紅外光譜與硅膠一致，說(shuō)明這些配方顆粒中可能添加了微粉硅膠作為輔料。

圖2 含有硅膠的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

幾種配方顆粒的難溶部位與草酸鈣水合物（CaC2O4·xH2O）的紅外光譜見(jiàn)圖3。草酸鈣水合物的紅外光譜中1613、1315 cm-1分別為羧酸根離子C-O反對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，3500～3000 cm-1區(qū)域?yàn)榻Y(jié)晶水O-H 伸縮振動(dòng)吸收峰。廠家B 黨參配方顆粒、廠家D 當(dāng)歸和金銀花配方顆粒的難溶部位紅外光譜中1640、1320 cm-1附近吸收峰與草酸鈣水合物相似，但并非完全一致。這可能是因?yàn)榻Y(jié)晶水比例不同，或者陽(yáng)離子有差異。草酸鈣難溶于水，中藥飲片水提物中草酸鈣含量應(yīng)該極低。另外，上述配方顆粒難溶部位的紅外光譜中也有1080、460 cm-1附近的硅膠特征峰，但是1200～1000 cm-1區(qū)域的峰形狀有一定差異，說(shuō)明這些樣品中可能含有硅酸鹽雜質(zhì)。上述配方顆粒產(chǎn)品中同時(shí)存在難溶性草酸鹽與難溶性硅酸鹽，可能是因?yàn)樯a(chǎn)過(guò)程中提取液沒(méi)有充分濾凈。

圖3 含有草酸鹽的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

如圖4 所示，廠家B 當(dāng)歸配方顆粒、廠家D 黨參配方顆粒的難溶部位紅外光譜均含有1640 cm-1附近的酰胺Ⅰ帶峰和1530 cm-1附近的酰胺Ⅱ帶峰，說(shuō)明其中均含有蛋白質(zhì)類(lèi)成分，可能是浸膏中可溶性蛋白質(zhì)在后續(xù)生產(chǎn)過(guò)程（如干燥過(guò)程）發(fā)生變性。此外，廠家B 當(dāng)歸配方顆粒難溶部位含有麥芽糊精，也說(shuō)明其生產(chǎn)過(guò)程可能導(dǎo)致多種成分溶解性變化。上述2 個(gè)配方顆粒難溶部位紅外光譜均有1320 cm-1附近的草酸鹽吸收峰，但是1640 cm-1附近的草酸鹽吸收峰與蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶峰相互重疊。廠家D 黨參配方顆粒難溶部位的524、469 cm-1吸收峰顯示了硅酸鹽的存在。硅酸鹽（523、464 cm-1）與硅膠（456 cm-1）特征峰有明顯區(qū)別，這說(shuō)明廠家D 黨參配方顆粒中應(yīng)當(dāng)沒(méi)有添加微粉硅膠，而是可能因?yàn)楣桃悍蛛x不凈而在浸膏中遺留有難溶性硅酸鹽。

圖4 含有蛋白質(zhì)的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

圖5 顯示了A、B、C 3 個(gè)廠家生產(chǎn)的茯苓配方顆粒的難溶部位紅外光譜。對(duì)照?qǐng)D4 顯示的麥芽糊精紅外光譜可知，廠家C 茯苓配方顆粒難溶部位主要是麥芽糊精。比較1200～900 cm-1區(qū)域的紅外光譜吸收峰特征可知，A和B 2個(gè)廠家的茯苓配方顆粒難溶部位與茯苓飲片相似，主要由難溶性的β-葡聚糖組成，而890 cm-1附近即為典型的β-葡萄糖苷鍵特征峰[13]。這說(shuō)明A 和B 2個(gè)廠家的茯苓配方顆?？赡芎泄桃悍蛛x不凈或其他原因遺留的難溶性飲片粉末。此外，廠家B 茯苓配方顆粒難溶部位紅外光譜還有明顯的1610、1313、779 cm-1等草酸鈣水合物特征峰，也說(shuō)明其產(chǎn)品中可能遺留有難溶性飲片粉末。

圖5 含有多糖的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

圖6 所示為幾種配方顆粒的難溶部位與硬脂酸鈣（CaC36H70O4）的紅外光譜。硬脂酸鈣的紅外光譜中2916、2849 cm-1分別為亞甲基C-H 反對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，1600～1400 cm-1區(qū)域?yàn)轸人岣x子C-O 伸縮振動(dòng)吸收峰與亞甲基和甲基C-H 彎曲振動(dòng)吸收峰的重疊結(jié)果。廠家A 和廠家C 的金銀花配方顆粒、廠家D 黃芪配方顆粒的難溶部位紅外光譜中2916、2849 cm-1附近吸收峰與硬脂酸鈣基本一致，廠家D 黃芪配方顆粒難溶部位紅外光譜中能直接觀察到1576、1540 cm-1附近的硬脂酸鈣特征峰，說(shuō)明這些樣品均添加硬脂酸鈣作為輔料。

圖6 含有硬脂酸鹽的中藥配方顆粒難溶部位的紅外光譜

綜上所述，中藥配方顆粒產(chǎn)品中普遍存在難溶性物質(zhì)，而且化學(xué)組成較為復(fù)雜，不同廠家、不同品種的中藥配方顆粒難溶性物質(zhì)各有差異。一些難溶性物質(zhì)來(lái)自輔料，如硅膠、硬脂酸鈣、麥芽糊精等；另一些難溶性物質(zhì)來(lái)自飲片，如草酸鹽、硅酸鹽、蛋白質(zhì)、多糖等。飲片提取后的生產(chǎn)環(huán)節(jié)可能改變?cè)锌扇苄猿煞值娜芙舛?，也可能因?yàn)楣桃悍蛛x不凈等導(dǎo)致配方顆粒產(chǎn)品含有原本存在于飲片中的難溶性成分。

3.2 中藥配方顆粒三氯甲烷部位的紅外光譜分析

中藥配方顆粒水溶液以極性分子為主，所以大部分樣品的三氯甲烷萃取液中固形物極少，僅含有一些甲基、亞甲基較多的分子。但是，如圖7 所示，廠家D 黃芪配方顆粒三氯甲烷部位的紅外光譜與PEO 高度一致，說(shuō)明該配方顆粒中添加了PEO 作為輔料。本研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該廠家其他批次的黃芪配方顆粒也存在添加PEO的情況。

圖7 含有PEO的中藥配方顆粒三氯甲烷部位的紅外光譜

3.3 中藥配方顆粒水溶部位的紅外光譜分析

麥芽糊精是中藥配方顆粒普遍添加的輔料，部分產(chǎn)品中麥芽糊精含量超過(guò)50%。中藥配方顆粒不經(jīng)分離而直接進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)時(shí)，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以比較準(zhǔn)確地定量檢測(cè)其中的麥芽糊精[14-15]。如果樣品中麥芽糊精含量較低而且沒(méi)有可用的多元校正模型，可以利用溶劑分離方法提高紅外光譜定性檢測(cè)麥芽糊精的靈敏度。中藥配方顆粒水溶液的醇沉沉淀（本研究中稱(chēng)為水溶部位，圖1）是多糖類(lèi)成分較為富集的部位，因此是檢測(cè)麥芽糊精或其他多糖類(lèi)成分的首選。如圖8 所示，不同品種配方顆粒的水溶部位紅外光譜均與麥芽糊精非常相似，說(shuō)明中藥配方顆粒普遍添加麥芽糊精，而且麥芽糊精含量明顯超過(guò)中藥自身多糖含量。如果要檢測(cè)中藥配方顆粒所含的藥物多糖，必須排除麥芽糊精的影響。

圖8 含有麥芽糊精的中藥配方顆粒水溶部位的紅外光譜

3.4 典型配方顆粒樣品的不同溶劑部位紅外光譜分析

廠家D 黃芪配方顆粒不同溶劑部位的紅外光譜見(jiàn)圖9。配方顆粒樣品不經(jīng)分離而直接進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其紅外光譜是全部成分吸收信號(hào)的疊加，含量較高、信號(hào)較強(qiáng)的成分占據(jù)主導(dǎo)，含量較低、信號(hào)較弱的成分不易觀察。由圖9 可知，該黃芪配方顆粒整體紅外光譜的主要吸收信號(hào)來(lái)自乙醇部位，也就是既溶于水、又溶于70%乙醇的小分子化合物。該黃芪配方顆粒乙醇部位的紅外光譜與無(wú)定形蔗糖非常相似，液相色譜測(cè)試發(fā)現(xiàn)該黃芪配方顆粒的蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30%。因此，可以基本確定該黃芪配方顆粒整體與乙醇部位的紅外光譜主要特征與無(wú)定形蔗糖一致。根據(jù)廠家D 提供的數(shù)據(jù)，該黃芪配方顆粒中麥芽糊精含量為29%。但是麥芽糊精的紅外光譜吸收信號(hào)區(qū)域與蔗糖高度重疊，所以在該配方顆粒整體紅外光譜上很難直觀發(fā)現(xiàn)麥芽糊精特征峰，而水溶部位的紅外光譜與麥芽糊精（圖8）高度相似。該黃芪配方顆粒的難溶部位明顯含有硬脂酸鈣（圖6），而三氯甲烷部位明顯含有PEO（圖7）。雖然硬脂酸鈣與PEO的含量較低，但是該配方顆粒整體紅外光譜上仍然可以觀察到2918 cm-1附近的硬脂酸鈣特征峰與1341 cm-1附近的PEO 特征峰。綜上所述，廠家D 黃芪配方顆粒的整體紅外光譜顯示其含有大量無(wú)定形蔗糖，還可能添加硬脂酸鈣與PEO。溶劑分離后的紅外光譜可以確認(rèn)硬脂酸鈣與PEO 的存在，還可以確認(rèn)麥芽糊精的存在。

圖9 某黃芪配方顆粒不同溶劑部位的紅外光譜

4 結(jié)論

中藥配方顆?？梢钥醋鲉挝吨兴庯嬈嵛锱c輔料的混合物?；谝合嗌V或氣相色譜檢測(cè)技術(shù)的指紋圖譜（特征圖譜）是對(duì)中藥配方顆粒所含有機(jī)小分子化合物進(jìn)行整體控制的必備手段。此外，中藥配方顆粒含有的難溶性物質(zhì)、高分子化合物可能影響有機(jī)小分子化合物的溶出、溶解、吸收過(guò)程，某些情況下難溶性物質(zhì)、高分子化合物本身就屬于藥效物質(zhì)。因此，建立難溶性物質(zhì)與高分子化合物的化學(xué)表征方法，對(duì)于更加全面整體地評(píng)價(jià)中藥配方顆粒質(zhì)量是較為必要的。根據(jù)紅外光譜能夠直接檢測(cè)固體樣品和高分子樣品的技術(shù)特點(diǎn)，本研究選擇紅外光譜表征中藥配方顆粒難溶性物質(zhì)與高分子化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。為了提高檢測(cè)靈敏度和專(zhuān)屬性，本研究采取先用系統(tǒng)溶劑分離、后用紅外光譜檢測(cè)的技術(shù)路線(xiàn)。

本研究的結(jié)果表明，紅外光譜與系統(tǒng)溶劑分離相結(jié)合可以明顯提高檢測(cè)靈敏度和專(zhuān)屬性，有效識(shí)別中藥配方顆粒所含難溶性物質(zhì)與高分子化合物。三氯甲烷部位的紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)親脂性高分子輔料（如PEO），而水溶部位的紅外光譜可以發(fā)現(xiàn)親水性高分子輔料（例如麥芽糊精）。難溶部位的紅外光譜既可以發(fā)現(xiàn)硅膠、硬脂酸鈣等無(wú)機(jī)輔料，又可以發(fā)現(xiàn)草酸鹽、硅酸鹽、蛋白質(zhì)、多糖等藥物自身成分，反映了分離、干燥、制粒等生產(chǎn)環(huán)節(jié)對(duì)中藥配方顆粒藥物組成及其理化性質(zhì)的影響。因此，紅外光譜可以與液相色譜、氣相色譜等分析技術(shù)相互結(jié)合，更加全面地表征中藥配方顆粒的化學(xué)成分，更加完善地評(píng)價(jià)中藥配方顆粒的質(zhì)量水平。