趙迪，伍一煒，徐玉巖，范佳萍，張韻寒，楊蕊嶷，汪洪，吳麗麗，徐暾海*，朱寅荻

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；

2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；

3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

風(fēng)輪菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze 別名九塔草、山薄荷、苦刀草，為唇形科（Labiatae）風(fēng)輪菜屬（ClinopodiumLinn.）植物，主產(chǎn)于山東、浙江、江蘇、安徽、江西和福建等地[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020 年版收載風(fēng)輪菜干燥地上部分為中藥斷血流，具有收斂止血的功效，用于崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血和創(chuàng)傷出血[2]。研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)輪菜屬藥用植物中含有三萜及其皂苷、黃酮、揮發(fā)油、苯丙素等類成分，其中皂苷、黃酮是該屬植物的主要活性成分。這些成分表現(xiàn)出多種生物學(xué)活性，包括抗炎止血[3]、抗高血糖、抗腫瘤、免疫抑制、心臟保護(hù)和抗輻射[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，斷血流具有活血和止血的活性，具有良好的開發(fā)價(jià)值。本研究對(duì)風(fēng)輪菜的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步研究，從中分離出9 個(gè)化合物，分別為 (4S,9S)-9-羥基茉莉酮（1）、紅花菜豆酸（2）、環(huán)-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)（3）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（4）、2-甲氧基-4-(2-丙烯基)-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、吐葉醇（6）、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（7）、對(duì)-薄荷-3,8-二烯-1,2-二醇（8）、黃麻香堇醇C（9），結(jié)構(gòu)見圖1。其中化合物1為新化合物，化合物2～3、5～6、8 為首次從風(fēng)輪菜中分離得到。評(píng)估了從風(fēng)輪菜提取物中分離得到的化合物1、6、9 的細(xì)胞保護(hù)活性，發(fā)現(xiàn)化合物9 對(duì)棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的肝癌HepG2 細(xì)胞損傷具有顯著的細(xì)胞保護(hù)活性（P＜0.001），且與劑量呈正相關(guān)，化合物6 在高劑量時(shí)有一定的細(xì)胞保護(hù)活性（P＜0.05）。

圖1 風(fēng)輪菜中分離得到的化合物1～9

1 材料

1.1 樣品

風(fēng)輪菜購(gòu)買于安徽省亳州市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院汪洪副教授鑒定為唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze。樣品標(biāo)本（20170820）現(xiàn)存于溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 細(xì)胞

HepG2 細(xì)胞為北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存細(xì)胞株。

1.3 儀器與耗材

QoneAS400 型核磁共振波譜儀（武漢中科牛津波譜技術(shù)有限公司）；LTQ-Orbitrap XL 型質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo-Fisher 公司）；PolA Ar 3005 型全自動(dòng)旋光儀（英國(guó)Optical Activity 公司）；TU19 型雙光束紫外-可見光分光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；FTIR-850 型傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；1260-6120 型液相色譜-單四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；HERA cell 150i 型恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；HDL 型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；IX71 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Glomaxmulti 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Promega 公司）；3k15 型臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；R200D 型分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；C100 型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（瑞沃德生命科技有限公司）。

Pack ODS-A型半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）、C18反相填料均購(gòu)于日本YMC 公司；柱色譜和薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；D101 型大孔吸附樹脂（南開大學(xué)）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Biosciences公司）。

1.4 試劑

DMEM 低糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；鏈霉素、青霉素（北京博奧拓科技有限公司）；胎牛血清（美國(guó)O-RIGIN公司）；牛血清白蛋白（BSA）、棕櫚酸（PA）、細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK-8）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（1×，美國(guó)Hyclone公司）。

2 方法

2.1 提取與分離

取風(fēng)輪菜干燥地上部分60 kg，粉碎，經(jīng)70%乙醇提取，回收溶劑后加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶劑得到各部分萃取物；將正丁醇萃取物經(jīng)D101 大孔吸附樹脂柱分離，以30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脫，依次得到組分Fr.A～Fr.D。Fr.A 經(jīng)硅膠柱色譜（100～200 目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0～100∶50）梯度洗脫、薄層色譜檢識(shí)，得22個(gè)組分（Fr.A.1～Fr.A.22）；Fr.A.1 經(jīng)C18反相柱色譜分離，甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)得到5 個(gè)組分（Fr.A.1.1～Fr.A.1.5）。Fr.A.1.4 經(jīng)硅膠柱色譜（100～200 目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶5）洗脫，Sephadex LH-20 柱色譜及半制備高效液相色譜（檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm）分離純化得到化合物8（6 mg，甲醇-水40∶60，tR=26 min）。Fr.A.2經(jīng)C18中壓柱色譜分離，甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)，得到3 個(gè)組分（Fr.A.2.1～Fr.A.2.3），F(xiàn)r.A.2.2再經(jīng)硅膠柱色譜（100～200目）分離，以石油醚-乙酸乙酯（100∶5～100∶50）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)，得到12個(gè)組分（Fr.A.2.2.1～Fr.A.2.2.12）。將Fr.A.2.2.6～Fr.A.2.2.7 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜及半制備高效液相色譜（檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm）分離純化得到化合物1[14 mg，甲醇-水（35∶65），tR=28 min]、2 [5 mg，甲醇-水（35∶65），tR=38 min]、3 [6 mg，甲醇-水（38∶62），tR=21 min]、6 [16 mg，甲醇-水（31∶69），tR=46 min]，9 [10 mg，甲醇-水（31∶69），tR=43 min]。Fr.A.2.3 再經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～100∶50）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)，得到13個(gè)組分（Fr.A.2.3.1～Fr.A.2.3.13）。Fr.A.2.3.10 經(jīng)C18中壓柱色譜分離，以甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脫，得到3個(gè)組分（Fr.A.2.3.10.1～Fr.A.2.3.10.3。Fr.A.2.3.10.2 經(jīng)硅膠柱色譜（100～200 目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶5～100∶25）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)，合并得到4個(gè)組分（Fr.A.2.3.10.2.1～Fr.A.2.3.10.2.4）。Fr.A.2.3.10.2.4 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜分離得到化合物4（8 mg，淡黃色不溶物析出，析出溶劑為甲醇）。Fr.A.2.3.10.3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜及半制備高效液相色譜分離純化（檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm）得到化合物7 [8 mg，甲醇-水（54∶46），tR=30 min]。

2.2 細(xì)胞保護(hù)活性

分別檢測(cè)化合物1、6、9 的細(xì)胞保護(hù)活性。用0.5 mmol·L-1PA處理HepG2細(xì)胞24 h，制備細(xì)胞損傷模型[5]，將造模后的HepG2細(xì)胞接種在96孔板中，密度為5×103個(gè)/孔。將細(xì)胞置于37 °C、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入不同質(zhì)量濃度（5、10、20 μg·mL-1）的化合物1、6、9 10 μL刺激細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白組（不加細(xì)胞）、對(duì)照組和模型組（不加藥物）。將96 孔板在37 °C、含5% CO2及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。每孔加入培養(yǎng)基100 μL（含CCK-8 溶液10 μL）。37 °C、含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定吸光度（A）。根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

HMBC中δH4.65 (1H,dd,J=6.2,1.8 Hz,H-4) 與δC208.0 (C-1),140.6 (C-2),173.1 (C-3),45.1 (C-5)有遠(yuǎn)程相關(guān)，δH2.17 (1H,dd,J=17.8,1.8 Hz,H-5a),2.73 (1H,dd,J=17.8,6.2,H-5b) 與δC208.0 (C-1),140.6 (C-2),173.1 (C-3),72.1 (C-4) 有遠(yuǎn)程相關(guān)；在1H-1H COSY 譜，H-4 與H-5 有相關(guān)峰（圖2）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物含有1 個(gè)α、β不飽和酮的五元環(huán)片段。在HMBC 譜中，δH5.27 (1H,m,H-7),5.40 (1H,br t,J=10.8 Hz,H-8) 與δC64.3 (C-9) 有遠(yuǎn)程相關(guān)，δH4.74 (1H,m,H-9) 與δC126.8 (C-7),136.3 (C-8),23.8 (C-10) 有遠(yuǎn)程相關(guān)，在1H-1H COSY 譜可見H-6、H-7、H-8、H-9、H-10 有相關(guān)峰。根據(jù)以上數(shù)據(jù)推測(cè)該化合物有1個(gè)含有5個(gè)碳的烯烴側(cè)鏈。由H-6 與C-1，H-7 與C-2 有HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)，可推測(cè)出烯烴側(cè)鏈與C-2相連。

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)

由H-4 與C-11 (δC14.0) 有HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)，Me-11 與C-2、C-3、C-4 有HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)，可推測(cè)出C-3 位連有1 個(gè)甲基。通過1H-1H COSY 譜可推測(cè)出C-9 連有1 個(gè)羥基，通過1H-1H COSY 和HMBC譜可推測(cè)出C-4 連有1 個(gè)羥基。根據(jù)H-8 的耦合常數(shù)（J=10.8 Hz）推斷雙鍵Δ7,8的構(gòu)型為Z。以上數(shù)據(jù)推測(cè)化合物1 為茉莉酮[6]的9 號(hào)位連了1 個(gè)羥基，因此化合物1有C-4和C-9 2個(gè)手性碳。

CD 譜中，化合物1 顯示在230 nm 處有1 個(gè)負(fù)Cotton 效應(yīng)，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比[7]，推測(cè)化合物1 的C-4 的絕對(duì)構(gòu)型為S。通過實(shí)驗(yàn)電子圓二色譜（ECD）與計(jì)算ECD 對(duì)比（圖3）確定化合物1 的絕對(duì)構(gòu)型，采用IEFPCM 模型，以甲醇為溶劑，在B3LYP/6-31G (d) 水平上計(jì)算 (4S,9S)-1、(4R,9S)-1、(4S,9R)-1 和 (4R,9R)-1 的理論ECD 譜[8]，結(jié)果表明計(jì)算出的 (4S,9S)-1 ECD 譜與實(shí)驗(yàn)ECD 譜吻合，確定化合物C-4 的絕對(duì)構(gòu)型為S，推測(cè)C-9 的絕對(duì)構(gòu)型為S（圖3）。至此，化合物1 命名為 (4S,9S)-9-羥基茉莉酮 [(4S,9S) -9-hydroxyjasmololone]，通過1H-1HCOSY、HSQC、HMBC 譜對(duì)該化合物的所有氫碳信號(hào)進(jìn)行了全歸屬，見表1。

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)（400/100 MHz,CD3OD)

圖3 化合物1的實(shí)測(cè)與不同構(gòu)型計(jì)算ECD圖

化合物2：黃色油狀物，易溶于甲醇；結(jié)合1H-和13C-NMR譜，推測(cè)化合物2分子式為C15H20O5；ESIMSm/z: 303 [M+Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:5.81 (1H,s,H-2),8.08 (1H,d,J=16.0 Hz,H-4),6.50(1H,d,J=16.0 Hz,H-5),2.07 (3H,s,H-6),2.80 (1H,d,J=17.8 Hz,H-3'a),2.48 (1H,dd,J=2.0,18.0 Hz,H-3'b),2.71 (1H,dd,J=2.4,18.0 Hz,H-5'a),2.42 (1H,dd,J=2.4,18.0 Hz,H-5'b),1.21 (3H,s,H-7'),3.65 (1H,d,J=7.8 Hz,H-8'a),3.92 (1H,dd,J=3.2,7.8 Hz,H-8'b),1.09 (3H,s,H-9')；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 169.7 (C-1),119.9 (C-2),151.3 (C-3),133.0 (C-4),133.7 (C-5),21.3 (C-6),83.0 (C-1'),87.9 (C-2'),54.1 (C-3'),211 (C-4'),53.3 (C-5'),48.7 (C-6'),19.5 (C-7'),78.6 (C-8'),15.9 (C-9')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定化合物2為紅花菜豆酸。

化合物3：無(wú)色片狀晶體（甲醇）；ESI-MSm/z:211 [M+H]+；結(jié)合1H-和13C-NMR譜，推測(cè)其分子式為C11H18O2N2；1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ: 5.77(1H,brs,N-H),3.47～3.54 (2H,m,H-3),1.92～2.30(4H,m,H-4,5),4.15 (1H,t,J=8.4 Hz,H-6),4.09(1H,dd,J=9.6,3.4 Hz,H-9),2.04 (1H,m,H-10),1.50 (1H,dd,J=14.6,9.6 Hz,H-10),1.76～1.67 (1H,m,H-11),0.93～0.99 (6H,m,Me-12,13)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 173.0 (C-1),46.6 (C-3),23.8(C-4),29.2 (C-5),60.4 (C-6),169.1 (C-7),54.8 (C-9),39.6 (C-10),25.9 (C-11),23.5 (C-12),22.4 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[10]，故化合物3 鑒定為環(huán)-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)。

化合物4：淡黃色粉末；ESI-MSm/z: 459 [M-H]-；結(jié)合1H-和13C-NMR 譜推測(cè)其分子式為C22H20O11；1H-NMR (400 MHz,C5D5N)δ: 7.83 (2H,d,J=9.0 Hz,H-2',6'),7.10 (2H,d,J=9.0 Hz,H-3',5'),6.78(1H,s,H-3),6.76 (1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.54 (1H,d,J=2.2 Hz,H-6),5.43 (1H,d,J=5.6 Hz,H-1″),3.64 (3H,s,-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,C5D5N)δ:164.9 (C-2),103.9 (C-3),182.9 (C-4),157.7 (C-5),101.6 (C-6),163.5 (C-7),95.2 (C-8),162.6 (C-9),106.7 (C-10),122 (C-1'),128.8 (C-2',6'),162.7 (C-4'),116.7 (C-3',5')，100.4 (C-1″),74.3 (C-2″),77.4 (C-3″),72.7 (C-4″),77.1(C-5″),170.2 (C-6″),51.9 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]，故鑒定化合物4為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 327 [M+H]+；結(jié)合1H-和13C-NMR 譜推測(cè)其分子式為C16H22O7；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 6.82(1H,br s,H-3),6.72 (1H,br d,J=8.6 Hz,H-5),7.08(1H,d,J=8.6 Hz,H-6),3.46 (2H,dd,J=8.2,1.6 Hz,H-7),5.95 (1H,m,H-8),5.01 (1H,d,J=18.6 Hz,H-9a),5.03 (1H,d,J=18.6 Hz,H-9b),4.84 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1'),3.33～3.51 (4H,m,H-2',3',4',5'),3.69 (1H,m,H-6'a),3.87 (1H,br d,J=12.2 Hz,H-6'b),3.84 (3H,s,2-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 146.3 (C-1),150.4 (C-2),114.0 (C-3),136.6 (C-4),122.2 (C-5),118.0 (C-6),40.8 (C-7),138.8 (C-8),116.0 (C-9),103.2 (C-1'),75.1 (C-2'),78.0 (C-3'),71.2 (C-4'),78.0 (C-5'),62.6 (C-6'),56.8 (2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定化合物5 為2-甲氧基-4-(2-丙烯基)-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：無(wú)色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+；；結(jié)合1H-和13C-NMR 譜推測(cè)其分子式為C13H20O3。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 2.49 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2b),2.14 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2a),5.86 (1H,s,H-4),5.76 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7),5.80 (1H,d,J=15.6 Hz,H-8),4.33 (1H,m,H-9),1.23 (3H,d,J=6.4 Hz,H-10),1.03 (3H,s,H-11),1.01 (3H,s,H-12),1.90 (3H,d,J=1.4 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 42.6 (C-1),50.9 (C-2),201.4 (C-3),127.3(C-4),167.6 (C-5),80.1 (C-6),130.1 (C-7),137.1 (C-8),68.8 (C-9),24.0 (C-10),23.6 (C-11),24.7 (C-12),19.7 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物6為吐葉醇，與化合物9互為異構(gòu)體，兩者具有相同的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)，但比旋光度不同，查閱文獻(xiàn)推測(cè)為9 號(hào)位構(gòu)型異構(gòu)。兩者在流動(dòng)相為31%甲醇的半制備高效液相色譜圖上顯示2 個(gè)峰。其中化合物9的出峰時(shí)間為43 min，化合物6的出峰時(shí)間為46 min。

化合物7：白色無(wú)定型粉末；ESI-MSm/z: 449[M+H]+；結(jié)合1H-和13C-NMR 譜推測(cè)其分子式為C21H20O11。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.39 (1H,br d,J=12.0 Hz,H-2),3.20 (1H,dd,J=17.0,3.2 Hz,H-3a),2.74 (1H,dt,J=17.0,3.2 Hz,H-3b),6.17 (2H,m,H-6,8),7.32 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2',6'),6.82(2H,d,J=8.4 Hz,H-3',5'),5.07 (1H,t,J=8.4 Hz,H-1″),3.60 (1H,t,J=9.2 Hz,H-2″),3.48 (2H,m,H-3″,4″),4.08 (1H,d,J=9.2 Hz,H-5″)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 166.8 (C-5),98.0 (C-6),165.2 (C-7),97.0(C-8),164.7 (C-9),105.1 (C-10),131.0 (C-1'),130.8(C-2'),116.3 (C-3'),159.3 (C-4'),116.5 (C-5'),129.3 (C-6'),171.0 (C-6″),198.8 (C-4),44.4 (C-3),80.8 (C-2),101.2 (C-1″),77.1 (C-2″),76.8 (C-3″),74.5 (C-4″),73.0 (C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)照基本一致[14]，故確定化合物7為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸。

化合物8：無(wú)色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 169 [M+H]+；結(jié)合1H-和13C-NMR 譜推測(cè)其分子式 為C10H16O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 4.04(1H,br s,H-2),5.73 (1H,br s,H-3),2.39 (1H,m,H-5a),2.28 (1H,m,H-5b),1.84 (1H,m,H-6a),1.60(1H,m,H-6b),1.93 (3H,s,H-7),5.08 (1H,s,H-9a),4.96 (1H,s,H-9b),1.18 (3H,s,H-10)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 144.1 (C-8),139.0 (C-4),127.3 (C-3),112.7 (C-9),21.9 (C-6),21.0 (C-10),34.6 (C-5),25.4 (C-6),75.1 (C-2),72.6 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物8 為對(duì)-薄荷-3,8-二烯-1,2-二醇。

化合物9：無(wú)色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+；結(jié)合1H-和13C-NMR 譜推測(cè)其分子式為C13H20O3。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.87 (1H,s,H-4),5.77(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),5.79 (1H,d,J=16.2 Hz,H-8),4.32 (1H,m,H-9),2.48 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2β),2.15 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2α),1.24 (3H,d,J=7.0 Hz,H-10),1.04 (3H,s,H-11),1.01 (3H,s,H-12),1.91(3H,d,J=1.4 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 42.6 (C-1),50.9 (C-2),201.4 (C-3),127.3 (C-4),167.7 (C-5),80.1 (C-6),130.3 (C-7),137.1 (C-8),68.9 (C-9),24.0 (C-10),23.6 (C-11),24.7 (C-12),19.8 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物9為黃麻香堇醇C。

3.2 細(xì)胞保護(hù)活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，化合物9 對(duì)PA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞損傷具有顯著的細(xì)胞保護(hù)活性（P＜0.001），且與劑量呈正相關(guān)，其中化合物9 的細(xì)胞保護(hù)活性較好?；衔? 高劑量組具有一定的細(xì)胞保護(hù)活性（P＜0.05），而分離得到的新化合物沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞保護(hù)活性。

表2 化合物1、6、9對(duì)PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率的影響（±s,n=6）

表2 化合物1、6、9對(duì)PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率的影響（±s,n=6）

注：與對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

4 小結(jié)

斷血流是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，用藥歷史悠久，具有收斂止血的功效。斷血流片、斷血流膠囊和斷血流顆粒用于崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血和創(chuàng)傷出血。研究發(fā)現(xiàn)皂苷是其止血主要活性成分[17]，酚酸類成分具有抗心肌缺血再灌注損傷和輔助治療腫瘤的作用[18]。為進(jìn)一步開發(fā)斷血流提供依據(jù)，本研究對(duì)風(fēng)輪菜70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位進(jìn)行化學(xué)成分和藥理作用研究，從風(fēng)輪菜中分離鑒定出9 個(gè)化合物，其中1 個(gè)新化合物，并通過實(shí)驗(yàn)圓二色譜與計(jì)算圓二色譜確定和推測(cè)了新化合物4號(hào)位和9號(hào)位的絕對(duì)構(gòu)型。以PA處理HepG2細(xì)胞損傷為模型，對(duì)化合物1 及其異構(gòu)體化合物6 和9 進(jìn)行了細(xì)胞保護(hù)活性研究，化合物9的活性較好，推測(cè)9號(hào)位的構(gòu)型影響其活性。本研究為風(fēng)輪菜的后續(xù)研究及相關(guān)新藥研發(fā)提供了依據(jù)。