周海琴，錢潤，李松，陳盛君，胡劍虹，海豐，張開雪，查同樂

江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 214434

葶藶子為十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.或獨行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟種子，前者習(xí)稱“南葶藶子”，后者習(xí)稱“北葶藶子”[1]。南葶藶子主產(chǎn)于山東、河南、江蘇、安徽、浙江等地，為目前市場主流品種；北葶藶子主產(chǎn)于河北、遼寧、內(nèi)蒙古。葶藶子入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名“亭歷”，列為下品[2]。經(jīng)考證，古代最早以十字花科獨行菜L.apetalumWilld.為葶藶子的基原植物[3]，即為苦葶藶子；后葶藶子又有了甜、苦之分，甜葶藶子基原植物應(yīng)為十字花科播娘蒿D.sophia（L.）Webb.ex Prantl.[4]，也有將菥蓂子、薺菜子等作甜葶藶子使用的記載?！稖罕静荨吩疲骸翱嗵鸲叮髦尾煌?。仲景瀉肺湯用苦，余方或有用甜者，或有不言甜苦者。大抵苦則下泄，甜則少緩，量病人虛實用之，不可不審”[5]?？梢娍?、甜兩種葶藶子在古代均可入藥，只是功效略異。現(xiàn)代研究證明南、北葶藶子在化學(xué)成分、藥理作用等方面有所不同，因此在臨床應(yīng)用上應(yīng)區(qū)別使用[6]。由于各地用藥習(xí)慣不同，以及同科屬植物種子形態(tài)相似而導(dǎo)致誤用或混用，造成葶藶子在全國的商品品種比較混亂，影響臨床療效[7]。

葶藶子及其混用品大多外形細小、形態(tài)類似，肉眼不易辨別，組織切片也有困難。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了南葶藶子、北葶藶子及其摻偽品菥蓂子、薺菜子的鑒別方法，為藥材生產(chǎn)、采購、臨床使用及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 樣品

南葶藶子購于山東、山西、河南、安徽等地，經(jīng)鑒定為十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.的種子。北葶藶子采自河北省，經(jīng)鑒定為獨行菜Lepidium apetalumWilld.的干燥成熟種子。薺菜子采自安徽省、江蘇省，經(jīng)鑒定為十字花科薺Capsella bursa-pastoris（L.）Medic.的干燥成熟種子。菥蓂子采自廣西、江西、安徽，經(jīng)鑒定為十字花科菥蓂Thlaspi arvenseL.的干燥成熟種子。上述樣品均由江陰天江藥業(yè)有限公司唐波高級工程師鑒定，具體樣品信息見表1。

表1 南、北葶藶子及其混偽品藥材樣品信息

1.2 試藥

對照品槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（批號：111854-201203，純度：91.7%）、異槲皮苷（批號：111809-201804，純度：92.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芥子堿（批號：5389，純度99.9%）購自上海詩丹德生物科技有限公司；異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（批號：PS010548，純度：97.3%）購自成都普思生物科技有限公司；南葶藶子對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121220-201403）；色譜純乙腈（Thermo Fisher 公司）；色譜純磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

ACQUIYT-UPLC-H-Class 型超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 公司）；1290 Infinity 型超高效液相色譜儀、G6530 Accurate-Mass Q-TOF 型質(zhì)譜聯(lián)用儀均購于Agilent 公司；XP6 型百萬分之一天平、ME204E/02型萬分之一電子分析天平均購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-250E 型超聲清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（Millipore 公司）；TGL-16C 型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 南葶藶子藥材特征圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為乙腈（A）-0.3%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，7%～10%A；4～11 min，10%～18%A；11～13 min，18%～23%A；13～18 min，23%～28%A；18～20 min，28%～45%A），流速為0.3 mL·min-1，柱溫為35 ℃，檢測波長為254 nm。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 參照物溶液的制備 取南葶藶子對照藥材0.5 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，加熱回流60 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品適量，精密稱定，加30%甲醇配制成質(zhì)量濃度為21.641 μg·mL-1的對照品溶液。再取對照品芥子堿、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷適量，精密稱定，分別加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為51.349、50.761、61.727 μg· mL-1的混合對照品參照物溶液。

2.1.4 共有峰的確認 按上述方法測定19 批南葶藶子藥材的UPLC 圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）對南葶藶子色譜圖進行結(jié)果分析，以編號M1 樣品的特征圖譜為參照，進行多點校正和匹配，19 批南葶藶子藥材特征圖譜共標識出12個共有峰（圖1），以平均數(shù)法生成南葶藶子藥材對照特征圖譜（圖2），經(jīng)質(zhì)譜指認和對照品比對，確認2號峰為芥子堿、3號峰為槲皮素-3-Oβ-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、11 號峰為異槲皮苷、12 號峰為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（圖3）。

圖1 19批南葶藶子藥材UPLC特征圖譜疊加圖

圖2 南葶藶子藥材對照特征圖譜

圖3 南葶藶子供試品溶液（M7）與對照品溶液的UPLC圖

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 精密度試驗 精密稱定樣品（M7），按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，每次1 μL，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷所對應(yīng)的峰3 為參照峰S1，計算峰1～峰8的相對保留時間和相對峰面積；以異槲皮苷所對應(yīng)的峰11為參照峰S2，計算峰9～峰12 的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.06%～0.56%，共有峰相對峰面積的RSD 為0.42%～1.80%，各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.5.2 重復(fù)性試驗 精密稱定樣品（M7），按2.1.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣1 μL，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷所對應(yīng)的峰3 為參照峰S1，計算峰1～峰8 的相對保留時間和相對峰面積；以異槲皮苷所對應(yīng)的峰11 為參照峰S2，計算峰9～峰12 的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD 為0.04%～0.64%，共有峰相對峰面積的RSD 為0.77%～2.28%，各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱定樣品（M7），按2.1.2項下方法制備供試品溶液，每隔4 h進樣1次，每次進樣1 μL，共測定24 h，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷所對應(yīng)的峰3 為參照峰S1，計算峰1～峰8 的相對保留時間和相對峰面積；以異槲皮苷所對應(yīng)的峰11為參照峰S2，計算峰9～峰12 的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～1.26%，共有峰相對峰面積的RSD為0.77%～2.37%，各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD 均小于3%，表明24 h 內(nèi)樣品的穩(wěn)定性較好。

2.1.5.4 中間精密度試驗 精密稱定樣品（M7），分別由2 個實驗員按2.1.2 項下方法各制備3 份供試品溶液，分別于不同時間、在不同儀器上（Waters UPLC 和Agilent 1290）分別進樣1 μL，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷所對應(yīng)的峰3為參照峰S1，計算峰1～峰8 的相對保留時間和相對峰面積；以異槲皮苷所對應(yīng)的峰10為參照峰S2，計算峰9～峰12的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明中間精密度良好。

2.1.6 特征圖譜建立 取19 批南葶藶子樣品，按2.1.2 項下方法分別制備供試品溶液，分別按2.1.1項下色譜條件進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）進行結(jié)果分析，選擇峰形和分離度較好、純度較高的峰，確定12 個共有峰（圖1），并生成南葶藶子藥材對照特征圖譜（圖2），以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷所對應(yīng)的峰3 為參照峰S1，以異槲皮苷所對應(yīng)的峰11為參照峰S2。通過質(zhì)譜指認及對照品色譜峰保留時間比對，共指認4個特征峰，峰2為芥子堿、峰3 為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、峰11為異槲皮苷、峰12為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（圖3）。計算19批南葶藶子特征圖譜相對保留時間及相對峰面積。19 批樣品中特征峰的保留時間比較穩(wěn)定，RSD 均小于1%（表2）。峰面積比值浮動范圍比較大，RSD 為7.44%～65.91%（表3），表明不同產(chǎn)地南葶藶子質(zhì)量有一定差異。

表2 19批南葶藶子樣品中特征峰的相對保留時間

表3 19批南葶藶子樣品中特征峰的相對峰面積

2.2 葶藶子UPLC特征圖譜的應(yīng)用

將南葶藶子、北葶藶子及菥蓂子、薺菜子藥材特征圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版）分別生成對照特征圖譜（圖4～圖6），再以南葶藶子對照圖譜為對照，分別將其與北葶藶子、菥蓂子、薺菜子對照特征圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）進行對比分析。

圖4 南葶藶子與北葶藶子藥材特征圖譜比較

2.2.1 南葶藶子與北葶藶子鑒別研究 南葶藶子與北葶藶子特征圖譜對比結(jié)果表明，兩種不同基原葶藶子藥材的對照特征圖譜具有較明顯的區(qū)別（圖4），主要差別在峰3 及峰13，經(jīng)對照品指認，峰3 為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷。經(jīng)質(zhì)譜指認，峰13 為槲皮素-3-O-β-D-[6-O-芥子?；?2-O-β-D-吡喃葡萄糖基]-葡萄糖苷。實驗結(jié)果與文獻報道一致，即峰3為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，僅存在于南葶藶子中[8]。峰13 為槲皮素-3-O-β-D-[6-O-芥子?；?2-O-β-D-吡喃葡萄糖基]-葡萄糖苷主要存在于北葶藶子中[9]。

2.2.2 南葶藶子與菥蓂子鑒別研究 南葶藶子藥材與菥蓂子藥材的對照特征圖譜有較明顯的區(qū)別（圖5），主要差別在峰2、峰3、峰13、峰14 及峰15，峰2、峰3 主要存在于南葶藶子中，峰13、峰14、峰15 主要存在于菥蓂子中。經(jīng)對照品指認峰2為芥子堿、峰3 為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，經(jīng)質(zhì)譜指認峰13為異牡荊苷、峰15為當(dāng)藥黃素。

圖5 南葶藶子與菥蓂子藥材特征圖譜比較

峰3（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷）在偽品菥蓂子中幾乎檢測不到，在南葶藶子中很高，因此，除特征圖譜外，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷含量亦可作為南葶藶子與偽品菥蓂子的區(qū)分點。

2.2.3 南葶藶子與薺菜子鑒別研究 南葶藶子與薺菜子藥材的對照特征圖譜對比見圖6，主要差別在峰6 與峰13，峰6 主要存在與南葶藶子中，峰13 主要存在于薺菜子中。經(jīng)質(zhì)譜指認峰6 為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，峰13 有待進一步研究。

圖6 南葶藶子與薺菜子藥材特征圖譜比較

上述建立的特征圖譜方法不僅能夠有效鑒別葶藶子藥材的真?zhèn)?，同時可以準確鑒定到南葶藶子、北葶藶子基原。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察和色譜條件優(yōu)化

在供試品溶液的制備條件探索中，比較了不同提取溶劑（30%、50%、70%甲醇、純甲醇和乙醇）對南葶藶子藥材特征圖譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70%甲醇提取的色譜峰較多，故選擇70%甲醇加熱回流1 h 為最優(yōu)提取方法。通過考察乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.3%磷酸水溶液為流動相體系進行梯度洗脫時，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.3%磷酸水溶液作為流動相，各色譜峰分離度較好、峰形較佳、基線平穩(wěn)；通過在210～400 nm 全波長掃描，比較各波長色譜圖，發(fā)現(xiàn)在254 nm 處色譜峰響應(yīng)值最佳，故選擇254 nm 作為南葶藶子藥材特征圖譜的檢測波長。

3.2 南葶藶子共有峰確定

本研究建立了南葶藶子藥材UPLC 特征圖譜方法，確定了12 個共有峰，能較好地代表南葶藶子整體質(zhì)量；通過對照品指認，確定了4 個化合物，分別是芥子堿、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、異槲皮苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，并對6個化合物進行了質(zhì)譜指認。

3.3 葶藶子多基原及混偽品鑒別

由于南葶藶子、北葶藶子及其混淆品菥蓂子、薺菜子形態(tài)細小，肉眼不易觀察，曹海燕等[7]采用微性狀對葶藶子及其混淆品進行區(qū)分，但此方法對實驗人員的經(jīng)驗要求比較高，難以普及和推廣，存在分辨率較低的缺點，尤其對多基原藥材、品種混亂藥材的鑒定較為困難。本研究建立南葶藶子藥材的UPLC 特征圖譜，并對南葶藶子、北葶藶子及其混偽品進行鑒別研究，研究顯示，兩種不同基原葶藶子及其混偽品菥蓂子、薺菜子藥材的對照特征圖譜具有較明顯的區(qū)別，主要區(qū)別為：1）若被檢測的樣品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品相應(yīng)保留時間處無色譜峰或色譜峰峰面積低于上述對照品的峰面積，在芥子堿對照品相應(yīng)保留時間處無色譜峰或色譜峰峰面積低于上述對照品的峰面積，則被檢測樣品為菥蓂子；2）若被檢測的樣品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品相應(yīng)保留時間處無色譜峰或色譜峰峰面積低于上述對照品的峰面積，在芥子堿對照品相應(yīng)保留時間處存在色譜峰，則被檢測樣品為北葶藶子；3）若被檢測的樣品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品相應(yīng)保留時間處存在色譜峰，在異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品相應(yīng)保留時間處無色譜峰，則被檢測樣品為薺菜子；4）若被檢測的樣品在槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品相應(yīng)保留時間處存在色譜峰，在異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基-7-O-β-D-龍膽雙糖苷對照品相應(yīng)保留時間處存在色譜峰，則被檢測樣品為南葶藶子。

本研究采用UPLC 特征圖譜比較南葶藶子、北葶藶子及其混偽品菥蓂子、薺菜子的特征峰的差異，不僅能對多基原進行快速準確鑒別，而且能夠鑒別市場易混淆品。所采用的色譜條件重復(fù)性好、易于控制，結(jié)果直觀可靠，方法簡便易行、快速有效，可為南葶藶子、北葶藶子及其混偽品菥蓂子、薺菜子的鑒別提供依據(jù)。