黃志琴,張財(cái)文,陳 澄,吳阿芳,江清悅,龐大鵬,王陳成,張文文,張保衛(wèi)*

(1.安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥 230601;2.生態(tài)環(huán)境部 南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 210042)

最新文獻(xiàn)顯示,蛙屬(Rana)在中國有27現(xiàn)有種:黑龍江林蛙(R.amurensis)、田野蛙(R.arvalis)、中亞林蛙(R.asiatica)、昭覺林蛙(R.chaochiaoensis)、中國林蛙(R.chensinensis)、峰斑林蛙(R.chevronta)、韓國林蛙(R.coreana)、徂徠林蛙、大別山林蛙、東北林蛙(R.dybowskii)、寒露林蛙(R.hanluica)、桓仁林蛙(R.huanrenensis)、借母溪林蛙(R.jiemuxiensis)、九嶺山林蛙(R.jiulingensis)、越南趾溝蛙(R.johnsi)、高原林蛙(R.kukunoris)、長肢林蛙(R.longicrus)、欒川林蛙(R.luanchuanensis)、貓兒山林蛙(R.maoershanensis)、峨眉林蛙(R.omeimontis)、桑植蛙(R.sangzhiensis)、棱德氏蛙(R.sauteri)、脛腺蛙(R.shuchinae)、威寧蛙(R.weiningensis)、武夷林蛙(R.wuyiensis)、明全蛙(R.zhengi)和鎮(zhèn)海林蛙[1-5].該屬物種安徽省有3種——大別山林蛙、中國林蛙和鎮(zhèn)海林蛙,其中大別山林蛙、中國林蛙主要分布于大別山區(qū),鎮(zhèn)海林蛙分布于皖南山區(qū)[3,6-8].

2020年5月至2021年11月,筆者在安徽省大別山區(qū)和江淮丘陵區(qū)進(jìn)行調(diào)查時(shí),先后采集到蛙屬物種標(biāo)本83號(hào).經(jīng)初步鑒定,區(qū)分出大別山林蛙43號(hào)、中國林蛙29號(hào).另有11號(hào)標(biāo)本與大別山林蛙、中國林蛙在形態(tài)上存在一定差異.后經(jīng)遺傳學(xué)及系統(tǒng)發(fā)生分析,發(fā)現(xiàn)上述11號(hào)標(biāo)本應(yīng)為徂徠林蛙.鑒于此前安徽省并無徂徠林蛙報(bào)道,特此撰文予以報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

2021年4月至11月,先后在安徽省合肥市肥東縣、廬江縣,六安市霍山縣、金寨縣等地采集不能定種的林蛙屬標(biāo)本11號(hào)(標(biāo)本編號(hào)AHU2021TY001～AHU2021TY011,具體信息見表1).標(biāo)本存放于安徽大學(xué)生物標(biāo)本館內(nèi),使用75%乙醇保存,并取肝組織用95%乙醇固定后-20℃保存.

表1 研究中標(biāo)本采集信息一覽表

1.2 形態(tài)學(xué)測(cè)量

參考《中國動(dòng)物志·兩棲綱(中卷)》對(duì)蛙類形態(tài)的常用量衡度指標(biāo)[9],選擇16個(gè)形態(tài)量度,包括:頭體長(snout-vent length, 簡(jiǎn)稱SVL)、頭長(head length, 簡(jiǎn)稱HL)、頭寬(head width, 簡(jiǎn)稱HW)、吻長(snout length, 簡(jiǎn)稱SL)、眼徑(horizontal eye diameter, 簡(jiǎn)稱ED)、上眼瞼最大寬度(upper eyelid width, 簡(jiǎn)稱UEW)、鼻間距(internarial distance, 簡(jiǎn)稱IND)、眼間距(interorbital distance, 簡(jiǎn)稱IOD)、前臂及手長(length of lower arm and hand, 簡(jiǎn)稱LAHL)、前臂直徑(diameter of lower arm, 簡(jiǎn)稱LAW)、手長(hand length, 簡(jiǎn)稱HAL)、后肢全長(hind limb length, 簡(jiǎn)稱HLL)、脛長(tibia length, 簡(jiǎn)稱TL)、脛部最粗直徑(tibia width, 簡(jiǎn)稱TW)、跗足長(length of tarsus and foot, 簡(jiǎn)稱TFL)和足長(foot length, 簡(jiǎn)稱FL).使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(型號(hào)MNT-150T,上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司)測(cè)量標(biāo)本,測(cè)量結(jié)果精確到 0.1 mm.

1.3 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

采用常規(guī)的酚/氯仿法提取基因組DNA[10].使用細(xì)胞色素b(Cytochromeb, 簡(jiǎn)稱Cytb)基因通用引物L(fēng)14850(5′-TCT CAT CCT GAT GAA ACT TTG GCT C-3′)和H15502(5′-GGATTAGCTGGTGTGAAATTGTCTGGG-3′)來進(jìn)行PCR擴(kuò)增[11],產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,提交通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司,經(jīng)純化后使用ABI3730型遺傳分析儀測(cè)序.

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用SeqMan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校對(duì)檢查,除去堿基誤判等錯(cuò)誤.所有測(cè)序序列上傳到GenBank(登錄號(hào)信息見表2).在 NCBI 數(shù)據(jù)集中對(duì)研究所得Cytb序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì).在GenBank中下載蛙屬23個(gè)近緣種的同源區(qū)序列,并以威寧蛙和黑斑側(cè)褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)作為外群[12].結(jié)合筆者所測(cè)序列,在MEGA10.0軟件中進(jìn)行排列比對(duì),基于Kimura2-Parameter法計(jì)算各序列間的遺傳距離(P-distance).

表2 研究中所涉及物種及相關(guān)信息

研究中使用貝葉斯(BI)法、最大似然(ML)法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.構(gòu)建BI樹時(shí),首先以Akaike Information Criterion(AIC)準(zhǔn)則在MrModeltest 2.0程序[13]中尋找最適模型,然后在MrBayes3.2.2[14]中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.系統(tǒng)發(fā)育分析中,設(shè)置4條鏈進(jìn)行107獨(dú)立運(yùn)行;前25%被舍棄,每隔100代進(jìn)行1次采樣,使用貝葉斯后驗(yàn)概率(BPP)來檢測(cè)節(jié)點(diǎn)的支持率,結(jié)果在Tracer1.6[15]中查看.ML樹使用IQ-TREE[16]構(gòu)建,運(yùn)行1 000次 Bootstrap 重復(fù)抽樣以檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)置信度,使用自舉支持值(BSP)檢驗(yàn)節(jié)點(diǎn)處的支持.生成的樹型文件采用Figtree v1.4.2[17]軟件打開,并進(jìn)行相應(yīng)的編輯.

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)描述

研究中測(cè)量了5個(gè)成體(雄2,雌3)的16個(gè)形態(tài)量度,其中雄性頭體長37.3～43.1 mm,頭長15.2～18.9 mm,頭寬10.7～13.2 mm;雌性頭體長44.2～55.1 mm,頭長17.5～23.9 mm,頭寬15.9～17.1 mm,雄性和雌性的頭長均大于頭寬,其他形態(tài)量度信息見表3.整體來看,這些個(gè)體的吻端略鈍圓,突出于下唇;吻棱清晰;瞳孔橫橢圓形;鼓膜圓形,直徑約為眼徑的2/3;犁骨齒列呈兩短斜行;指長順序?yàn)棰?Ⅱ≈Ⅳ>Ⅰ;關(guān)節(jié)下瘤發(fā)達(dá),內(nèi)掌突較大,呈卵圓形;指、趾端鈍而無溝;趾長順序?yàn)棰?Ⅲ>Ⅴ>Ⅱ>Ⅰ;趾間蹼缺刻深,其凹陷位于第四趾第二關(guān)節(jié)處;前臂及手長不到體長之半;后肢較長;背側(cè)褶細(xì)窄,在顳部上方略向外側(cè)彎曲.皮膚較光滑,背部及體側(cè)有少數(shù)小圓疣;體腹面光滑;體背面多為紅褐色或棕灰色而無深色斑,顳部有黑色三角斑,眼間無深色橫斑;腹面乳黃色(圖1).雄性無聲囊,第一指具有大的婚刺.

生態(tài)照(a)來自合肥市肥東縣石塘鎮(zhèn)浮槎山的雌體,標(biāo)本照(背面(b)、標(biāo)本側(cè)面(c)、標(biāo)本腹面(d)、手背面(e)、手腹面(f)、足背面(e)、足腹面(h))來自六安市霍山縣太陽鄉(xiāng)的雌體;拍攝者:張財(cái)文.圖1 筆者所采集的徂徠林蛙標(biāo)本

表3 筆者所采集的標(biāo)本與大別山林蛙、中國林蛙的量度比較 mm

上述形態(tài)特征與《中國兩棲動(dòng)物及其分布彩色圖鑒(2012)》[18]中對(duì)徂徠林蛙的形態(tài)描述一致,初步確定筆者所采集的標(biāo)本為徂徠林蛙.

2.2 形態(tài)比較

在大別山區(qū)還分布有另外2種林蛙屬物種:大別山林蛙和中國林蛙(圖2).這3種林蛙外形均較為接近,如眼后和顳前有三角形灰黑斑、腿部有黑灰色橫向線條等.經(jīng)仔細(xì)鑒別,這3種林蛙在頭體長、指長順序、背側(cè)褶形狀以及背部疣粒數(shù)量上存在差異,簡(jiǎn)單總結(jié)列于表4.

大別山林蛙(左圖)拍攝于安徽省六安市舒城縣萬佛山,中國林蛙(右圖)拍攝于安徽省六安市金寨縣花石鄉(xiāng);拍攝者:張財(cái)文.圖2 大別山林蛙(左)和中國林蛙(右)的生態(tài)

表4 3種林蛙的部分形態(tài)特征比較

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

研究中使用了林蛙屬23個(gè)物種同源區(qū)序列,以黑斑側(cè)褶蛙和威寧蛙作為外群,進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析(BI,ML).結(jié)果顯示,BI,ML系統(tǒng)發(fā)生樹具有相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),僅在一些分支的支持率有所差異,如圖3所示.同時(shí),該研究結(jié)果與此前對(duì)林蛙的系統(tǒng)學(xué)研究的系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果相似[19].在系統(tǒng)發(fā)生樹中,筆者所采集的標(biāo)本與徂徠林蛙聚成單獨(dú)一支,并獲得了高后驗(yàn)概率的支持(圖3),它們?cè)谙到y(tǒng)樹中與大別山林蛙、中國林蛙的距離甚遠(yuǎn).系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果和遺傳距離分析結(jié)果一致:新標(biāo)本與徂徠林蛙的遺傳距離僅為0.8%,而與大別山林蛙、中國林蛙的遺傳距離分別為9.5%,18.5%(表5).綜上,基于系統(tǒng)發(fā)育和遺傳距離分析的結(jié)果,可以確定本次采集的標(biāo)本為徂徠林蛙.

圖中節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表后驗(yàn)概率和自舉支持值(>50),標(biāo)尺代表分支長度.圖3 基于線粒體Cytb序列構(gòu)建的蛙屬23物種的系統(tǒng)發(fā)生樹(BI,ML)

表5 基于線粒體Cytb基因序列的24個(gè)蛙類物種間的遺傳距離(P-distance)

3 討 論

徂徠林蛙模式產(chǎn)地為山東省泰安市徂徠山[20],目前在貴州、重慶、湖北、山東、河南、湖南、廣西已有分布報(bào)道.筆者在調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)徂徠林蛙也分布于江淮丘陵區(qū)和大別山區(qū)低海拔林區(qū),提示該區(qū)域的氣候、植被、濕度條件等也適宜徂徠林蛙棲息和繁殖.與徂徠林蛙模式標(biāo)本相比,筆者所采集到的個(gè)體體型相對(duì)較小,如雄性頭體長(37.3～43.1 mm)和雌性頭體長(44.2～55.1 mm)都明顯偏小于模式標(biāo)本(♂48.5～59.1 mm,♀62 mm)[21].

基于筆者所在研究組以往的調(diào)查記錄,發(fā)現(xiàn)徂徠林蛙與大別山林蛙的分布區(qū)有所重疊.大別山林蛙的分布區(qū)大約在海拔400～1 150 m之間,徂徠林蛙的分布區(qū)約在170～460 m,其分布區(qū)相對(duì)較低.在大別山區(qū),中國林蛙主要分布于高海拔地區(qū)(>600 m),與徂徠林蛙的分布區(qū)并不重疊.

蛙屬物種的形態(tài)均較相似,增加了野外工作的物種鑒定難度.經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),徂徠林蛙、大別山林蛙和中國林蛙在指長、背側(cè)褶以及背部疣粒上的差異較為明顯,在野外可以通過這些形態(tài)特征對(duì)它們進(jìn)行初步鑒定.

筆者通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)學(xué)手段證實(shí)了徂徠林蛙在安徽省的分布(江淮丘陵區(qū)、大別山區(qū)),這一發(fā)現(xiàn)豐富了安徽省的生物多樣性,擴(kuò)大了它在中國的分布范圍,在動(dòng)物地理學(xué)中有重要意義.